酒精對(duì)小鼠睪丸內(nèi)源性細(xì)胞增殖及凋亡的影響

酒精對(duì)小鼠睪丸內(nèi)源性細(xì)胞增殖及凋亡的影響

在日常生活中，飲酒是一種非常常見(jiàn)的現(xiàn)象。長(zhǎng)期飲酒會(huì)導(dǎo)致各種疾病。文獻(xiàn)報(bào)道酒精對(duì)男性生殖器官的損傷是導(dǎo)致出生缺陷的重要原因之一。劉長(zhǎng)云等研究了白酒對(duì)大鼠睪丸的損傷作用,結(jié)果表明隨著飲酒量的加大和飲酒時(shí)間的延長(zhǎng),睪丸的相對(duì)重量降低,生精小管萎縮變細(xì),睪丸間質(zhì)增大,精子活力顯著降低,精子畸形率增高明顯,血清LH、FSH及睪酮均比正常水平低。酒精對(duì)睪丸組織中一氧化氮合酶(eNOS)、增殖細(xì)胞核抗原(prliferatingcellnuclearantigen,PCNA)的表達(dá)和細(xì)胞凋亡影響的研究,報(bào)道很少。本研究以22d齡小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,用5%、10%和15%酒精水溶液飼飲小鼠,觀察酒精對(duì)小鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)、eNOS和PCNA表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響。材料和方法1.調(diào)查組的確定選用21d齡昆明種雄性小白鼠34只(由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供),平均體重12g,隨機(jī)分成正常對(duì)照組(10只)、5%酒精實(shí)驗(yàn)組(8只)、10%酒精實(shí)驗(yàn)組(8只)、15%酒精實(shí)驗(yàn)組(8只)。從22d齡幼鼠開(kāi)始同時(shí)飼飲不同濃度的酒精水溶液,酒精由天津北方化學(xué)玻璃購(gòu)物中心出產(chǎn)(無(wú)水乙醇,分析純,含甲醇0.05%),用自來(lái)水配制而成,對(duì)照組飼飲自來(lái)水,每日更換新溶液,連續(xù)飼飲60d后處死。2.蛋白甘油經(jīng)皮片組動(dòng)物稱(chēng)重?cái)囝^處死后,剖取左側(cè)睪丸,固定于4%的多聚甲醛,常規(guī)脫水、透明、浸蠟及石蠟包埋,制成6μm厚的連續(xù)切片,切片裱于覆有蛋白甘油的載玻片上,切片經(jīng)二甲苯脫蠟后梯度酒精復(fù)水,蘇木精染色5min,經(jīng)1%鹽酸酒精分色,自來(lái)水充分沖洗藍(lán)化后,再用0.1%伊紅復(fù)染5min,最后經(jīng)梯度酒精脫水,二甲苯透明后封片。3.免疫組織化學(xué)取右側(cè)睪丸固定于4%的多聚甲醛溶液1h后,置入30%的蔗糖緩沖液4℃冰箱過(guò)夜,用ReichertHistoSTATD冰凍切片機(jī)制成6μm厚的連續(xù)切片,每隔2張取1張,裱于覆有明膠的載玻片上。冰凍切片以ABC法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,SP試劑盒由北京中山公司提供的美國(guó)Zymed公司產(chǎn)品。切片經(jīng)1%甲醇-過(guò)氧化氫處理30min,封閉血清于37℃處理30min,加入eNOS(1∶50Santacruz)抗體和PCNA抗體(1∶50Zymed)于4℃冰箱過(guò)夜,再加入生物素標(biāo)記的二抗,37℃處理30min,加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素孵育30min,經(jīng)DAB-H2O2顯色3～5min,經(jīng)PBS充分沖洗,eNOS切片經(jīng)蘇木素復(fù)染1～3min,流水充分沖洗后干燥、脫水、透明、中性樹(shù)膠封片,光鏡觀察。4.免疫、抗地高辛抗體tb和抗-4-dig-utpdab的制備用脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)凋亡細(xì)胞,原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司,過(guò)程按使用說(shuō)明書(shū)。石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟入水;新鮮配制的3%過(guò)氧化氫液室溫孵育15min;TBS1∶100新鮮稀釋蛋白酶K37℃消化15min;每片加標(biāo)記緩沖液(labelingbuffer,LB)20μl,室溫30min;再加TDT、DIG-UTP、LB的混合液,4℃冰箱過(guò)夜;每片加封閉液50μl,室溫30min;每片加生物素化抗地高辛抗體50μl,37℃反應(yīng)60min;TBS1∶100稀釋SABC加至切片,37℃45min;DAB顯色20min;蒸餾水沖洗,脫水、透明、封片。陰性對(duì)照,用0.01mol/LPBS代替TDT、DIG-d-UTP、LB混合液標(biāo)記液,其他步驟同上。5.精小管及精密度切片用病理圖像分析系統(tǒng)(北京航天航空大學(xué)設(shè)計(jì))采集圖像,每組隨機(jī)選取3張切片,每張切片檢查10個(gè)視野。利用電腦圖像分析系統(tǒng)的體視學(xué)功能測(cè)量生精小管的直徑;利用電腦圖像分析系統(tǒng)的組織化學(xué)分析功能統(tǒng)計(jì)eNOS陽(yáng)性細(xì)胞的面積密度、單位面積內(nèi)PCNA陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目及凋亡細(xì)胞數(shù)目。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用excel作圖表,statistica軟件進(jìn)行單因素方差分析及組間t檢驗(yàn),根據(jù)均值±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)繪制統(tǒng)計(jì)圖。結(jié)果1.各組生精管管路的變化正常組小鼠生精小管管腔明顯,生精細(xì)胞在管內(nèi)排列緊密有序,可見(jiàn)精子生成(圖1);5%酒精組與正常組無(wú)明顯差異;10%酒精組生精小管管徑變小,排列變得疏松,生精小管周?chē)g隙加寬(圖2);15%酒精組生精小管萎縮變細(xì),管徑明顯變小,生精小管周?chē)g隙進(jìn)一步加大,有些生精小管內(nèi)生精細(xì)胞排列變得疏松,生精細(xì)胞間出現(xiàn)空隙(圖3)。2.酒精濃度對(duì)睪丸精原細(xì)胞及pcna表達(dá)的影響eNOS免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)陽(yáng)性顆粒,呈淺黃色至棕黃色,大小均一,位于胞膜內(nèi)的胞漿中。正常組小鼠睪丸內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞及精子細(xì)胞呈明顯的eNOS陽(yáng)性反應(yīng),胞質(zhì)為黃色(圖4);隨著酒精濃度的增大,eNOS陽(yáng)性細(xì)胞顯色加深,15%酒精組睪丸內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞顯色為深棕色,數(shù)目明顯增多(圖5),但各組的精原細(xì)胞及精母細(xì)胞均呈陰性反應(yīng)。PCNA免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞,其陽(yáng)性反應(yīng)顆粒為淺棕色至深棕色,顆粒大小一致,位于胞核內(nèi)。正常組部分精原細(xì)胞呈陽(yáng)性表達(dá)(圖6);5%酒精組PCNA表達(dá)與正常組無(wú)明顯差異,陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目略有增加;10%酒精組PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目比5%酒精組略有增加;15%酒精組睪丸內(nèi)精原細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(圖7),陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯增多。3.組凋亡細(xì)胞表達(dá)情況正常組小鼠睪丸的生精小管內(nèi)精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)比較多見(jiàn)(圖8);5%酒精組凋亡細(xì)胞表達(dá)比正常組顯著增多(圖9);10%酒精組凋亡的生精細(xì)胞數(shù)目持續(xù)增加(圖10);15%酒精組睪丸內(nèi)陽(yáng)性表達(dá)的生精細(xì)胞顯著增多,凋亡細(xì)胞為強(qiáng)陽(yáng)性深染,生精小管內(nèi)可見(jiàn)陽(yáng)性的精原細(xì)胞與初級(jí)精母細(xì)胞(圖11)。4.酒精濃度對(duì)enos陽(yáng)性細(xì)胞面積密度和pcna免疫反應(yīng)的影響圖像分析及統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明:隨著酒精濃度的增大,小鼠睪丸內(nèi)生精小管的直徑呈減小趨勢(shì)(附表),10%酒精組生精小管直徑與5%酒精組差異極顯著(P<0.01),15%酒精組生精小管直徑與10%酒精組差異極顯著(P<0.01)。隨著酒精濃度的增大,eNOS陽(yáng)性細(xì)胞面積密度呈增大趨勢(shì)(附表),15%酒精組與其他組差異極顯著(P<0.01)。隨著酒精濃度的增大,單位面積內(nèi)PCNA免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目呈增大趨勢(shì)(附表),15%酒精組與其他組差異極顯著(P<0.01)。隨著酒精濃度的增大,單位面積內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)目呈增大趨勢(shì)(附表),15%酒精組與其他組差異極顯著(P<0.01)。小鼠睪丸中低度酒精的組織結(jié)構(gòu)本實(shí)驗(yàn)將小鼠分為正常對(duì)照組、5%酒精組、10%酒精組和15%酒精組4組,較系統(tǒng)地研究了低度酒精對(duì)小鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)、eNOS、PCNA表達(dá)和生精細(xì)胞凋亡的影響,現(xiàn)討論分析如下:1.酒精損傷作用通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察和統(tǒng)計(jì)分析,我們發(fā)現(xiàn)隨著酒精濃度的增大,生精小管周?chē)g隙加寬,睪丸生精小管直徑呈減小趨勢(shì),高濃度酒精可使生精小管內(nèi)生精細(xì)胞間出現(xiàn)空隙,表明酒精對(duì)生殖細(xì)胞有明顯的損傷作用,這與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果是一致的。許多研究證實(shí)隨著飲酒量增加及飲酒時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)造成生精小管萎縮,精子的活力降低,精子密度減少且精子的畸形率升高,同時(shí)血清性激素(LH,FSH,T)水平降低,提示酒精有抑制性激素分泌的作用,這可能是導(dǎo)致個(gè)體生殖能力下降甚至不育的重要原因。2.影響男性生殖能力的因素許多研究證實(shí)NO能調(diào)節(jié)睪丸的血液供應(yīng)、激素的合理分泌、精子的正常發(fā)生及獲能,并影響精子的質(zhì)量,從而影響雄性的生殖能力。在實(shí)驗(yàn)觀察中我們發(fā)現(xiàn),酒精影響小鼠睪丸陽(yáng)性eNOS的表達(dá),并隨著酒精濃度的增大,睪丸內(nèi)eNOS表達(dá)增多,促使睪丸產(chǎn)生的NO增多,進(jìn)而可能會(huì)抑制激素的分泌及精子的發(fā)育,但有關(guān)酒精與NO之間的關(guān)系,目前尚未見(jiàn)報(bào)道,酒精對(duì)精子發(fā)生和雄性激素分泌的作用機(jī)理尚需進(jìn)行深入地探討。3.酒精影響睪丸生精細(xì)胞增殖和凋亡的作用雄性生殖細(xì)胞在發(fā)育過(guò)程中不斷分化、增殖的同時(shí)伴有生精細(xì)胞的凋亡產(chǎn)生,許多生殖疾病過(guò)程都與生精細(xì)胞的凋亡變化有關(guān)。正常生理狀態(tài)下的生精細(xì)胞凋亡是機(jī)體清除增生過(guò)程中染色體復(fù)制發(fā)生致命錯(cuò)誤或惡變的細(xì)胞,使生精細(xì)胞數(shù)量保持相對(duì)穩(wěn)定。Ewald等研究發(fā)現(xiàn),酒精的直接作用導(dǎo)致胸腺萎縮,并且0.2%到0.8%酒精組胸腺細(xì)胞凋亡明顯增加。酒精對(duì)生精細(xì)胞凋亡的影響文獻(xiàn)報(bào)道很少,我們研究發(fā)現(xiàn),酒精有影響睪丸生精細(xì)胞增殖與凋亡的作用,并隨著酒精濃度的增大,增殖與凋亡細(xì)胞顯著增多。周宏等認(rèn)為,精子發(fā)生過(guò)程中對(duì)生殖細(xì)胞增殖-凋亡平衡的調(diào)節(jié)具有相關(guān)的調(diào)控因素。Blanco的有關(guān)研究還證明,生精細(xì)胞成熟過(guò)程中的凋亡變化與機(jī)體內(nèi)分泌變化有關(guān)。值得注意的是細(xì)胞增殖的數(shù)目在15%酒精組出現(xiàn)顯著增多,而凋亡細(xì)胞的數(shù)目在5%酒精組開(kāi)始顯著增多,顯然低度酒精促進(jìn)小鼠生精細(xì)胞的增殖與凋亡。10%酒精組與15%酒精組凋亡細(xì)胞數(shù)目持續(xù)顯著增多,表明酒精的濃度增大可能導(dǎo)致產(chǎn)生的脂質(zhì)過(guò)氧化物和自由基增多,促使細(xì)胞凋亡加快,對(duì)雄性的生殖能力造成有害影響。有研究認(rèn)為,酒精的過(guò)氧化反應(yīng)使強(qiáng)氧化劑和抗氧化劑之間的平衡作用失調(diào)?？寡趸饔冒?xì)胞內(nèi)與細(xì)胞外的多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的保護(hù)作用