米曲霉滬餾302固態(tài)發(fā)酵產白腐菌的研究

米曲霉滬餾302固態(tài)發(fā)酵產白腐菌的研究

美沙梅是中國傳統(tǒng)的加工食品品種，如酒精食品和餐飲。人們知道美國的米曲霉菌生產了許多酶系統(tǒng)和復雜的酶系。日本的研究人員發(fā)現(xiàn)了美沙霉組。然而，關于這類植物在中國的酶系統(tǒng)發(fā)育過程中受到的影響及其酶系統(tǒng)的影響尚不清楚。另一方面，在工業(yè)生產過程中，美國的霉菌生產過程無法得到很好的控制。另一方面，這類傳統(tǒng)植物在工業(yè)應用中的地位還沒有完全擴大。本實驗對米曲霉（Aspergillusoryzae)M-9的3種主要酶在固體發(fā)酵過程中所受的影響及活性的變化進行了研究，探討利用木質纖維原料低成本生產酶系豐富的工業(yè)酶制劑的可行性，同時為深入了解這些酶在食品釀造過程中的作用提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1米曲霉的分離米曲霉（Aspergillusoryzae)M-9，運用透明圈法從王致和集團公司提供的米曲霉滬釀3.042的曲精中篩選分離而來，以PDA斜面培養(yǎng)基30℃～32℃恒溫培養(yǎng)并保存。1.2培養(yǎng)基和膏樺木木聚糖、低黏度羧甲基纖維素：購于Sigma公司；酪蛋白胨、酵母浸膏、牛肉膏：購自北京雙旋培養(yǎng)基制造廠；蔗渣、玉米芯及麩皮：購自北京郊區(qū)；其他試劑均為國產分析純。1.3培養(yǎng)基培養(yǎng)方法制備孢子懸液：將10mL無菌水加入到在30℃條件下培養(yǎng)了3d～4d的PDA斜面培養(yǎng)基，用滅菌的接種環(huán)在培養(yǎng)基表面輕輕刮動，制成孢子懸液，混勻后用血球計數(shù)板計孢子數(shù)，調整孢子懸液的孢子數(shù)為106個/mL。營養(yǎng)鹽溶液：KH2PO41g/L、NaCl2.5g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L、（NH4)2SO41g/L、CaCl20.5g/L，調節(jié)pH值至7.0。發(fā)酵培養(yǎng)：在250mL三角瓶中加入5g風干后過篩的木質纖維原料和15mL營養(yǎng)鹽溶液，拌勻，121℃滅菌30min，冷卻后按每瓶固體培養(yǎng)基1mL孢子懸液（106個/mL）接種，攪拌均勻后，于32℃培養(yǎng)72h。粗酶液的制備：每克固態(tài)培養(yǎng)物加入5.0mL、pH7.2的磷酸緩沖溶液，室溫下浸提1h,10000×g離心10min，上清液即為粗酶液。1.4酪氨酸的測定蛋白酶活性的測定參照FERREIAG等的方法：1.0mL適當稀釋的酶溶液，加入到1.0mL用0.1mol/L、pH7.0檸檬酸鈉緩沖液配置的1%酪蛋白底物溶液中，40℃反應10min，用0.5mL0.3mol/L三氯醋酸溶液中止反應。反應液混勻后8000×g離心10min，釋放的酪氨酸按照LOWRYOH方法等的測定，同時以酪氨酸作為標準繪制標準曲線。蛋白酶活性單位（U）的定義為：在上述條件下，每分鐘水解酪蛋白產生1μmol酪氨酸所需的酶量。木聚糖酶活性的測定參照DNS法：0.1mL適當稀釋的酶溶液，加入到0.9mL用0.05mol/L、pH6.5檸檬酸鈉緩沖液配制的1%樺木木聚糖底物溶液中，50℃反應5min，用DNS法測定釋放的還原糖量，同時以木糖作標準。木聚糖酶活力單位（U）的定義為：在上述條件下，每分鐘水解木聚糖生成1μmol木糖所需的酶量。纖維素酶活性：方法同上，僅將底物和標準物分別換成低粘度羧甲基纖維素和葡萄糖。纖維素酶活性單位（U）的定義為：在上述條件下，每分鐘水解低黏度羧甲基纖維素生成1μmol葡萄糖所需的酶量。2結果與討論2.1實驗結果分析采用蔗渣、玉米芯、作麩皮作為單一碳源進行固體發(fā)酵實驗，結果見表1。在所選碳源中，麩皮作為碳源米曲霉發(fā)酵產生的蛋白酶及木聚糖酶量均相對較高，玉米芯作為碳源時產酶量稍低，而蔗渣作為碳源時產酶效果最差。2.2發(fā)酵試驗結果微生物酶的合成同時受酶誘導物和酶蛋白質前體的調控，酶誘導物一般為可利用的碳源，而酶蛋白質的前體主要來自于氮源，因此氮源的類型和性質同樣會影響酶的合成和分泌。選擇不同氮源作為單一氮源進行發(fā)酵試驗，來考察對米曲霉產酶的影響。結果見表2。從表2可看出，氮源對米曲霉蛋白酶生產的影響很大。在實驗選用的8種有機和無機氮源中，以蛋白胨作為單一氮源時米曲霉所產蛋白酶活性最高；酪蛋白胨和酵母浸膏次之，米曲霉所產蛋白酶分別是蛋白胨作為單一氮源時活性的94%和91%；當分別以硫酸銨和氯化銨為單一氮源時，米曲霉所產蛋白酶活性僅為最高酶活性的32%和21%。實驗發(fā)現(xiàn)米曲霉所產的木聚糖酶和纖維素酶受氮源影響的程度與其蛋白酶并不同步：尿素是其產生最高木聚糖酶活性及纖維素酶活性的一種氮源，而在此條件下米曲霉僅能產生相對最高活性71%的蛋白酶。2.3初始ph值對米曲霉蛋白酶表達的影響微生物在生長繁殖和代謝過程中，由于營養(yǎng)物質被分解利用和代謝產物的形成與積累，導致培養(yǎng)基pH值發(fā)生變化，而培養(yǎng)基初始pH值不僅影響微生物的生長繁殖，且對其產酶情況有顯著的影響。在優(yōu)化碳氮源基礎上，調節(jié)培養(yǎng)基初始pH值為5.0～9.0來考察對米曲霉產酶的影響，結果（圖1A）表明，米曲霉產生蛋白酶的最佳培養(yǎng)基初始pH值為6.0～8.0，當培養(yǎng)基初始pH值為5.0，米曲霉仍能產生相對于最高活性72%的蛋白酶；而當培養(yǎng)基初始pH值調至9.0時，米曲霉產生蛋白酶量則迅速下降至最高活性的34%，表明米曲霉產蛋白酶雖可在較寬的培養(yǎng)基初始pH值范圍內，但堿性環(huán)境不利于米曲霉蛋白酶的生產。盡管米曲霉木聚糖酶和纖維素酶的產生也在一定程度上受到培養(yǎng)基初始pH值的影響，但是與米曲酶蛋白酶相比較，一方面其受影響的程度低于蛋白酶，另一方面米曲霉產生此2種酶的最佳培養(yǎng)基初始pH值范圍屬于中性偏堿，如纖維素酶活性在pH8.0時達最高。另外，在調節(jié)培養(yǎng)基初始pH值至最佳的基礎上考察了培養(yǎng)溫度對米曲霉產酶的影響，結果（圖1B）表明，當培養(yǎng)溫度為30℃時菌株所產酶活性最高；當溫度升高至45℃時，蛋白酶活性僅為最高值的35%，木聚糖酶和纖維素酶活性也分別降至最高值的46%和51%?？芍?0℃條件下較為利于米曲霉的菌絲生長及產酶。2.4米曲霉的蛋白酶特性在優(yōu)化的發(fā)酵條件下，米曲霉固體發(fā)酵的產酶過程見圖2。由圖2可知，從培養(yǎng)24h開始米曲霉開始蛋白酶的迅速合成，至培養(yǎng)48h時產生最高活性的蛋白酶，隨后產酶量迅速下降至最高值的50%。米曲霉產生木聚糖酶和纖維素酶的趨勢與蛋白酶基本一致。國內醬油生產中滬釀3.042米曲霉的制曲時間為36h～42h，也是由于在此時間段米曲霉菌所產各種酶處于高峰期。2.5米曲霉酶系統(tǒng)成分的初步檢測在不同條件下對米曲霉的產酶酶系進行分析，測試條件及結果（表3）表明，米曲霉在實驗所采用的固體發(fā)酵條件下的產物中，中性蛋白酶的量最大，除此之外，還有一定量的堿性蛋白酶及酸性木聚糖酶、纖維素酶。3初始ph值及培養(yǎng)溫度對菌株發(fā)酵的影響研究了米曲霉菌株M-9發(fā)酵條件及酶系分析。實驗表明，此菌株固態(tài)發(fā)酵最適碳源為麩皮，最適氮源為蛋白胨，菌株發(fā)酵最適