厭氧氨氧化菌的研究進(jìn)展

厭氧氨氧化菌的研究進(jìn)展

1973年，broda發(fā)現(xiàn)，化能自養(yǎng)的細(xì)菌可以通過以no-3、a2和no-2為氧化手段的nh-4氧化。推測自然界可能存在以NO-2為電子受體的厭氧氨氧化反應(yīng)。后來有研究發(fā)現(xiàn)氨氧化菌Nitrosomonaseuropaea和Nitrosomonaseutropha能同時硝化與反硝化,利用NH2OH還原NO-2或NO2,或者在缺氧條件下利用NH+4作為電子供體,把NH+4轉(zhuǎn)化為N2。在利用NO2為電子受體時,其厭氧氨氧化的最大速率(以單位蛋白質(zhì)計)約為2nmol/(min·mg)。然而在反硝化的小試實驗中發(fā)現(xiàn)了一種特殊自養(yǎng)菌的優(yōu)勢微生物群體,它以NO-2為電子受體,最大比氨氧化速率(以單位蛋白質(zhì)計)為55nmol/(min·mg)。此反應(yīng)比Nitrosomonas快25倍,把這種細(xì)菌稱為厭氧氨氧化菌。在無分子氧環(huán)境中,同時存在NH+4和NO-2時,NH+4作為反硝化的無機(jī)電子供體,NO-2作為電子受體,生成氮?dú)?這一過程稱為厭氧氨氧化。近年來,在厭氧氨氧化菌生理生化特性的理論研究領(lǐng)域和廢水生物脫氮的應(yīng)用研究領(lǐng)域都有了許多新的發(fā)現(xiàn),這對于全面認(rèn)識厭氧氨氧化菌的性質(zhì)、開發(fā)新的廢水脫氮技術(shù)都具有重要意義。1厭氧細(xì)菌的微生物特征1.1厭氧細(xì)菌的菌株1.1.1微生物特性分析Strous等研究了SBR反應(yīng)器中厭氧氨氧化污泥(優(yōu)勢菌為B.anammoxidans)的生理學(xué)參數(shù)。富集培養(yǎng)得到的細(xì)菌70%以上是一種優(yōu)勢自養(yǎng)菌。經(jīng)過pH7.4、20mmol/L的K2HPO4/KH2PO4緩沖劑和2.5%的戊二醛混合液處理后,在電子顯微鏡下表現(xiàn)出不規(guī)則的微生物特性。采用改進(jìn)的Percoll密度梯度離心分離法分離得到了非常純的細(xì)胞懸浮物,在每200~800個細(xì)菌中含有不到1個雜細(xì)菌。這些純化的厭氧氨氧化菌活性很高,從中提取的DNA通過PCR擴(kuò)增確認(rèn)。16SrRNA的分析表明B.anammoxidans是厭氧氨氧化工藝的功能微生物,確認(rèn)了厭氧氨氧化菌是Planctomycetales序列中自養(yǎng)菌的一個新成員,被命名為Candiadatus“B.anammoxidans”。此菌種適宜的pH值和溫度范圍分別為6.7~8.3,20℃~43℃。最佳條件:pH8.0,溫度40℃。對NH+4和NO-2的親和力常數(shù)低于0.1mgN/L,生物量細(xì)胞產(chǎn)率(以單位氨計)為(0.066±0.001)mol/mol,最大比氨消耗速率(以單位蛋白質(zhì)計)為(45±5)nmol/(min·mg),倍增時間為11d。1.1.2鹽的抗氧化作用Egli等的研究結(jié)果表明,K.stuttgartiensis與B.anammoxidans的作用方式類似,電鏡顯示其細(xì)菌結(jié)構(gòu)也類似。但它對磷酸鹽有更高耐受性(20mmol/L),對亞硝酸鹽耐受性則為13mmol/L,在細(xì)胞密度更低的情況下有活性。最大的厭氧氨氧化活性(以單位蛋白質(zhì)計)為26.5nmol/(mg·min),比B.anammoxidans低。pH范圍是6.5~9.0,最佳為8.0。最佳溫度為37℃,在45℃時觀察不到厭氧氨氧化活性,并且發(fā)現(xiàn)溫度降至37℃時厭氧氨氧化活性不會恢復(fù)。在11℃時的活性約為37℃的24%,可見它適宜生存于中溫偏堿性環(huán)境。1.1.3tus和ndidaus的生理特性它又分為兩種厭氧氨氧化菌種Candidatus“Scalinduabrodae”和Candidatus“Scalinduawagneri”,其生理特性研究較少。1.2oxosose類核分析厭氧氨氧化菌是革蘭氏陰性光損性球狀化能自養(yǎng)菌,直徑不到1μm。具有蛋白質(zhì)的S層,細(xì)胞壁上存在漏斗狀結(jié)構(gòu),無肽聚糖,厭氧氨氧化菌有一個單一雙分子層(膜)即厭氧氨氧化體(anammoxosome)。厭氧氨氧化菌的細(xì)胞質(zhì)因此被anammoxosome分為3個部分:(A)外部區(qū)域(細(xì)胞壁(cellwall),細(xì)胞質(zhì)膜(cytoplasmicmembrane),PP質(zhì)(paryphoplasm),細(xì)胞內(nèi)質(zhì)膜(intracytoplasmicmembrande))。(B)核糖質(zhì)(riboplasm)。(C)厭氧氨氧化體膜(anammoxosomemembrane),厭氧氨氧化體(anammoxosome),類核(nucleoid),見圖1。在富集培養(yǎng)期間,厭氧氨氧化菌污泥顏色從棕色變?yōu)樯罴t。對厭氧氨氧化菌細(xì)胞和細(xì)胞提取物的可見光譜分析發(fā)現(xiàn)c型細(xì)胞色素的吸收信號明顯增加。77K的細(xì)胞光譜分析表明沒有a型、b型和d1型的細(xì)胞色素。在厭氧氨氧化活性增加期間,468nm處的吸收信號逐漸增加并達(dá)到最高值,用CO處理后就消失。1.3培養(yǎng)基組成對甲烷的抑制效果厭氧氨氧化菌培養(yǎng)基含NH+4(5~30mmol/L)、NO-2(5~35mmol/L)、重碳酸鹽(10mmol/L)、礦物質(zhì)及微量元素。Dapena-Mora等研究了氣提式反應(yīng)器(gasliftreactor)和SBR中厭氧氨氧化過程的穩(wěn)定性,其培養(yǎng)基的組成為:(NH4)2SO40.132~4.240g,NaNO20.069~5.420g,NaNO30.425g,KHCO31.25g,NaH2PO40.05g,CaCl2·2H2O0.3g,MgSO4·7H2O0.2g,FeSO40.00625g,EDTA0.00625g,微量元素溶液:1.25mL,用蒸餾水定容至1L。磷酸鹽濃度應(yīng)低于0.5mmol/L,加入甲烷不抑制氨和亞硝酸鹽的轉(zhuǎn)化,在長期的試驗中發(fā)現(xiàn)甲烷不被厭氧氨氧化菌轉(zhuǎn)化。在短期試驗中,反應(yīng)器中加入H2后,明顯的刺激了厭氧氨氧化。但H2不能取代氨作為電子供體。短時間的批試驗中投加不同有機(jī)底物(丙酮酸鹽、甲醇、乙醇、丙氨酸、葡萄糖、酪蛋白氨基酸)會嚴(yán)重抑制厭氧氨氧化菌的活性,因此底物的范圍被局限為:NH+4-N、NO-2-N、肼和羥胺。1.4o2對厭氧氨氧化活性的影響Strous等發(fā)現(xiàn)NO-2濃度超過98mg/L時抑制厭氧氨氧化活性,當(dāng)亞硝酸鹽濃度超過5mmol/L時,若持續(xù)時間較長(12h),厭氧氨氧化活性將完全消失,但加入微量(50μmol/L)羥胺或肼,則可以恢復(fù)活性。超過2mmol/L的磷酸鹽濃度將會造成厭氧氨氧化活性的喪失。O2對厭氧氨氧化是可逆抑制。γ射線照射或121℃下消毒污泥,或在接種期內(nèi)沒有接種菌種將不會發(fā)生厭氧氨氧化反應(yīng);在接種期投加不同的抑制劑(2,4-二硝基酚、碳酰基氰間氯笨腙、HgCl2)時,完全抑制氨的氧化和硝酸鹽的還原,乙炔對厭氧氨氧化也有很強(qiáng)的抑制作用。2厭氧細(xì)菌的生物反應(yīng)機(jī)制2.1環(huán)形系統(tǒng)的類型)厭氧氨氧化菌脂質(zhì)含有酯連接和醚連接的混合脂肪酸,并發(fā)現(xiàn)了獨(dú)特的膜脂結(jié)構(gòu):環(huán)狀系統(tǒng)X(圖2-Ⅱ),環(huán)狀系統(tǒng)Y(圖2-Ⅰ)和2種不同的環(huán)狀系統(tǒng)(X+Y)見圖2-Ⅲ。環(huán)狀系統(tǒng)X和Y的所有環(huán)被cis-環(huán)連接,導(dǎo)致了象樓梯式的結(jié)構(gòu),因此定義為Ladderanelipids。有研究表明在Candidatus“B.anammoxidan”中,LadderaneX和LadderaneY占總脂的34%。目前這種梯式烷膜脂只在厭氧氨氧化菌中發(fā)現(xiàn)。2.2h4的轉(zhuǎn)化為氮?dú)釼andeGraaf用15N作為示蹤元素,研究了厭氧條件下的氨氧化,提出了浮霉?fàn)罹V細(xì)菌在厭氧條件下以亞硝酸鹽為電子受體的氨氧化代謝途徑。假設(shè)N2H4轉(zhuǎn)化為氮?dú)獾倪^程是為了給NO-2還原為NH2OH的反應(yīng)提供等量的電子。得到兩種可能的機(jī)理。其一:一個由周圍是膜的酶復(fù)合體把氨和NH2OH轉(zhuǎn)化為N2H4,N2H4則在外周胞質(zhì)內(nèi)氧化為氮?dú)?。利用?nèi)部電子轉(zhuǎn)移,酶復(fù)合體負(fù)責(zé)N2H4氧化,而在這種酶復(fù)合體的細(xì)胞質(zhì)位置上NO-2被還原為NH2OH。其二:氨和NH2OH在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)被一種周圍是膜的酶復(fù)合體轉(zhuǎn)化為N2H4。N2H4在外周胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)化為氮?dú)?它產(chǎn)生的電子通過電子傳輸鏈傳遞給細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的亞硝酸鹽還原酶。2.3磷酸腺苷的合成厭氧氨氧化反應(yīng)的關(guān)鍵酶之一是位于anammoxosome的肼氧化酶(HZO),提出了生化模型(圖3):NH+4和羥胺(NH2OH)被肼水解酶(HH)結(jié)合為肼。肼又被肼氧化酶(HZO)氧化,HZO與HAO(N.europaea)有些相似。氧化發(fā)生在anammoxosome的里面,形成N2、4個質(zhì)子和4個電子。這4個電子和從來自Riboplasm中的5個質(zhì)子一起被亞硝酸還原酶(NIR)還原亞硝酸鹽至羥胺。在這個模型中,通過消耗在Riboplasm中的質(zhì)子和在anammoxosome里面產(chǎn)生的質(zhì)子,厭氧氨氧化反應(yīng)建立了一個質(zhì)子梯度。這就導(dǎo)致了電化學(xué)質(zhì)子梯度直接從anammoxosome到Riboplasm。這種梯度含有化學(xué)勢能(ΔpH)和電子勢能(Δψ)。ΔpH和Δψ都有一種讓質(zhì)子從anammoxosome的里面到外面的一種力(質(zhì)子驅(qū)動力Δp)。在厭氧氨氧化體膜的三磷酸腺苷酶(ATPase)的催化作用下合成三磷酸腺苷(ATP)。質(zhì)子通過ATPase形成的質(zhì)子孔回到Riboplasm中,厭氧氨氧化體膜的ATPase位于Riboplasm中球狀的、親水的ATP合成區(qū)和厭氧氨氧化體膜中非親水的質(zhì)子遷移區(qū)上,合成的ATP在Riboplasm中被釋放。3厭氧細(xì)菌的應(yīng)用3.1連續(xù)攪拌反應(yīng)器中亞硝酸鹽氧化的研究Mulder等在厭氧流化床中發(fā)現(xiàn)了厭氧氨氧化。后來,vandeGraaf等和Bock等發(fā)現(xiàn)了以亞硝酸鹽為電子受體的厭氧氨氧化過程。鄭平等研究了厭氧氨氧化菌混培物的動力學(xué)特性。FuxChristian等進(jìn)行中試試驗研究,首先在連續(xù)攪拌反應(yīng)器中完成亞硝化,58%的NH+4-N轉(zhuǎn)化為NO-2;在SBR中完成厭氧氨氧化,除N速率為2.4kgN/(m3·d),除N達(dá)90%;Sliekers等在gasliftreactor中發(fā)現(xiàn)除N速率達(dá)8.9kgN/(m3·d),這個除N速率是實驗室所獲得的除N速率的20倍。Dapena-Mora等研究中發(fā)現(xiàn)在gasliftreactor中N負(fù)荷率為2.0g/(L·d),最大比厭氧氨氧化活性(MSAA)為0.9g/(g·d)。在SBR中N負(fù)荷率為0.75g/(L·d),MSAA為0.4g/(g·d),除NO-2達(dá)99%。3.2nh+4-n的處理效果Jetten等利用SHARON-ANAMMOX聯(lián)合工藝對污泥消化出水進(jìn)行了研究。SHARON反應(yīng)器總氮負(fù)荷為0.8kg/(m3·d),轉(zhuǎn)化53%的總氮(39%NO-2,14%NO-3),用SHARON反應(yīng)器的出水作為厭氧氨氧化流化床反應(yīng)器的進(jìn)水,在限制NO-2的厭氧氨氧化反應(yīng)器中NO-2全部被除去。試驗中NH+4-N的去除率達(dá)83%。VanDongen等應(yīng)用SHARON-ANAMMOX聯(lián)合工藝在工廠中長時間穩(wěn)定運(yùn)行。3.3氧化菌和微生物菌群Dijkman和Strous描述了一個新的生物脫氮工藝CANON,在限氧條件下(<0.5%空氣飽和度)得到了好氧和厭氧氨氧化菌的混培物,NH+4被需氧氨氧化菌(Nitrosomonas和Nitrososira)氧化為亞硝酸鹽,然后被厭氧氨氧化菌轉(zhuǎn)化為氮?dú)?此過程依賴于2種(Nitrosomonas需氧菌和Planctomycete厭氧氨氧化菌)自養(yǎng)微生物菌群的協(xié)同作用。CANON在2種不同的反應(yīng)器(SBR和恒化器)中進(jìn)行,容積負(fù)荷0.1(kgN)/(m3·d),除氮達(dá)92%。Sliekers等發(fā)現(xiàn)在限氧條件以及好氧氨氧化菌和厭氧氨氧化菌都有合適的負(fù)荷率時,SBR反應(yīng)器中除N負(fù)荷率達(dá)0.3(kgN)/(m3·d),NH+4主要轉(zhuǎn)化為N2(85%),其余的轉(zhuǎn)化為硝酸鹽(15%)。Sliekers等用gasliftreactor,除N負(fù)荷率達(dá)1.5(kgN)/(m3·d),這個速率是以前實驗室獲得的速率的20倍。Hao等開發(fā)了在生物膜反應(yīng)器中混合硝化(亞硝化+硝化)、厭氧氨氧化的數(shù)學(xué)模型,基于此模型,評價了CANON過程的溫度,流速。3.4電子供體反硝化技術(shù)Jetten等通過污泥消化產(chǎn)甲烷除去COD,N部分氧化至NO-2,然后以NH+4為電子供體反硝化,實現(xiàn)了甲烷化和厭氧氨氧化。ZHANG運(yùn)用EGSB反應(yīng)器技術(shù)COD的去除率97%、NO-2去除率100%,容積負(fù)荷達(dá)6.56gCOD/(L·d)和0