山楂葉果類sod提取與研究

山楂葉果類sod提取與研究

由于mcct和fridovih發(fā)現(xiàn)了這種酶，因此對sod在生物界的分布和特征的研究引起了人們的注意。近年來,人們對具有SOD同樣功能而非SOD的一類化合物進(jìn)行了大量研究,這類化合物稱為SO-L(Superoxidedismutaselike簡稱SOD-L),其清除O2-的作用稱為SOD-L活性(SOD-LikeActivity)。目前,SOD-L活性已經(jīng)成為抗衰老藥物和保健食品的一個重要指標(biāo)。山楂為薔薇科山楂屬(Crataegus.L)植物,在我國具有悠久的保健與藥用歷史。自20世紀(jì)50年代,人們開始對山楂葉、果的化學(xué)成分進(jìn)行了研究,證明其含有大量的黃酮以及綠原酸、山楂酸、膽堿、揮發(fā)油等。但對山楂葉、果中的黃酮類物質(zhì)具有SOD-L活性未見報道,我們采用鞍山地區(qū)盛產(chǎn)的野生山楂葉、果,用連苯三酚自氧化法,測定其SOD-L活性,并對其部分性質(zhì)進(jìn)行了研究,旨在為山楂葉、果的進(jìn)一步利用提供理論依據(jù)。1連苯三酚溶液山楂葉、果:采自千山鄉(xiāng)摩云山,由鞍山林業(yè)所孫忠誠教授鑒定;連苯三酚:分析純,貴州遵義化學(xué)試劑廠產(chǎn)品,用0.01moLHCl配制成50mmol的連苯三酚溶液;三羥甲基氨基甲烷:分析純,沈陽市醫(yī)藥公司化玻站試劑,配制成pH值8.2;50mmolTris-HAc緩沖液;pHS-3C型數(shù)字酸度計:上海精密科學(xué)儀器有限公司;U-1810紫外可見光分光光度計:北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。2實驗方法2.1以乙醇為酰氯化產(chǎn)品為原料的分離純化取烘干、粉碎的山楂葉、果各50g放入索氏提取器中,加入乙醚,回流至無色,回收乙醚,然后用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇加熱提取6h,濃縮后,用乙酸乙酯萃取3次,合并萃取液,再經(jīng)大孔吸附樹脂AB-8進(jìn)行分離純化、減壓濃縮、干燥,得粉末狀SOD-L。精密稱取SOD-L50mg,用雙蒸水配制成質(zhì)量濃度為1mg/mL水溶液待用。2.2sed-l活性的測定2.2.1目標(biāo)值采用謝衛(wèi)華等人的方法略有改動。取兩支干燥、潔凈的試管,一支為空白對照管,另一支為測定管,分別在兩支試管中加入pH值為8.2;50mol/LMTris-HAc緩沖液3mL,混勻置于25℃的恒溫水浴中20min,然后在測試管中加入7μL的連苯三酚,加入瞬間開始計時,用U-1810紫外可見光分光光度計,測定波長為325nm,以對照管調(diào)零,記錄測定管的吸光度A0,換算ΔA0=0.070/min,ΔA0的值為每分鐘連苯三酚自氧化速率的吸光度。2.2.2sod-l吸光度的測定取兩支試管加入50mmol/LTris-HAc緩沖液3mL,在測試管中加入適量的SOD-L待測液,置于25℃的恒溫水浴中保溫20min,然后在測定管中加入7μL的連苯三酚,加入瞬間開始計時,以對照管調(diào)零,記錄測定管的吸光度A1,換算ΔA1=0.034/min,ΔA1的值為每分鐘SOD-L吸光度。SOD-L的活性按下式計算:SOD活性(U/mL)=ΔA0?ΔA1ΔA050%×反應(yīng)液總體積加酶液體積×酶液稀釋倍數(shù)SΟD活性(U/mL)=ΔA0-ΔA1ΔA050%×反應(yīng)液總體積加酶液體積×酶液稀釋倍數(shù)抑制率按下式進(jìn)行計算:抑制率S(%)=ΔA0?ΔA1ΔA0×100%S(%)=ΔA0-ΔA1ΔA0×100%式中ΔA0為連苯三酚的自氧化率,ΔA1為加入待測液后連苯三酚的自氧化率。3結(jié)果與討論3.1黃酮類化合物檢測將精制的SOD-L溶液,與HCl-Mg,AlCl3,Pb(Ac)3反應(yīng)均為陽性,表明其中含有黃酮類化合物。將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液及山楂葉、果SOD-L稀釋,在240～350nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描,其最大吸收峰都在280nm,如圖1。以蘆丁作標(biāo)準(zhǔn)品,制作工作曲線,測定其黃酮類化合物的純度達(dá)到95.56%。3.2山楂葉片和果實中的sod-l活性測試3.2.1檢測波長的確定在3mL的緩沖液中,加入7μL連苯三酚,溶液由無色變成淡黃色,隨后再變成淡綠色,最后轉(zhuǎn)變?yōu)樯铧S色,經(jīng)測定在325nm處有最大吸收峰如圖2所示。圖2表明其在325nm和420nm均有吸收峰,325nm處的吸收峰隨放置時間延長而迅速增高,24min以后,吸收峰開始降低,420nm處的吸收峰則是緩慢增高,這與連苯三酚自氧化生成的中間產(chǎn)物不斷氧化有關(guān)。文獻(xiàn)報道的連苯三酚自氧化法中檢測波長不盡相同,根據(jù)檢測結(jié)果對325nm和420nm波長進(jìn)行比較結(jié)果表明:波長為325nm時,吸光度值比較大。在3mL的緩沖液中加入山楂葉、果SOD-L溶液,然后再加入連苯三酚,經(jīng)測定在325nm處仍有最大吸收峰,說明兩種SOD-L的加入對最大吸收峰的波長沒有改變,故可選擇325mn為測定波長。3.2.2山楂葉、果sod-l的活性在堿性條件下(pH值8.20),連苯三酚發(fā)生自氧化反應(yīng),生成O2-和有色中間產(chǎn)物,該有色中間產(chǎn)物在λ=325nm處有—特征性吸收峰。當(dāng)加入山楂葉、果SOD-L時,O2-的生成受到抑制,連苯三酚自氧化過程受阻,溶液在λ=325nm處吸收減弱。故通過測定A325可以推斷山楂葉、果SOD-L的活性。結(jié)果表明:山楂葉SOD-L的活性為630.14u/mg;山楂果SOD-L的活性為252.05u/mg,山楂葉中的SOD-L含量是山楂果中的2.5倍。3.3山楂葉片和果實中的sod-l性質(zhì)3.3.1ph對sod-l對o2-的抑制率℃條件下,分別配制0.05mol/L,pH值為3.0～12.0緩沖溶液,用連苯三酚自氧化法測定不同pH條件SOD-L對O2-的抑制率。結(jié)果表明:山楂葉、果SOD-L的最適pH在8.0左右,pH值穩(wěn)定范圍在6.0～10.0之間,其結(jié)果見表1。3.3.2離子對o2-抑制率的測定配制濃度為0.005mol/L的MgCl2、CuCl2和FeCl2溶液與一定濃度的山楂葉、果的SOD-L液混合,在25℃、pH值8.2條件下,測定不同離子對O2-的抑制率。分別用0.005mol/L、50μLMgCl2、GuCl2和FeCl2與一定濃度的山楂葉、果中SOD-L混合,在25℃條件下測定不同離子對SOD-L活性的影響,結(jié)果表明Mg2+、Cu2+對山楂葉、果中SOD-有一定的激活的作用,對Fe2+則不敏感,實驗結(jié)果見表2。3.3.3葉、果sod-l的最適溫度以牛血SOD為對照,測定不同溫度條件下,山楂葉、果SOD-L對O2-抑制率的影響,結(jié)果見表3。實驗表明:山楂葉、果SOD-L的最適溫度在40℃左右,與牛血SOD的最適溫度相類似。當(dāng)溫度達(dá)60℃時,其SOD-L對O2-抑制率略有下降,溫度提高到80℃,其對O2-抑制率為原初抑制率的80.36%。而在同樣溫度條件下,牛血SOD對O2-抑制率僅保留30.21%左右。可見山楂葉、果SOD-L所表現(xiàn)出的活性比牛血SOD有著更高的熱穩(wěn)定性。4抗氧化活性物質(zhì)與溫度的關(guān)系實驗表明:山楂葉、果SOD-L與牛血SOD在清除自由基方面有著相同的作用,在紫外吸收光譜上也表現(xiàn)出與牛血SOD的類似特征。在一定濃度Mg2+、Cu2+存在時,山楂葉、果SOD-L對O2-具有較強(qiáng)的抑制作用,而對Fe2+的存在表現(xiàn)不敏感;它們對溫度的穩(wěn)定性則優(yōu)于SOD,筆者認(rèn)為這是由于其化學(xué)組成和分子結(jié)構(gòu)不同于酶蛋白分子所造成的,對其機(jī)理的研究,有待于進(jìn)一步探討。山楂葉、果SOD-L主要是黃酮類化合物,它是一類具有廣泛生物活性、低分子的植物次生代謝物。一些研究已證明,S