細胞計數方法細胞計數板法

細胞計數辦法------細胞計數板法實驗原理：當待測細胞懸液中細胞均勻分布時，通過測定一定體積懸液中的細胞的數目，即可換算出每毫升細胞懸液中細胞的細胞數目。具體操作：1.將計數板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計數板。2.將細胞懸液吸出少量，滴加在蓋片邊沿，使懸液充滿蓋片和計數板之間，靜置3min，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。3.計算板四大格細胞總數，壓線細胞只計左側和上方的。然后按公式計算：細胞數/mL=四大格細胞總數/4×10個/ml(注：當細胞諸多時，可在四個格中選一定數目較平均的小格，由于每大格中有16個小格，然后計左側和上方的細胞數，求出每小格的細胞數，取平均值m，m×16即每個格的平均值。因此，細胞密度=m×16×10個/ml)闡明：公式中除以4，由于計數了4個大格的細胞數。公式中乘以10由于計數板中每一種大格的體積為：（長）×（寬）×（高）=而1ml=1000ul=1000mm（注意：鏡下偶見有兩個以上細胞構成的細胞團，應按單個細胞計算，若細胞團10%以上，闡明分散不好，需重新制備細胞懸液。）================================================細胞計數板的使用一、血球計數板-基本構造血球計數板是一塊特制的厚型載玻片，載玻片上有四個槽構成三個平臺。中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩半，每個半邊上面各刻有一小方格網，每個方格網共分九個大格，中央的一大格作為計數用，稱為計數區(qū)。計數區(qū)的刻度有兩種：一種是計數分辨為16個大方格（大方格用三線隔開），而每個大方格又分成25個小方格；另一種是一種計數分辨成25個大方格（大方格之間用雙線分開），而每個大方格又分成16個小方格。但是不管計數區(qū)是哪一種構造，它們都有一種共同特點，即計數區(qū)都由400個小方格構成。計數區(qū)邊長為1mm，則計數區(qū)的面積為1mm2，每個小方格的面積為1/400mm2。蓋上蓋玻片后，計數區(qū)的高度為，因此每個計數區(qū)的體積為，每個小方格的體積為1/4000mm3。使用細胞計數板計數時，先要測定每個小方格中微生物的數量，再換算成每毫升菌液（或每克樣品）中微生物細胞的數量。二、細胞計數板-使用辦法1．視待測菌懸液濃度，加無菌水適宜稀釋（斜面普通稀釋100倍），以每小格的菌數可數為度。2．取干凈的細胞計數板一塊，在計數區(qū)上蓋上一塊蓋玻片。3．將菌懸液搖勻，用滴管吸取少量，從計數板中間平臺兩側的溝槽內沿蓋玻片的下邊沿摘入一小滴（不適宜過多），讓菌懸液運用液體的表面張力充滿計數區(qū)，勿使氣泡產生，并用吸水紙吸去溝槽中流出的多出菌懸液。也能夠將菌懸液直接滴加在計數區(qū)上（不要使計數區(qū)兩邊平臺沾上菌懸液，以免加蓋蓋玻片后，造成計數區(qū)深度的升高），然后加蓋蓋玻片（勿使產憤怒泡）。4．靜置半晌，使細胞沉降到計數板上，不再隨液體漂移。將細胞計數板放置于顯微鏡的載物臺上夾穩(wěn)，先在低倍鏡下找到計數區(qū)后，再轉換高倍鏡觀察并計數。由于生活細胞的折光率和水的折光率相近，觀察時應削弱光照的強度。5．計數時若計數區(qū)是由16個大方格構成，按對角線方位，數左上、左下、右上、右下的4個大方格（即100小格）的菌數。如果是25個大方格構成的計數區(qū)，除數上述四個大方格外，還需數中央1個大方格的菌數（即80個小格）。為了確保計數的精確性，避免重復計數和漏記，在計數時，對沉降在格線上的細胞的統計應有統一的規(guī)定。如菌體位于大方格的雙線上，計數時則數上線不數下線，數左線不數右線，以減少誤差。即位于本格上線和左線上的細胞計入本格，本格的下線和右線上的細胞按規(guī)定計入對應的格中。見下圖：即本格中計數細胞為3個。6．對于出芽的酵母菌，芽體達成母細胞大小二分之一時，即可作為兩個菌體計算。每個樣品重復計數2-3次（每次數值不應相差過大，否則應重新操作），按公式計算出每mL（g）菌懸液所含細胞數量。7．測數完畢，取下蓋玻片，用水將細胞計數板沖洗干凈，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免損壞網格刻度。洗凈后自行晾干或用吹風機吹干，放入盒內保存。三、細胞計數板-計數公式1、16格×25格的細胞計數板計算公式：細胞數/ml=100小格內細胞個數/100×400×10000×稀釋倍數1、25格×16格的細胞計數板計算公式：細胞數/ml=80小格內細胞個數/80×400×10000×稀釋倍數四、血細胞計數板計數的誤差重要來自哪些方面應如何盡量減少誤差,力求精確血細胞計數的誤差分別來源于技術誤差和固有誤差。其中由于操作人員采血不順利，器材解決、使用不當，稀釋不精確，細胞識別錯誤等因素所造成的誤差屬技術誤差；而由于儀器（計數板、蓋片、吸管等）不夠精確與精密帶來的誤差稱儀器誤差，由于細胞分布不均勻等因素帶來的細胞計數誤差屬于分布誤差或計數域誤差（filederror）。儀器誤差和分布誤差統稱為固有誤差或系統誤差。技術誤差和儀器誤差可通過規(guī)范操作、提高純熟程度和校正儀器而避免或糾正，但細胞分布誤差卻難于徹底消除。因此，搞好紅細胞計數的質量控制普通需采用下列方法。1．避免技術誤差，糾正儀器誤差（1）所用器材均應清潔干燥，計數板、血蓋片、微量吸管及刻度吸管的規(guī)格應符合規(guī)定或通過校正。①計數板的鑒定：規(guī)定計數室的臺面光滑、透明，劃線清晰，計數室劃線面積精確。必要時采用嚴格校正的目鏡測微計測量計數室的邊長與底面積，用微米千分尺測量計數室的深度。美國國標局（NBS）規(guī)定每個大方格邊長的誤差應不大于1%，即1±，深度誤差應不大于2%，即±。若超出上述原則，應棄之不用。②血蓋片應含有一定的重量，平整、光滑、無裂痕，厚薄均勻一致，可使用卡尺多點測量（最少在9個點），不均勻度在之內。必要時采用平面平行儀進行測量與評價，規(guī)定呈現密集平行的直線干涉條紋。最簡樸的評價辦法是將干凈的蓋片緊貼于干燥的平面玻璃上，若能吸附一定的時間不脫落，落下時呈弧線形旋轉，表達蓋片平整、厚薄均勻。同時，合格的蓋片放置在計數室表面后，與支持柱緊密接觸的部位可見到彩虹。精選出的蓋片與其它蓋片緊密重疊后，在掠射光線下觀察，如見到完整平行的彩虹條紋表達另一枚蓋片質量也符合規(guī)定。③現在臨床實驗室多采用一次性微量采血管采集毛細血管血，除注意定點購置使用信譽較好廠家的產品外，還應對每一批量的采血管進行抽樣檢查，可通過水銀稱重法或有色溶液比色法進行校正，誤差不應超出±1%。（2）紅細胞稀釋液應等滲、新鮮、無雜質微粒。（3）嚴格操作，從消毒、采血、稀釋、充池到計數都應規(guī)范，特別應注意的是血樣稀釋及充池時既要作到充足混勻，又要避免激烈震蕩為破壞紅細胞。必須一次性充滿計數室，避免產憤怒泡，充入細胞懸液的量以不超出計數室臺面與血蓋片之間的矩形邊沿為宜。（4）報告法定計量單位。2．縮小計數域誤差或分布誤差由于血細胞在充入計數室后呈隨機分布或稱Poisson分布（），而我們所能計數的細胞分布范疇是有限的，由此造成的計數誤差稱為計數域誤差或分布誤差。縮小這種誤差的有效辦法就是盡量擴大細胞計數范疇和計數數目，普通先進行誤差預計，然后決定所需計數的數目和計數范疇，只要能將誤差控制在允許范疇內即可。Berkson指出，當使用同一支吸管、同一面計數室，計數面積的細胞數，有望將CV控制在可接受的7%以內。對于紅細胞計數而言，由于紅細胞數量較多，在計數室中顯得比較“擁擠”，根據Poisson公式推斷，。欲將誤差控制在變異百分數5%以內，最少需要在計數室中計數400個紅細胞，因此規(guī)定計數五個中方格的紅細胞。事實上Berkson還通過實驗證明，紅細胞的計數域誤差為s=，較理論誤差（Poisson分布誤差）要小。3．排除異常標本的干擾白細胞數量在正常范疇時，相對于紅細胞數量來講，其影響可無視，但如白細胞過高（>100×109/L），則應對計數成果進行校正。辦法是：①實際RBC=計得RBC-WBC。如當紅細胞換算后為×1012/L、白細胞換算后為100×109/L時，病人實際紅細胞數應為×1012/L。②在高倍鏡下計數時，避開有核細胞。有核細胞體積比正常紅細胞大，中央無凹陷，無草黃色折光，可隱約見到細胞核。另外，當病人急性嚴重貧血時網織紅細胞可提前大量釋放，也給紅細胞計數帶來一定的干擾，并且影響網織紅細胞絕對值計算成果。其校正辦法有待探討。UsingaCountingChamberFormicrobiology,cellculture,andmanyapplicationsthatrequireuseofsuspensionsofcellsitisnecessarytodeterminecellconcentration.Onecanoftendeterminecelldensityofasuspensionspectrophotometrically,howeverthatformofdeterminationdoesnotallowanassessmentofcellviability,norcanonedistinguishcelltypes.Adeviceusedfordeterminingthenumberofcellsperunitvolumeofasuspensioniscalledacountingchamber.Themostwidelyusedtypeofchamberiscalledahemocytometer,sinceitwasoriginallydesignedforperformingbloodcellcounts.Topreparethecountingchamberthemirror-likepolishedsurfaceiscarefullycleanedwithlenspaper.Thecoverslipisalsocleaned.Coverslipsforcountingchambersarespeciallymadeandarethickerthanthoseforconventionalmicroscopy,sincetheymustbeheavyenoughtoovercomethesurfacetensionofadropofliquid.Thecoverslipisplacedoverthecountingsurfacepriortoputtingonthecellsuspension.ThesuspensionisintroducedintooneoftheV-shapedwellswithapasteurorothertypeofpipet.Theareaunderthecoverslipfillsbycapillaryaction.Enoughliquidshouldbeintroducedsothatthemirroredsurfaceisjustcovered.Thechargedcountingchamberisthenplacedonthemicroscopestageandthecountinggridisbroughtintofocusatlowpower.Itisessentialtobeextremelycarefulwithhigherpowerobjectives,sincethecountingchamberismuchthickerthanaconventionalslide.Thechamberoranobjectivelensmaybedamagediftheuserisnotnotcareful.OneentiregridonstandardhemacytometerswithNeubauerrulingscanbeseenat40x(4xobjective).Themaindivisionsseparatethegridinto9largesquares(likeatic-tac-toegrid).Eachsquarehasasurfaceareaofonesquaremm,andthedepthofthechamberismm.Thustheentirecountinggridliesunderavolumeofmm-cubedSuspensionsshouldbediluteenoughsothatthecellsorotherparticlesdonotoverlapeachotheronthegrid,andshouldbeuniformlydistributed.Toperformthecount,determinethemagnificationneededtorecognizethedesiredcelltype.Nowsystematicallycountthecellsinselectedsquaressothatthetotalcountis100cellsorso(numberofcellsneededforastatisticallysignificantcount).Forlargecellsthismaymeancountingthefourlargecornersquaresandthemiddleone.Foradensesuspensionofsmallcellsyoumaywishtocountthecellsinthefour1/25sq.mmcornersplusthemiddlesquareinthecentralsquare.Alwaysdecideonaspecificcountingpattertoavoidbias.Forcellsthatoverlaparuling,countacellas"in"ifitoverlapsthetoporrightruling,and"out"ifitoverlapsthebottomorleftruling.?HereisawaytodetermineaparticlecountusingaNeubauerhemocytometer.Supposethatyouconductacountasdescribedabove,andcount187particlesinthefivesmallsquaresdescribed.Eachsquarehasanareaof1/25mm-squared(thatis,mm-squared)anddepthofmm.Thetotalvolumeineachsquareisx=mm-cubed.Youhavefivesquareswithcombinedvolumeof5x=mm-cubed.Thusyoucounted187particlesinavolumeofmm-cubed,givingyou187/=9350particlespermm-cubed.Thereare1000cubicmillimetersinonecubiccentimeter(sameasamilliliter),soyourparticlecountis9,350,000perml.Cellsareoftenlargeenoughtorequirecountingoveralargersurfacearea.Forexample,youmightcountthetotalnumberofcellsinthefourlargecornersquares