人血清白蛋白的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)體系的研究

人血清白蛋白的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)體系的研究

1其他化學(xué)發(fā)光分析方法人類血清蛋白（hsa）的含量非常豐富。成人血液中大約有40克。該功能主要用于維持血液的正常穿透，并將親水分子輸送到血液中。臨床上，作為一種血漿容量擴大劑，它被廣泛應(yīng)用于大出血、休克、燒傷、癌癥、紅白細(xì)胞增多、白細(xì)胞過少等疾病。人血清白蛋白的測定是生物化學(xué)和臨床檢驗中的重要內(nèi)容。測定人血清白蛋白的常規(guī)方法是光度法,但亦有熒光法及極譜法的報道?；瘜W(xué)發(fā)光分析法(CL)以其靈敏度高、儀器設(shè)備簡單、操作方便等特點,廣泛應(yīng)用于環(huán)境化學(xué)、臨床檢驗、藥物分析和工業(yè)分析等領(lǐng)域。流動注射-化學(xué)發(fā)光法(FI-CL)已廣泛用于金屬離子、氨基酸和藥物分析,但用于蛋白質(zhì)分析的報道卻相當(dāng)有限。黃春保等提出了反相流動注射-化學(xué)發(fā)光測定牛血清白蛋白、牛血紅蛋白和人血清白蛋白的方法,并討論了蛋白質(zhì)標(biāo)記物化學(xué)發(fā)光增強作用的原因;李永新等建立了一種靈敏度較高的測定蛋白質(zhì)的猝滅化學(xué)發(fā)光方法,并應(yīng)用于人血清樣品中總蛋白的測定;Huang等將微孔分析盤技術(shù)和FI技術(shù)相結(jié)合,測定了標(biāo)記鏈霉素的牛血清白蛋白;根據(jù)蛋白質(zhì)-銅絡(luò)合物的性質(zhì);Tong等開發(fā)了1,10-phenanthroline-H2O2-CTMAB-Cu2+體系,并用于魯米諾化學(xué)發(fā)光檢測BSA、HAS和γ-globulin等。作者在實驗過程中發(fā)現(xiàn),HAS可有效催化Luminol-K3Fe(CN)6反應(yīng),產(chǎn)生很強的發(fā)光信號,基于這一現(xiàn)象,本文建立了一種靈敏度高、準(zhǔn)確度好的化學(xué)發(fā)光測定人血清中白蛋白的新方法。2實驗部分2.1氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液自行組裝的流動注射化學(xué)發(fā)光儀(FI-CL),包括:IFIS-C型智能流動注射進樣器和CL流通池(西安瑞邁電子科技有限公司);R-212型光電倍增管(北京濱松公司);ND-802型直流前置放大器(南京大學(xué)微弱信號檢測中心);色譜工作站(上海千譜有限公司);818型酸度計(美國,奧立龍公司)。人血清白蛋白(HSA),亮氨酸(Leu)、丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、苯丙氨酸(Phe)、組氨酸(His)、天冬酰胺(Asn)、賴氨酸(Lys)和谷氨酸(Gln)(美國,Sigma公司)。人血清白蛋白(HSA)和所有氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液均為水溶液;魯米諾儲備液:2.0×10-2mol/L;鐵氰化鉀儲備液:0.05mol/L;NaOH溶液:1.0mol/L;十六烷基三甲基溴化胺(CTMAB)溶液:1.0×10-2mol/L;十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液:5.0×10-2mol/L;KBr溶液:2.5mol/L;聚乙二醇辛基苯基醚(OP)溶液:2.0×10-2mol/L;β-環(huán)糊精(β-CD)溶液:2.0×10-2mol/L;三氯甲烷,乙醇;甲醇和乙腈是體積分?jǐn)?shù)均為20%的水溶液。所用試劑均為分析純,實驗用水為二次蒸餾水。2.2魯米諾、鐵氰化鉀及載流、試樣的流路分析于50mL容量瓶中依次加入1.0mL1.0×10-2mol/L的CTMAB溶液、一定體積的人血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液,調(diào)節(jié)pH值,以二次蒸餾水定容,搖勻,然后經(jīng)蠕動泵輸入。分析流路見圖1。魯米諾、鐵氰化鉀溶液(A泵)及載流、試樣(B泵)分別由兩蠕動泵輸入。在強堿性介質(zhì)中,鐵氰化鉀氧化魯米諾產(chǎn)生相對較弱的化學(xué)發(fā)光,當(dāng)進樣閥每次注入40μL的樣品時,在體積為100μL的流通池內(nèi)發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng),光信號經(jīng)放大,轉(zhuǎn)為電信號后讀出。3結(jié)果與討論3.1人血清白蛋白對luminol-k3fe體系的催化作用圖2為2.9×10-8mol/LHSA標(biāo)準(zhǔn)樣品的化學(xué)發(fā)光曲線。結(jié)果表明:(1)人血清白蛋白對Luminol-K3Fe(CN)6體系有很強的催化效應(yīng);(2)該化學(xué)發(fā)光反應(yīng)信號在幾秒內(nèi)迅速達到最大值,因此適合用于HSA的快速分析;(3)連續(xù)進樣的化學(xué)發(fā)光信號穩(wěn)定,表明該化學(xué)發(fā)光反應(yīng)有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。3.2參數(shù)優(yōu)化3.2.1流速和載流率分別改變A泵和B泵的流速,發(fā)現(xiàn)當(dāng)魯米諾、鐵氰化鉀的流速為4.0mL/min,載流和樣品的流速為5.0mL/min時,信噪比最高、峰形好。3.2.2魯米諾濃度對os/l范圍內(nèi)相對發(fā)光強度的影響實驗結(jié)果表明:在5.0×10-6～5.0×10-5mol/L范圍內(nèi)時,相對發(fā)光強度隨著魯米諾濃度的增大而發(fā)生變化,當(dāng)魯米諾濃度超過3.0×10-5mol/L時,相對發(fā)光強度降低。選擇魯米諾的濃度為3.0×10-5mol/L。3.2.3鐵氰化鉀濃度對反應(yīng)的影響考察了鐵氰化鉀濃度對該化學(xué)發(fā)光反應(yīng)相對發(fā)光強度的影響。結(jié)果表明,相對發(fā)光強度在一定濃度范圍內(nèi)隨鐵氰化鉀濃度的升高而增大,并且在鐵氰化鉀濃度增大到5.0×10-4mol/L時達到最大;但是,隨著鐵氰化鉀濃度的繼續(xù)增大,該反應(yīng)的相對發(fā)光強度反而降低。因此,選擇的鐵氰化鉀濃度為5.0×10-4mol/L。3.2.4影響系統(tǒng)ph值的影響改變鐵氰化鉀與魯米諾溶液的pH值,并考察其對化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的影響,結(jié)果見圖3。實驗表明,當(dāng)體系的pH=12.2時,發(fā)光強度達到最大值。3.2.5不同ph值對化學(xué)發(fā)光信號的影響pH值的選擇樣品的pH值在一定的范圍內(nèi)對化學(xué)發(fā)光反應(yīng)有影響,在pH9.0～12.5范圍內(nèi),化學(xué)發(fā)光信號隨著HSA溶液的pH值升高而變化,當(dāng)樣品的pH達到12.2時,化學(xué)發(fā)光信號強度最大而后急劇下降。3.2.6ctmab協(xié)同催化作用據(jù)文獻報道表明,某些表面活性劑及有機溶劑在一定程度上能對發(fā)光起到增敏作用。本實驗分別考察了OP、SDS、CTMAB、EDTA、KBr和β-CD三氯甲烷、乙醇、甲醇、乙腈等物質(zhì)對Luminol-K3Fe(CN)6-HSA發(fā)光反應(yīng)的影響。實驗結(jié)果表明:OP的加入將會使該反應(yīng)的發(fā)光信號降低;KBr和β-CD能明顯增強Luminol-K3Fe(CN)6發(fā)光信號,但對Luminol-K3Fe(CN)6-HSA反應(yīng)無協(xié)同增強作用;SDS、三氯甲烷、乙醇、甲醇、乙腈等均未顯示出明顯的協(xié)同催化效果。如圖4所示,CTMAB對該體系的發(fā)光具有明顯協(xié)同催化作用,Luminol-K3Fe(CN)6-HSA體系的發(fā)光信號在一定濃度范圍內(nèi)隨著試樣中CTMAB的濃度增加而增大,而當(dāng)試樣中的CTMAB濃度為1.0×10-4mol/L時達到最大值。EDTA增敏效果不如CTMAB,故本文選擇的增敏劑為CTMAB。3.3br-嚴(yán)重干擾在選定的實驗條件下,考察了多種物質(zhì)共存時對濃度為3.6×10-10mol/mLHSA發(fā)光強度的影響。試驗結(jié)果表明:50倍的亮氨酸(Leu)無干擾;500倍的丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、苯丙氨酸(Phe)、組氨酸(His)、天冬酰胺(Asn)、賴氨酸(Lys)和谷氨酸(Gln)無干擾;1000倍的EDTA、甲醇、乙醇、SO2?442-、NO-3、F-,100倍的CHCl3、乙腈、Na+、K+、Ca2+、Zn2+、Al3+、Fe3+、Mg2+不產(chǎn)生干擾。Br-嚴(yán)重干擾;1倍的Co2+、Ni2+,10倍的Cu2+、Pb2+、Cr6+等金屬離子對HSA的發(fā)光強度有影響,加入100倍的EDTA后可消除干擾。3.4標(biāo)準(zhǔn)1:發(fā)光強度法在最佳條件下,HSA濃度在1.2×10-11～4.4×10-8mol/L范圍內(nèi)與發(fā)光強度呈良好的線性關(guān)系,回歸方程為:y=4×1010x+371.01(R2=0.9942);檢出限(S/N=3)為1.2×10-11mol/L;對2.9×10-8mol/L的標(biāo)準(zhǔn)樣品平行12次測定,其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.5%。3.5與傳統(tǒng)分光光度法比較的回收率測定結(jié)果對比實驗結(jié)果將離心后的人血液中的血清稀釋1000倍,然后按實驗方法進行分析,并將測定結(jié)果與常用的雙縮脲分光光度法進行比較,同時進行