細胞融合及應(yīng)用

第七章

細胞融合與應(yīng)用第一節(jié)細胞融合概述細胞融合（cellfusion)，又稱體細胞雜交（somatichybridiazation），是指兩個或更多個相同或不同細胞通過膜融合形成單個細胞的過程。一、細胞融合的定義Muller于1838年觀察到脊椎動的腫瘤細胞能在體內(nèi)自發(fā)地融合產(chǎn)生多核的腫瘤細胞。Virchow于1858年描述了正常組織、發(fā)炎組織以及腫瘤組織中的多核細胞現(xiàn)象。Luginbuhl于1873年觀察到天花病人的血液中也有多核的血細胞存在。Lange于1875年第一個觀察到脊椎動物（蛙類）的血液細胞發(fā)生融合的過程。Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在無脊椎動中發(fā)現(xiàn)了細胞合并現(xiàn)象。1958年日本學(xué)者岡田（Okada）發(fā)現(xiàn)仙臺病毒具有觸發(fā)動物細胞融合的效應(yīng)。1974年華裔加拿大學(xué)者高國楠創(chuàng)立了聚乙二醇（PEG）化學(xué)融合法。1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴細胞和骨髓瘤細胞而產(chǎn)生能分泌預(yù)定單克隆抗體的雜交瘤細胞。20世紀80年代出現(xiàn)了電融合技術(shù)。二、細胞融合研究歷史生物種類細胞來源成功年代煙草兩個種間苷藍——青菜大豆——馬唐草矮牽?！埫婊ù篼湣ㄉ篼湣蠖剐←湣珷颗Ｓ筒恕蠖褂衩住蠖勾蠖埂巴愣勾篼湣Q豆大豆——草香木犀酵母菌——雞大豆——煙草大豆——秋水仙人——胡蘿卜番茄——馬鈴薯人——小鼠葉——葉葉——根愈傷組織——葉葉——花瓣種子——種子葉——懸浮細胞葉——花瓣葉——懸浮細胞葉——懸浮細胞懸浮細胞——懸浮細胞葉——根懸浮細胞——葉原生質(zhì)體——血紅細胞懸浮細胞——葉懸浮細胞——葉腹水癌細胞——原生質(zhì)體葉——根尖纖維肉瘤細胞——畸胎瘤細胞197219721972197319741974197419741974197419751976197619761976197619781978幾種細胞融合成功的例子植物融合細胞成長狀態(tài)對比,右瓶為地面融合的細胞，左瓶中為太空微重力環(huán)境下融合的細胞

動物細胞融合實驗使用的小白鼠三、動植物細胞的融合過程植物細胞融合過程人造小鼠培育過程示意圖四、細胞融合的意義理論上說任何細胞，都有可能通過體細胞雜交而成為新的生物資源。這對于種質(zhì)資源的開發(fā)和利用具有深遠的意義。融合過程不存在有性雜交過程中的種性隔離機制的限制，為遠緣物種間的遺傳物質(zhì)交換提供了有效途徑。體細胞雜交產(chǎn)生的雜種細胞含有來自雙親的核外遺傳系統(tǒng)，在雜種的分裂和增殖過程中雙親的葉綠體、線粒體DNA亦可發(fā)生重組，從而產(chǎn)生新的核外遺傳系統(tǒng)。淋巴細胞雜交瘤和單克隆抗體的制備。第二節(jié)細胞融合的基本原理顯微鏡下細胞融合過程融合過程中兩個細胞膜從彼此接觸到破裂形成細胞橋的變化過程圖解第三節(jié)細胞融合的常用方法物理法：顯微操作，電場刺激等化學(xué)法：硝酸鈉誘導(dǎo)、PEG結(jié)合高pH，高鈣離子法p167生物法：仙臺病毒法一、仙臺病毒法仙臺病毒誘導(dǎo)細胞融合經(jīng)四個階段：①兩種細胞在一起培養(yǎng)，加入病毒，在4℃條件下病毒附著在細胞膜上。并使兩細胞相互凝聚；②在37℃中，病毒與細胞膜發(fā)生反應(yīng)，細胞膜受到破環(huán)，此時需要Ca2+和Mg2+，最適PH為8.0一8.2；②細胞膜連接部穿通，周邊連接部修復(fù)，此時需Ca2+和ATP；④融合成巨大細胞，仍需ATP?；驹恚菏抢貌《揪哂心毎哪芰Σ《痉ǖ闹饕襟E兩個原生質(zhì)體或細胞在病毒黏結(jié)作用下彼此靠近；通過病毒與原生質(zhì)體或細胞膜的作用使兩個細胞膜間互相滲透，胞質(zhì)互相滲透；兩個原生質(zhì)體的細胞核互相融合，兩個細胞融為一體；進入正常的細胞分裂途徑，分裂成含有兩種染色體的雜種細胞。用滅活的病毒誘導(dǎo)的動物細胞融合過程示意圖

聚乙二醇(PEG)結(jié)構(gòu)為：HOH2C（CH20CH2）nCH2OH，分子量大于200小于6000者均可用作細胞融合劑。PEG濃度以W/W；如將10克PEG與10mlEagLe氏液混合（假定1ml培養(yǎng)液為1g重)，即成50％PEG溶液。PEG經(jīng)高壓滅菌后，與溫?zé)岬腅ngle氏液混合。通常用分子量低于1000的PEG作融合劑最好，50％PEG溶液能產(chǎn)生最多雜交細胞。PEG溶液在pH6.0時細胞融合率最高。優(yōu)點是易得，用法簡單，融合效果穩(wěn)定。二、聚乙二醇（PEG）法聚乙二醇（PEG）法細胞融合過程PEG的作用機理：Kao等認為，由于PEG分子具有輕微的負極性，故可以與具有正極性基團的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成H鍵，從而在質(zhì)膜之間形成分子橋，其結(jié)果是使細胞質(zhì)膜發(fā)生粘連進而促使質(zhì)膜的融合；另外，PEG能增加類脂膜的流動性，也使細胞的核、細胞器發(fā)生融合成為可能。PEG誘導(dǎo)融合的特點：其優(yōu)點是融合成本低，勿需特殊設(shè)備；融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過程不受物種限制。其缺點是融合過程繁瑣，PEG可能對細胞有毒害。

（1）將兩種不同親本細胞各5×l06混勻；（2）離心沉淀，吸去上清液；（3）加1ml50％PEG溶液，用吸管吹打，使之與細胞接觸1分鐘；（4）加9ml培養(yǎng)液，離心沉淀，吸去上清液；（5）加5ml培養(yǎng)液，分別接種5個直徑60mm平皿，每個平皿加培養(yǎng)液至5ml，37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（6）6—24小時后，換成選擇培養(yǎng)液篩選雜交細胞。聚乙二醇（PEG）法細胞融合步驟PEG誘導(dǎo)的細胞融合過程示意圖

三、電融合法

電融合法是80年代出現(xiàn)的細胞融合技術(shù)，在直流電脈沖的誘導(dǎo)下，細胞膜表面的氧化還原電位發(fā)生改變，使異種細胞粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進而質(zhì)膜開始連接，直到閉和成完整的膜，形成融合體。電融合法的優(yōu)點：融合率高、重復(fù)性強、對細胞傷害??；裝置精巧、方法簡單、可在顯微鏡下觀察或錄像觀察融合過程；免去PEG誘導(dǎo)后的洗滌過程、誘導(dǎo)過程可控性強。細胞膜的接觸：當(dāng)原生質(zhì)體置于電導(dǎo)率很低的溶液中時，電場通電后，電流即通過原生質(zhì)體而不是通過溶液，其結(jié)果是原生質(zhì)體在電場作用下極化而產(chǎn)生偶極子，從而使原生質(zhì)體緊密接觸排列成串；膜的擊穿：原生質(zhì)體成串排列后，立即給予高頻直流脈沖就可以使原生質(zhì)膜擊穿，從而導(dǎo)致兩個緊密接觸的細胞融合在一起。電融合法的基本過程電融合誘導(dǎo)法原理示意圖第三節(jié)雜種細胞的篩選根據(jù)已經(jīng)發(fā)生融合的細胞中所含有核的類型，可將其分為以下幾種類型：異核細胞：非同源細胞的融合體。同核細胞：兩個相同細胞的融合體。多核細胞：含有雙親不同比例核物質(zhì)的融合體。雜種細胞篩選方法：1．遺傳互補篩選法2．抗性互補篩選3．生長特性篩選法4．物理特性篩選法5．其它方法基于酶缺陷型細胞和藥物抗性所建立的雜種篩選基于營養(yǎng)缺陷型細胞所建立的雜種篩選由溫度敏感型細胞組成的雜種細胞的篩選具有所需性狀雜種細胞的篩選常用的雜種細胞篩選方法第四節(jié)細胞融合技術(shù)應(yīng)用舉例

動物細胞融合—單克隆抗體生產(chǎn)利用原生質(zhì)體融合和培養(yǎng)技術(shù)培育新植物微生物原生質(zhì)體融合構(gòu)成新菌株一、何謂單克隆抗體？應(yīng)用1：細胞雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體只針對某一抗原決定簇的抗體分子稱為單克隆抗體。T淋巴細胞：即胸腺依賴淋巴細胞（thymusdependentlymphocyte）。亦可簡稱T細胞。來源于骨髓的多能干細胞（胚胎期則來源于卵黃囊和肝）。目前認為，在人體胚胎期和初生期，骨髓中的一部分多能干細胞或前T細胞遷移到胸腺內(nèi)，在胸腺激素的誘導(dǎo)下分化成熟，成為具有免疫活性的T細胞。成熟的T細胞經(jīng)血流分布至外周免疫器官的胸腺依賴區(qū)定居，并可經(jīng)淋巴管、外周血和組織液等進行再循環(huán)，發(fā)揮細胞免疫及免疫調(diào)節(jié)等功能。T細胞的再循環(huán)有利于廣泛接觸進入體內(nèi)的抗原物質(zhì)，加強免疫應(yīng)答，較長期保持免疫記憶。T細胞的細胞膜上有許多不同的標(biāo)志，主要是表面抗原和表面受體。這些表面標(biāo)志都是結(jié)合在細胞膜上的巨蛋白分子。人類免疫系統(tǒng)的介紹

外分泌淋巴系統(tǒng)：呼吸道和生殖泌尿系統(tǒng)內(nèi)分泌淋巴系統(tǒng)：胸腺、骨髓、脾臟、扁桃體、淋巴結(jié)等B淋巴細胞：來源于骨髓的多能干細胞。在禽類是在法氏囊內(nèi)發(fā)育生成，故又稱囊依賴淋巴細胞（bursadependentlymphocyte）/骨髓依賴性淋巴細胞簡稱B細胞，是由骨髓中的造血干細胞分化發(fā)育而來。與T淋巴細胞相比，它的體積略大。這種淋巴細胞受抗原刺激后，會增殖分化出大量漿細胞。漿細胞可合成和分泌抗體并在血液中循環(huán)。成熟的B細胞經(jīng)外周血遷出，進入脾臟、淋巴結(jié)，主要分布于脾小結(jié)、脾索及淋巴小結(jié)、淋巴索及消化道粘膜下的淋巴小結(jié)中，受抗原刺激后，分化增殖為漿細胞，合成抗體，發(fā)揮體液免疫的功能。B細胞在骨髓和集合淋巴結(jié)中的數(shù)量較T細胞多，在血液和淋巴結(jié)中的數(shù)量比T細胞少，在胸導(dǎo)管中則更少，僅少數(shù)參加再循環(huán)。B細胞的細胞膜上有許多不同的標(biāo)志，主要是表面抗原及表面受體。這些表面標(biāo)志都是結(jié)合在細胞膜上的巨蛋白分子。

B1細胞為T細胞非依賴性細胞。B2為T細胞依賴性細胞。B細胞在體內(nèi)存活的時間較短，僅數(shù)天至數(shù)周，但其記憶細胞在體內(nèi)可長期存在。

B細胞淋巴瘤是一種最常見的淋巴細胞白血病，有關(guān)這種疾病的研究不斷涌現(xiàn)。

單克隆抗體技術(shù)的核心是用骨髓瘤細胞(myelomacell)與經(jīng)特定抗原免疫刺激的B淋巴細胞(antigenstimulatedBlymphoblast)融合得到雜交瘤細胞(hybridomacell)，雜交瘤細胞既能象骨髓瘤細胞那樣在體外無限增殖，又具有B淋巴細胞產(chǎn)生特異性抗體的能力。因此，單克隆抗體技術(shù)又稱為雜交瘤技術(shù)(hybridomatechnology）。NielsK.Jerne

G.Kohler

C.Milstein

免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說單克隆抗體：1984Nobel二、雜交瘤技術(shù)的基本原理三、雜交瘤細胞的制備（一）骨髓瘤細胞選擇及選擇性培養(yǎng)基骨髓瘤細胞本身不能分泌抗體選擇次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）HAT培養(yǎng)基次黃嘌呤（hypoxanthine，H）氨基喋呤（aminopterin，A）胸腺嘧啶脫氧核苷（thymidine，T）次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）（二）免疫小鼠

免疫程序是取6—8周齡Balb／C雌鼠，基礎(chǔ)免疫2周，靜脈再加強免疫一次，3—5天后用于融合。免疫時是否采用佐劑和事先處理抗原，要依抗原性的強弱而定。一般來講可溶性抗原用完全佐劑效果較好?？乖客瑯优c抗原強弱有關(guān)，以IgG為例，第一次為l00g，第二次為50g，免疫途徑第一次可經(jīng)腹腔注射。對于細胞性抗原不用佐劑，每次腹腔注射1×l06一1×107。（三）脾細胞的制備(1)引頸處死小鼠，用酒精消毒體表；(2)無菌條件下取出脾臟，剃除結(jié)締組織和脂肪，用5ml無血清培養(yǎng)液沖洗一次；(3)把脾臟置于已消毒的90一100目不銹鋼網(wǎng)或尼龍紗網(wǎng)中；(4)在脾中部切開一小口，用注射器芯從一端輕輕壓擠，再用無血清培養(yǎng)液沖洗，令細胞通過紗網(wǎng)，收集入平皿中，或用注射器向脾臟內(nèi)注入3ml無血清培養(yǎng)液，反復(fù)抽吸數(shù)次方法獲取細胞，再制成細胞懸液亦可；(5)把細胞懸液注入50ml離心管中，加l0一20ml培養(yǎng)液：輕輕吹打數(shù)次，室溫中置5分鐘；(6)離心(800一1000轉(zhuǎn)／分)計數(shù)、備用。（四）細胞準備（1）收集骨髓瘤細胞，用無血清培養(yǎng)液洗3次(37℃)，計數(shù)活力細胞(不少于90％)；（2）收集小鼠脾細胞，用無血清培養(yǎng)液洗3次(37℃)，并計細胞數(shù)和測定活力細胞；（3）按1：5或1：10混合脾細胞和骨髓瘤細胞后，離心棄去上清，并以消毒濾紙吸凈多余上清。（五）細胞融合(1)將1ml40％的PEG液一滴滴加入列細胞團中，在60秒內(nèi)加完，同時并不斷輕微轉(zhuǎn)動離心管或用手指輕彈離心管；(2)在不斷轉(zhuǎn)動離心管中加1ml無血清培養(yǎng)液，60秒鐘內(nèi)加完；(3)于5分鐘內(nèi)慢慢加完20ml無血清培養(yǎng)液；此時細胞對機械損傷非常敏感，(4)離心(800轉(zhuǎn)／分，8分鐘)，去上清，用完全培養(yǎng)液10ml懸浮，輕輕混勻；(5)取96孔板，每孔加50l；(6)取等體積細胞懸液，向另一96孔板中加50P1；(7)送入5％CO2，溫箱中37℃培養(yǎng)，24小時后更換成HAT選擇性培養(yǎng)掖。（六）融合后細胞培養(yǎng)(1)融合后7—10天用HAT培養(yǎng)液半量換液(留一半舊的加一半新的)后每隔2—3天半量換液一次；(2)兩周后可改用HA培養(yǎng)液半量換液，或仍用HAT培養(yǎng)液；(3)2—3周后出現(xiàn)雜交細胞集落，細胞個大、圓且透明；(4)待集落增殖生長至1／3孔時，應(yīng)進行抗體檢測。HAT培養(yǎng)基次黃嘌呤（hypoxanthine，H）氨基喋呤（aminopterin，A）胸腺嘧啶脫氧核苷（thymidine，T）次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）（七）抗體檢測免疫熒光試驗放射免疫試驗(RIA)聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)（八）單克隆抗體的大量制備體內(nèi)接種法體外培養(yǎng)法血清法腹水法傳統(tǒng)培養(yǎng)法生物反應(yīng)器培養(yǎng)法四、單克隆抗體的應(yīng)用單克隆抗體具有高度的特異性與靈敏性，可以廣泛地由于臨床醫(yī)學(xué)的疾病診斷，以提高疾病診斷的準確性。利用單克隆抗體技術(shù)可以生產(chǎn)各種免疫疫苗，這不僅能大大降低生產(chǎn)成本，同時也增加了疫苗的安全性。單克隆抗體還有可能用于某些腫瘤的治療，是人類戰(zhàn)勝癌癥十分有望的潛在技術(shù)。單克隆抗體技術(shù)還可廣泛用于各種基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究，從而推動現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展。五、人源單克隆抗體為什么制備人源單克隆抗體？p131主要困難（1）缺乏合適的人骨髓瘤細胞株作為融合親本?，F(xiàn)有的細胞株大多是融合率不高，雜交瘤抗體產(chǎn)生水平低，而且細胞不穩(wěn)定，易喪失抗體分泌能力；（2）獲得抗原特異的人B淋巴細胞十分困難，因為對人來說，高度免疫獲得抗原特異的B淋巴細胞的方法顯然是不可行的；（3）大量繁殖雜交瘤細胞以獲得所需量的抗體，鼠類雜交瘤可通過小鼠腹腔接種雜交瘤細胞誘生腹水達到這一目的，但是人雜交瘤細胞在鼠類中誘生腹水是很困難的。人源性單克隆抗體的制備方法：p132（1）人-鼠雜交瘤單克隆抗體（2）人-人雜交瘤單克隆抗體（3）嚴重免疫缺陷小鼠制備人源化單克隆抗體（4）基因工程單克隆抗體應(yīng)用2：利用原生質(zhì)體融合和培養(yǎng)技術(shù)培育新植物1．植物原生質(zhì)體培養(yǎng)的意義：①融合產(chǎn)生體細胞雜種②分離或引入各種細胞器③導(dǎo)入外源基因④誘發(fā)突變體⑤研究細胞信息傳遞、能量轉(zhuǎn)換、物質(zhì)運輸?shù)娶扪芯考毎诘暮铣蓹C制⑦研究膜的功能與細胞膜的相互作用⑧研究核質(zhì)關(guān)系⑨研究疾病與抗性機理2原生質(zhì)體制備過程原生質(zhì)體的來源:

*植物葉片 取材容易 比較容易用酶解法分離*植物根尖組織 可由各種植物的種子萌發(fā)后取得*植物花粉 產(chǎn)生單倍體原生質(zhì)體*愈傷組織、懸浮培養(yǎng)的細胞細胞壁容易解離植物原生質(zhì)體純化的方法：目的：去除破碎的原生質(zhì)體、末去壁的細胞、細胞器及其他碎片等雜質(zhì)。

(1)沉降法

(2)漂浮法

(3)界面法（1）沉降法原理：

利用比重原理，在具有一定滲透壓的溶液中，先進行過濾（44-169μm的篩網(wǎng)），然后低速離心（900-4500r/min，2min)，使純凈完整的原生質(zhì)體沉積于試管底部.優(yōu)缺點：

比較簡單但不易除盡一些完整的細胞，或引起原生質(zhì)的破碎（2）漂浮法原理：采用比原生質(zhì)體比重大的高滲溶液，使原生質(zhì)體漂浮在溶液表面。

優(yōu)缺點：可以得到較為純凈、完整的原生質(zhì)體，但完好的原生質(zhì)體數(shù)量較少（3）界面法原理：采用兩種比重不同的溶液，使原生質(zhì)體處于兩液相的界面之中。優(yōu)缺點： 可以收到數(shù)量較大的純凈原生質(zhì)體，同時避免收集過程中原生質(zhì)體因相互擠壓而破碎。3原生質(zhì)體培養(yǎng)①液體培養(yǎng)分：液體淺層培養(yǎng)液體懸滴培養(yǎng)②固體平板法③雙層培養(yǎng)法4利用原生質(zhì)體融合培育新植株生物種類細胞來源成功年