宏基因組測(cè)序講解

宏基因組測(cè)序目的研究藻類物種的分類，研究與特定環(huán)境與有關(guān)的代謝通路，以及通過(guò)不同樣品的比較研究微生物內(nèi)部，微生物與環(huán)境，與宿主的關(guān)系。技術(shù)介紹宏基因組(Metagenome)(也稱微生物環(huán)境基因組MicrobialEnvironmentalGenome,或元基因組)。是由Handelsman等1998年提出的新名詞，其定義為"thegenomesofthetotalmicrobiotafoundinnature",即生境中全部微小生物遺傳物質(zhì)的總和。它包含了可培養(yǎng)的和未可培養(yǎng)的微生物的基因，現(xiàn)在重要指環(huán)境樣品中的細(xì)菌和真菌的基因組總和。而所謂宏基因組學(xué)(或元基因組學(xué)，metagenomics)就是一種以環(huán)境樣品中的微生物群體基因組為研究對(duì)象，以功效基因篩選和/或測(cè)序分析為研究手段，以微生物多樣性、種群構(gòu)造、進(jìn)化關(guān)系、功效活性、互相協(xié)作關(guān)系及與環(huán)境之間的關(guān)系為研究目的的新的微生物研究辦法。普通涉及從環(huán)境樣品中提取基因組DNA,進(jìn)行高通量測(cè)序分析，或克隆DNA到適宜的載體，導(dǎo)入宿主菌體，篩選目的轉(zhuǎn)化子等工作。宏基因組(Metagenome)(也稱微生物環(huán)境基因組MicrobialEnvironmentalGenome,或元基因組)。是由Handelsman等1998年提出的新名詞，其定義為"thegenomesofthetotalmicrobiotafoundinnature",即生境中全部微小生物遺傳物質(zhì)的總和。它包含了可培養(yǎng)的和未可培養(yǎng)的微生物的基因，現(xiàn)在重要指環(huán)境樣品中的細(xì)菌和真菌的基因組總和。而所謂宏基因組學(xué)(或元基因組學(xué)，metagenomics)就是一種以環(huán)境樣品中的微生物群體基因組為研究對(duì)象，以功效基因篩選和/或測(cè)序分析為研究手段，以微生物多樣性、種群構(gòu)造、進(jìn)化關(guān)系、功效活性、互相協(xié)作關(guān)系及與環(huán)境之間的關(guān)系為研究目的的新的微生物研究辦法。普通涉及從環(huán)境樣品中提取基因組DNA,進(jìn)行高通量測(cè)序分析，或克隆DNA到適宜的載體，導(dǎo)入宿主菌體，篩選目的轉(zhuǎn)化子等工作。特定生物種基因組研究使人們的認(rèn)識(shí)單元實(shí)現(xiàn)了從單一基因到基因集合的轉(zhuǎn)變，宏基因組研究將使人們擺脫物種界限，揭示更高更復(fù)雜層次上的生命運(yùn)動(dòng)規(guī)律。在現(xiàn)在的基因構(gòu)造功效認(rèn)識(shí)和基因操作技術(shù)背景下，細(xì)菌宏基因構(gòu)成為研究和開(kāi)發(fā)的重要對(duì)象。細(xì)菌宏基因組細(xì)菌人工染色體文庫(kù)篩選和基因系統(tǒng)學(xué)分析使研究者能更有效地開(kāi)發(fā)細(xì)菌基因資源，更進(jìn)一步地洞察細(xì)菌多樣性。如宏基因構(gòu)成為生物催化劑的新來(lái)源。宏基因組學(xué)研究的方略和基本過(guò)程研究方略“宏基因組學(xué)”是一種整體性的研究方略，它建立在微生物基因組學(xué)的快速發(fā)展和聚合酶鏈?zhǔn)椒从硰V泛應(yīng)用的基礎(chǔ)之上，是一種不依賴于人工培養(yǎng)的微生物基因組分析技術(shù)，涵蓋了生物信息統(tǒng)計(jì)分析和基因組兩方面的意義和技術(shù)，其方略是從特定環(huán)境中直接分離全部微生物DNA，將大片段的DNA克隆到受體菌中體現(xiàn)，然后根據(jù)某些生物活性篩選有應(yīng)用價(jià)值的克隆。涉及兩個(gè)方面[920]：①宏基因組文庫(kù)的構(gòu)建：宏基因組文庫(kù)的構(gòu)建沿用了分子克隆的基本原理和技術(shù)辦法，并根據(jù)具體環(huán)境樣品的特點(diǎn)和建庫(kù)目的采用了某些特殊的環(huán)節(jié)和對(duì)策。普通涉及樣品總DNA的提取、與載體連接和在宿主細(xì)胞建立中克隆[17]。②宏基因組文庫(kù)的篩選：根據(jù)其研究目的，宏基因組文庫(kù)篩選普通有功效篩選(functionalscreening)和序列篩選(sequencebasedscreening)兩種辦法。2宏基因組學(xué)的研究環(huán)節(jié)基因組學(xué)的研究過(guò)程，普通涉及從環(huán)境樣品中提取基因組DNA，克隆DNA到適宜的載體，導(dǎo)入宿主菌體，篩選目的克隆等4個(gè)環(huán)節(jié)。特別要指出的是，在基因組學(xué)研究領(lǐng)域中，其研究目的普通是測(cè)定單一物種的基因組序列；而在宏基因組學(xué)中，則是要測(cè)定由多個(gè)微生物構(gòu)成的復(fù)雜群體(community)的混合基因組序列。這種差別的核心就是，絕大多數(shù)細(xì)菌是不可培養(yǎng)的，因此沒(méi)有足夠的研究材料。2.1分離特定環(huán)境生物DNA辦法上不同于傳統(tǒng)的先培養(yǎng)微生物再提取DNA的做法，而是首先直接受集能夠代表特定生物環(huán)境生物多樣性的樣品；然后運(yùn)用多個(gè)理化辦法破碎微生物，使其釋放DNA，再運(yùn)用密度梯度離心等辦法進(jìn)行分離純化。2.2純化的大分子量DNA進(jìn)行克隆在對(duì)DNA酶切或者超聲打斷解決，并與適宜的載體DNA進(jìn)行連接，構(gòu)建重組體。2.3將帶有宏基因組DNA的載體通過(guò)轉(zhuǎn)化方式轉(zhuǎn)入模式微生物建立各自的無(wú)性繁殖系例如轉(zhuǎn)入大腸埃希菌中，使那些以前無(wú)法研究的不可培養(yǎng)微生物的DNA在模式微生物中得到復(fù)制、體現(xiàn)，進(jìn)而得到研究。全部帶有宏基因組DNA載體的模式微生物克隆構(gòu)成宏基因組文庫(kù)。2.4對(duì)宏基因組文庫(kù)的DNA進(jìn)行分析基于不同的研究目的，有諸多分析辦法，重要分為兩類：一類為表型功效篩選，即運(yùn)用模式微生物表型的變化篩選某些目的基因。例如從文庫(kù)中篩選能體現(xiàn)抗菌物質(zhì)的克隆。功效分析法根據(jù)重組克隆產(chǎn)生的新活性進(jìn)行篩選，可用于檢測(cè)編碼新型酶的全部新基因或者獲取新的生物活性物質(zhì)。另一類為序列基因型分析，即對(duì)文庫(kù)中全部或部分的DNA進(jìn)行測(cè)序分析，以應(yīng)用于生態(tài)學(xué)研究。例如分析文庫(kù)中16SrRNA序列，對(duì)所碩士態(tài)環(huán)境的多樣性進(jìn)行評(píng)定。一種典型的宏基因組分析涉及多個(gè)輪次，以確保從生態(tài)環(huán)境標(biāo)本中分離到目的基因，及盡量多地分析DNA序列所編碼的信息。3宏基因組學(xué)的技術(shù)辦法宏基因組學(xué)是一種以環(huán)境樣品中的微生物群體基因組為研究對(duì)象，以功效基因篩選和測(cè)序分析為研究手段，以微生物多樣性、種群構(gòu)造、進(jìn)化關(guān)系、功效活性、互相協(xié)作關(guān)系及與環(huán)境之間的關(guān)系為研究目的的新的微生物研究辦法。宏基因組學(xué)的研究方略和辦法大致相似，現(xiàn)按照宏基因組學(xué)研究的基本過(guò)程和方略對(duì)慣用辦法和技術(shù)予以簡(jiǎn)要介紹。3.1樣品總DNA的提取及基因或基因組DNA的富集提取的樣品DNA必須能夠代表特定環(huán)境中微生物的種類，盡量代表自然狀態(tài)下的微生物原貌，獲得高質(zhì)量環(huán)境樣品中的總DNA是宏基因組文庫(kù)構(gòu)建的核心之一。要采用適宜的辦法，既要盡量地完全抽提出環(huán)境樣品中的DNA，又要保持較大的片段以獲得完整的目的基因或基因簇[45]。因此總的提取總是在最大提取量和最小剪切力之間折中。應(yīng)嚴(yán)格操作，謹(jǐn)防污染，并且保持DNA片段的完整和純度。已有許多商品化宏基因組DNA提取試劑盒可用，同時(shí)諸多實(shí)驗(yàn)室仍致力于宏基因組DNA提取辦法的改善[68]。慣用的提取辦法有直接裂解法和間接提取法(細(xì)胞提取法)。直接裂解法是將環(huán)境樣品直接懸浮在裂解緩沖液中解決，繼而抽提純化，涉及物理法(如凍融法、超聲法、玻璃珠擊打法、液氮研磨法等)和化學(xué)法、酶法等。不同直接裂解法的提取辦法差別在于細(xì)胞破壁的方式不同。此法操作容易、成本低、DNA提取率高、重復(fù)性好，但由于強(qiáng)烈的機(jī)械剪切作用，所提取的DNA片段較小(1-50kb)，難以完全去除酚類物質(zhì)。細(xì)胞提取法先采用物理辦法將微生物細(xì)胞從環(huán)境中分離出來(lái)，然后采用較溫和的辦法抽提DNA，如先采用密度梯度離心分離微生物細(xì)胞，然后包埋在低熔點(diǎn)瓊脂糖中裂解，脈沖場(chǎng)凝膠電泳回收DNA。此法可獲得大片段DNA(20-500kb)且純度高，但操作繁瑣，成本高，有些微生物在分離過(guò)程中可能丟失，溫和條件下某些細(xì)胞壁較厚的微生物DNA也不容易抽提出來(lái)。為了更加好地反映環(huán)境中的微生物種群并且提高陽(yáng)性克隆的占有率，需要在克隆之前通過(guò)不同的辦法對(duì)感愛(ài)好的目的基因或基因組進(jìn)行富集[911]，一種比較好的富集辦法是穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)[12]?？酥菩韵麥p雜交技術(shù)[13]是克制性與消減雜交技術(shù)相結(jié)合的更簡(jiǎn)樸、更快速的分離差別基因的辦法。該辦法不僅運(yùn)用了消減雜交技術(shù)的消減富集，同時(shí)也運(yùn)用了克制性技術(shù)進(jìn)行了高效率的動(dòng)力學(xué)富集，因此該技術(shù)是一項(xiàng)富集特定基因、證明微生物之間基因不同的非常有用的技術(shù)辦法。3.2宏基因組文庫(kù)的建立宏基因組文庫(kù)的構(gòu)建方略取決于研究的整體目的。偏重于低拷貝、低豐度基因還是高拷貝、高豐度基因要取決于研究的目的是單個(gè)基因或基因產(chǎn)物還是整個(gè)操縱子及編碼不同代謝途徑的基因簇?；蛭膸?kù)的建立過(guò)程中需要選擇適宜的克隆載體和宿主菌株。傳統(tǒng)的辦法是直接運(yùn)用體現(xiàn)載體構(gòu)建宏基因文庫(kù)，但是體現(xiàn)載體可插人的宏基因片段普通不大于10kb?？寺≈兴拗骶甑倪x擇重要考慮到轉(zhuǎn)化效率、宏基因的體現(xiàn)、重組載體在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定性以及目的性狀的篩選等?，F(xiàn)在大腸桿菌是最為慣用的宿主[14]，另外，鏈霉菌和假單胞菌也能夠作為構(gòu)建文庫(kù)的宿主，不同微生物種類所產(chǎn)生的活性物質(zhì)有明顯差別，不同的研究目的應(yīng)選擇不同的宿主菌株。3.3宏基因組文庫(kù)的篩選由于環(huán)境基因組的高度復(fù)雜性，需要通過(guò)高通量和高敏捷度的辦法來(lái)篩選和鑒定文庫(kù)中的有用基因。篩選技術(shù)大致可分為四類:①基于核酸序列差別分析；②基于目的克隆功效的特殊代謝活性；③基于底物誘導(dǎo)基因的體現(xiàn)；④基于涉及穩(wěn)定性同位素和熒光原位雜交在內(nèi)的其它技術(shù)。.3.1基于序列的篩選辦法普通根據(jù)已知有關(guān)功效基因的保守序列設(shè)計(jì)探針或PCR引物，通過(guò)雜交或PCR擴(kuò)增篩選陽(yáng)性克隆。用這種辦法有可能篩選到某一類與已知序列相近的新基因，這一方略能夠分離已知基因家族的新組員和含有高度保守區(qū)的酶基因[1516]。另一種辦法是對(duì)含有16SrRNA等系統(tǒng)進(jìn)化錨定基因的克隆進(jìn)行測(cè)序或?qū)ξ膸?kù)隨機(jī)測(cè)序[17]。優(yōu)點(diǎn)是不必依賴宿主菌株來(lái)體現(xiàn)克隆基因，缺點(diǎn)是必須對(duì)有關(guān)基因序列有一定的理解，文庫(kù)中那些和現(xiàn)有基因序列完全不同的基因無(wú)法被篩選，故難以發(fā)現(xiàn)全新的活性物質(zhì)，對(duì)鑒定新的基因組員有一定的局限性，也很難獲得全序列。直接序列分析法(sequencedrivenscreeningmethod)是對(duì)所構(gòu)建宏基因組文庫(kù)的克隆進(jìn)行隨機(jī)測(cè)序分析，顯然能夠得到最多的信息[1820]。也可用鳥(niǎo)槍法對(duì)宏基因組文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，但需要進(jìn)行大量的測(cè)序和分析工作，需大量人力、物力及財(cái)力。即使DNA序列分析技術(shù)不停發(fā)展，但與個(gè)體微生物基因相比，宏基因組文庫(kù)包含著巨大的序列片段，但對(duì)這些序列片段進(jìn)行后續(xù)的分析則極為困難，結(jié)合其它的篩選辦法能夠得到更多的信息。用微陣列技術(shù)(基因芯片)進(jìn)行初步篩選，能夠很大程度上減少測(cè)序量和后續(xù)的序列拼接等工作量。但微陣列技術(shù)在用于宏基因組文庫(kù)篩選時(shí)，除了其本身由于交互雜交等造成的特異性低、敏捷度較差等缺點(diǎn)外，同樣不能用于對(duì)未知功效基因的篩選，且檢測(cè)不到環(huán)境中存在的那些低豐度微生物的序列[2122]。3.3.2基于功效的篩選辦法功效性篩選法是以活性測(cè)定為基礎(chǔ)，通過(guò)建立和優(yōu)化適宜的辦法從基因組文庫(kù)中獲得含有特殊功效的克隆，然后通過(guò)序列和生化分析研究這些克隆。由于基于活性的篩選不需要已知序列的信息，故能較快地找到可用于工農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥的蛋白質(zhì)和天然產(chǎn)物。功效性篩選的辦法有兩種，一種是對(duì)含有特殊功效的克隆子進(jìn)行直接檢測(cè)，如運(yùn)用其在選擇性培養(yǎng)基上(如含有化學(xué)染料和不可溶的或發(fā)光的酶反映底物)的表型特性進(jìn)行篩選[23]。這種辦法含有較高的敏捷度，可檢測(cè)到較少的目的克隆。另一種辦法是基于異源基因的宿主菌株與其突變體在選擇性條件下功效互補(bǔ)生長(zhǎng)的特性進(jìn)行[24]。功效性篩選法的優(yōu)點(diǎn)是篩選過(guò)程比較簡(jiǎn)樸、快速，只要基因能體現(xiàn)，就能夠根據(jù)基因體現(xiàn)特性進(jìn)行篩選，不需要復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)過(guò)程。局限性之處是這種篩選辦法依賴于目的基因在新的宿主中體現(xiàn)，但使用模式微生物并不能把全部的宏基因組DNA體現(xiàn)出來(lái)，并且規(guī)定克隆到基因或基因簇的全長(zhǎng)，一旦克隆過(guò)程中破壞基因某個(gè)組件將使得基因沒(méi)法體現(xiàn)，也就不能根據(jù)功效進(jìn)行篩選，故檢出的概率很低，工作量大，往往從上萬(wàn)個(gè)克隆中只能篩選到幾個(gè)有用的克隆。3.3.3底物誘導(dǎo)基因體現(xiàn)篩選(substrateinducedgeneexpressionscreening,SIGEX)SIGEX是用于能運(yùn)用多個(gè)底物誘導(dǎo)的分解代謝型基因的檢出，并結(jié)合生物發(fā)光技術(shù)用來(lái)篩選代謝有關(guān)基因及酶基因[25]。由于編碼有關(guān)代謝基因或酶基因普通呈簇存在，普通與該物質(zhì)誘導(dǎo)的啟動(dòng)子和同源轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列毗鄰，往往在有底物誘導(dǎo)的條件下才體現(xiàn)，反之則不體現(xiàn)。首先構(gòu)建一種含有綠色熒光蛋白(GFP)的體現(xiàn)載體，這個(gè)載體可將宏基因組DNA克隆到GFP基因上游，使該基因的體現(xiàn)受到宏基因組DNA片段中的啟動(dòng)子調(diào)控。當(dāng)外加目的底物時(shí)，能夠影響GFP的體現(xiàn)，進(jìn)而通過(guò)活細(xì)胞熒光分離技術(shù)(fluorescenceactivatedcellsorting,FACS)，在添加特定底物的條件下對(duì)體現(xiàn)庫(kù)進(jìn)行篩選，就能夠得到對(duì)該底物含有代謝活性的克隆。SIGEX在宏基因組研究中含有諸多優(yōu)勢(shì)，它提供了一種有效的和經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)手段，大大增加了篩選的容量和效率，節(jié)省了時(shí)間，為高通量篩選提供了保障，并且不需要對(duì)在顏色篩選中使用的底物進(jìn)行修改，勿需緊張因修改底物而產(chǎn)生毒性；且能夠從底物來(lái)推斷得出未知的酶，繼而推斷基因的功效。而SIGEX法的局限性之處是目的基因的構(gòu)造性和適應(yīng)性很敏感，同時(shí)，無(wú)法用于分析不能進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的底物，并且FACS對(duì)進(jìn)樣設(shè)備的規(guī)定也比較高；代謝特定底物的調(diào)控子和操縱子在位置上不一定都相鄰；同時(shí)有些基因的體現(xiàn)除了受底物誘導(dǎo)外，還可能受其它因子的誘導(dǎo)，而有些基因并不需要誘導(dǎo)，是本底水平體現(xiàn)的，有些可誘導(dǎo)基因在新的宿主中有可能不可被誘導(dǎo)體現(xiàn)。但是考慮到宏基因組文庫(kù)中含有大量的基因，其中必然有一部分是可誘導(dǎo)的，是能夠被該技術(shù)檢測(cè)到的。因此只要對(duì)這些局限性之處進(jìn)行優(yōu)化，選擇適宜的條件，SIGEX法仍然是一種宏基因組文庫(kù)篩選的有效辦法，特別適合于在工業(yè)上使用[26]。3.3.4基于穩(wěn)定性同位素技術(shù)篩選辦法含有相似原子序數(shù)但不同中子數(shù)目且不具放射性的元素稱為穩(wěn)定同位素(stableiso