熒光分光光度法測(cè)定面粉中核黃素VB2

熒光分光光度法測(cè)定面粉中核黃素（VB2）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?、?shí)驗(yàn)原理三、FL-4500型氣相色譜儀四、實(shí)驗(yàn)步驟五、數(shù)據(jù)處理六、思考題復(fù)旦化學(xué)系教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心包慧敏2023/11/161、掌握面粉樣品的消化方法，了解溶液的pH值等對(duì)核黃素?zé)晒鈴?qiáng)度的影響。2、了解熒光分光光度計(jì)的主要結(jié)構(gòu)及工作原理，掌握其正確使用方法。3、熒光分析法基本原理和學(xué)習(xí)測(cè)繪核黃素的激發(fā)光譜和熒光光譜，標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量分析。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?023/11/16二、實(shí)驗(yàn)原理1、熒光、熒光分子/熒光物質(zhì)2、熒光分析法：特點(diǎn)

、定量方法3、核黃素VB2：結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、

面粉中提取方法4、熒光分光光度計(jì)：結(jié)構(gòu)、原理、操作2023/11/16熒光產(chǎn)生的機(jī)制——去活化過程問題1.熒光、熒光分子2023/11/16強(qiáng)熒光物質(zhì)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：

→﹡、共軛

體系、剛性平面結(jié)構(gòu)、取代基如熒光素和酚酞結(jié)構(gòu)十分相似，熒光素在溶液中有很強(qiáng)的熒光，而酚酞沒有。

如芴和聯(lián)苯在相同的條件下，熒光量子產(chǎn)率約為1和0.182023/11/16影響熒光發(fā)射溶液環(huán)境因素p.362：（a）溶劑效應(yīng)：取決于熒光體和溶劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)、極性、重原子效應(yīng)（b）溫度：T

↑φf↓（c）pH平衡解離關(guān)系對(duì)

f.max、φf

均有影響溶液熒光的猝滅p.364熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或溶質(zhì)分子之間相互作用而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度下降的現(xiàn)象稱為熒光的猝滅（或熄滅）

引起熒光猝滅的物質(zhì)稱為熒光猝滅劑。2023/11/16問題2.分子熒光分析法2023/11/161.原子光譜與分子光譜

原子光譜：電子能級(jí)躍遷；

分子光譜：電子能級(jí)、振動(dòng)能級(jí)、轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)躍遷2.吸收光譜與發(fā)射光譜

吸收光譜：從低能級(jí)向高能級(jí)躍遷，使光的強(qiáng)度減弱；

發(fā)射光譜：從高能級(jí)躍遷回低能級(jí)，相應(yīng)的能量以光的形式輻射出來3.關(guān)系原子光譜：原子吸收光譜、原子發(fā)射光譜；分子光譜：分子吸收光譜（可見、紫外、紅外吸收光譜）光譜名稱的問題：2023/11/16原子光譜V.S.

分子光譜原子光譜/線光譜：電子躍遷能級(jí)（單重態(tài)、三重態(tài)）分子光譜/帶光譜：電子躍遷能級(jí)分子振動(dòng)能級(jí)分子轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)

2023/11/16激發(fā)光譜熒光光譜

em.max處IF～

ex吸收光譜V.S.

發(fā)射光譜2023/11/16圖15-3 三維熒光光譜的兩種表示（b）等高線光譜圖

（a）等角三維投影圖 分子熒光光度法的一些基本概念激發(fā)光譜、熒光光譜、三維熒光光譜用途？2023/11/16熒光強(qiáng)度

IF與熒光物質(zhì)的溶液濃度

c

成線性關(guān)系

IF=2.3

FI0

bc

b

—

試樣的吸收光程

—

摩爾吸光系數(shù)

F

—熒光發(fā)射的量子產(chǎn)率IF—

熒光強(qiáng)度當(dāng)I0及b一定稀溶液中c

—

試樣濃度IF=kcI0—

入射光強(qiáng)度

熒光定量分析的基礎(chǔ)2023/11/16標(biāo)準(zhǔn)曲線法（工作曲線法）1.最大激發(fā)波長(zhǎng)、最大吸收波長(zhǎng)的選擇；2.系列標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制工作曲線；3.測(cè)定未知溶液，查得其濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線法求解K：（1）圖解法（2）解析法2023/11/16靈敏度高：測(cè)定下限在0.1~0.001

g/mL，比分光光度法高2~4個(gè)數(shù)量級(jí)。光強(qiáng)I與I0的信號(hào)差別～熒光發(fā)射的光強(qiáng)選擇性高：適當(dāng)選擇激發(fā)光波長(zhǎng)和熒光測(cè)定波長(zhǎng)

產(chǎn)生熒光的化合物有限，不及分光光度法廣泛，干擾物質(zhì)較少分子熒光分光光度法v.s.紫外-可見分光光度法2023/11/16三、F-4500型熒光分光光度計(jì)比色皿：

？樣品槽：2023/11/16F-4500型熒光分光光度計(jì)光路圖2023/11/161、開機(jī)Power-Xelamp-Main啟動(dòng)軟件FLSolutionsProgramF-4500型熒光分光光度計(jì)的使用2023/11/162、波長(zhǎng)掃描wavelength??ScanStart—Method—Sample—Pre-scan—Measure—數(shù)據(jù)處理—ReportMethod:F-4500型熒光分光光度計(jì)的使用2023/11/161、試樣溶液制備

2、實(shí)驗(yàn)條件的選擇

3、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及樣品的測(cè)定四、實(shí)驗(yàn)步驟2023/11/16關(guān)于核黃素VB2、面粉中提取方法面粉主要成分淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)、維生素等。《營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化面粉國家標(biāo)準(zhǔn)》面粉中核黃素含量1×10-6～5×10-4g/L，回收率為98%～105%.方法檢出限4×10-8g/L核黃素又稱維生素B2，維他命B2

RiboflavineC17H20O6N4微溶于水；對(duì)空氣、氧氣穩(wěn)定，對(duì)光敏感，在430~440nm藍(lán)光照射下會(huì)在525nm附近發(fā)綠色熒光；在pH6~7的水溶液中熒光最強(qiáng)，在pH為11時(shí)熒光消失。2023/11/16面粉10g400mL燒杯加0.1mol/L鹽酸100mL冷卻后，用NaOH調(diào)至pH6.0-6.5，然后立即加稀鹽酸至pH4.5將混合物定量轉(zhuǎn)移至250mL容量瓶，用(5:95)醋酸溶液定容。離心取清液，避光，待測(cè)1、試樣溶液制備劇烈攪拌，倒入150mL沸水，維持微沸30min并攪拌使均勻分散核黃素在堿性溶液中不穩(wěn)定，要邊加邊搖防止局部堿性過強(qiáng)加1滴丁醇配平，離心取上清2023/11/16（1）激發(fā)光波長(zhǎng)、熒光波長(zhǎng)選擇吸取核黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液1mL于25mL容量瓶，用(5:95)醋酸溶液定容。暫設(shè)定熒光波長(zhǎng)即發(fā)射光波長(zhǎng)EX:525nm,在400-500nm波長(zhǎng)范圍對(duì)激發(fā)波長(zhǎng)進(jìn)行掃描，記錄激發(fā)光譜曲線；取最大激發(fā)波長(zhǎng)EM,在400-500nm波長(zhǎng)范圍對(duì)熒光波長(zhǎng)進(jìn)行掃描，記錄熒光光譜曲線。確定最佳激發(fā)光波長(zhǎng)、熒光波長(zhǎng)（2）酸度選擇取三個(gè)25mL容量瓶，各加入核黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液1mL，然后分別用1:1鹽酸，(5:95)醋酸，5%NaOH溶液稀釋到刻度。分別測(cè)定溶液pH值，測(cè)定熒光強(qiáng)度，考察酸度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響，從中確定最佳酸度。2、實(shí)驗(yàn)條件的選擇3、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及樣品的測(cè)定2023/11/16五、數(shù)據(jù)處理1、從熒光光譜圖上讀出最大激發(fā)（λex）和發(fā)射波長(zhǎng)（λem）2、軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線法3、計(jì)算面粉提取液中維生素B2的含量2023/11/16本實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)1）溶液的配制：鹽酸濃度，NaOH調(diào)節(jié)pH理論計(jì)算等2）標(biāo)準(zhǔn)溶液移取與稀釋操作3）系列標(biāo)液的測(cè)定順序4）樣品保存，防止光降解5）熒光儀的開關(guān)機(jī)順序2023/11/16六、思考題1.在熒光測(cè)量中，為什么激發(fā)光的入射與熒光的接收不在一直線上，而呈一定角度？2.試述熒光分光光度計(jì)與紫外-可見分光光度計(jì)在結(jié)構(gòu)上的有哪些不同點(diǎn)？3.定量測(cè)定維生素B2可用的方法有哪些？試比較各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)。2023/11/16氧化型還原型？問題3

面粉的主要成分？？？淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)、維生素等。《