法醫(yī)物證學(xué)課件

第一部DNA基礎(chǔ)

一、DNA結(jié)構(gòu)與特征

1.DNA分子結(jié)構(gòu)

線性大分子-基本單位為脫氧核苷酸組成----堿基、脫氧核糖、磷酸差別----堿基：嘌呤堿—腺嘌呤（A）與鳥嘌呤（G）

嘧啶堿—胞嘧啶（C）與胸腺嘧啶（T）結(jié)構(gòu)：堿基+脫氧核糖=脫氧核苷-+磷酸=脫氧核苷酸

2.DNA理化性質(zhì)1）

DNA的變性變性（denaturation）:在一定條件下，DNA雙鏈間氫鍵斷裂，形成單鏈結(jié)構(gòu)的過(guò)程。也稱退火（annealing）。條件：A：溫度上升----Tm值(meltingtemperature)50%DNA分子解鏈的溫度。與GC/TA比值有關(guān)。1%GC-0.4℃。B：堿性升高---0.5NNaOH-完全解鏈。2）DNA的復(fù)性復(fù)性（renaturation）撤除變性條件后，變性的單鏈DNA根據(jù)堿基互補(bǔ)的原則，恢復(fù)成DNA雙鏈的過(guò)程。條件：A：溫度降低—過(guò)低易錯(cuò)配。過(guò)高不易復(fù)性。

B：高離子強(qiáng)度。3）DNA分子雜交雜交（hybridization）：來(lái)源不同的兩條DNA單鏈根據(jù)堿基互補(bǔ)的原則，形成雙鏈雜種DNA的過(guò)程。二、基因

1.基因與基因組

基因（gene）：合成有功能的蛋白質(zhì)多肽鏈或RNA所需的全部核苷酸序列基因組（genome）：一個(gè)生物體的所有基因。核基因組：細(xì)胞核中23對(duì)染色體包含的所有基因線粒體基因組：線粒體DNA中的所有基因

2.

基因結(jié)構(gòu)

結(jié)構(gòu)基因：能夠編碼產(chǎn)生蛋白質(zhì)產(chǎn)物的基因。外顯子（exon）：編碼序列。內(nèi)含子(intron)：非編碼序列（間隔列）。如β珠蛋白-1700堿基（bp），編碼146個(gè)氨基酸，3個(gè)外顯子，2個(gè)內(nèi)含子。3.基因突變

突變（mutation）：DNA分子中的核苷酸序列的改變。1）點(diǎn)突變（pointmutation）：?jiǎn)螇A基置換。同義突變（samesensemutation）:簡(jiǎn)并密碼，無(wú)突變效應(yīng)。錯(cuò)義突變(missensemutation)：新密碼子，氨基酸序列變化，產(chǎn)生突變效應(yīng)。無(wú)義突變(non-sensemutation)：變成終止密碼，合成不完整多肽產(chǎn)生突變效應(yīng)。終止密碼突變（terminatorcodonmutation)：合成過(guò)長(zhǎng)的多肽，產(chǎn)生突變效應(yīng)。移碼突變（frame-shiftmutation)：DNA鏈中插入1個(gè)或幾個(gè)單堿對(duì)，使突變處以下部位密碼發(fā)生變化，使合成的氨基酸種類或序列變化，產(chǎn)生突變效應(yīng)。2）片段突變：DNA鏈中小片段單堿序列發(fā)生缺失、重復(fù)或重排，產(chǎn)生突變效應(yīng)。單堿基突變(圖中用黑點(diǎn)示意位置為突變點(diǎn))三、DNA多態(tài)性的分類

1）長(zhǎng)度多態(tài)性：等位基因片段長(zhǎng)度的個(gè)體差別。由一特定序列，首尾相連串聯(lián)重復(fù)次數(shù)不同產(chǎn)生的個(gè)體差別?？勺償?shù)目串聯(lián)重復(fù)（variablenumberoftandemrepeat,VNTR）

短串聯(lián)重復(fù)(shorttandemrepeat,STR)A：產(chǎn)生原因：DNA滑動(dòng)與同源染色體不等交換。

B：差別：VNTRSTR

重復(fù)序列組成2-7bp7-數(shù)十bp

重復(fù)序列數(shù)目2-10數(shù)個(gè)10數(shù)個(gè)-數(shù)百個(gè)鑒別能力高極高優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增現(xiàn)象不明顯極明顯檢測(cè)靈敏度極高稍差片段總長(zhǎng)度200-500bp數(shù)千以上bpC：STR的命名：非編碼區(qū)-D3S1358

D3第三號(hào)染色體S單拷貝（singlecopy）1358

VNTR序列的發(fā)現(xiàn)序號(hào)

編碼區(qū)內(nèi)含子-HumHPRTB

次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因（hypoxanthinephosphoribosyltransferase）

1）序列多態(tài)性：DNA片段堿基排列順序的個(gè)體差別。單核苷酸多態(tài)性（singleucleotidepolymorphism,SNPs）原因：堿基的置換、插入、缺失。特點(diǎn)：多位于非編碼區(qū)，選擇壓力。數(shù)量多，1/1000bp，300萬(wàn)二態(tài)性，2個(gè)等位基因，多態(tài)性程度較低。孤立事件，人類遺傳學(xué)意義大。第二部分DNA的制備

核心與關(guān)鍵

腦>肺>肌肉>腎6pg/細(xì)胞一、

理想DNA樣品的要求

1.

純度-RNA、蛋白質(zhì)、多糖、脂類。2.

完整性-DNA大分子。3.

DNA量。Μg/指紋圖；ng/PCR；pg/PCR二、

經(jīng)典DNA提取法

1.

在弱堿和螯合劑的條件下行組織勻漿，溶解胞、核膜。2.

去垢劑與蛋白酶消化蛋白，分離DNA。3.

有機(jī)溶劑去除蛋白，萃取DNA。4.

乙醇與鹽類沉淀DNA。三、

試劑的使用原理

1.

弱堿和螯合劑：Tris-HClpH8.0，DNA分子穩(wěn)定。

EDTA（乙二胺四乙酸）-抑制核酸酶。通過(guò)螯合鎂離子。2.

去垢劑與蛋白酶：SDS（十二烷基磺酸鈉）：增加膜通透性；促進(jìn)DNA與蛋白質(zhì)分解；促使核酸酶與蛋白質(zhì)變性。蛋白酶K：酶解組蛋白。3.

有機(jī)溶劑：酚-變性沉淀蛋白質(zhì)，組蛋白、蛋白酶等。

PH6.0，需Tris-HClpH8.0平衡。氯仿-變性沉淀蛋白質(zhì)，除酚，水相分離。異戊醇-除酚，除泡沫。4.

乙醇與鹽類：DNA不溶于乙醇與鹽類。四、

基本步驟1.

樣品處理-分離細(xì)胞，低滲鹽水或細(xì)胞懸浮液。10mmol/LTris-HClpH8.0,0.1mol/LEDTA,20mg/ml胰RNA酶,0.5%SDS.2.

消化-TNE（15mmol/LTris-HClpH8.0,15mmol/LEDTA,5mmol/LNaCl）4ml，10%SDS0.45ml，10mg/ml蛋白酶K（終濃度100μg/ml）混勻，50℃3h，45℃過(guò)夜。3.

DNA提取-等體積飽和酚-等體積飽和酚/氯仿/異戊醇（25/24/1）-氯仿/異戊醇（24/1）。500r/min,10min.4.

沉淀DNA-1/10體積3mol/LNaAc，2倍無(wú)水乙醇-70%乙醇。室溫?fù)]干。5.

溶解DNA-適量TE（10mmol/LTris-HClpH8.0,1mmol/LEDTA,長(zhǎng)時(shí)間。五、其他方法

1.Chelex-100提取DNA基本成分：含有亞氨基二乙酸鹽離子的苯乙烯-二乙基苯共聚物?；痉椒ǎ撼恋砑?xì)胞；5%試劑200μl；56℃0.5h以上；100℃8min；劇烈震蕩；離心上清。注意：離心徹底。2.硅珠法提取DNA基本成分：GuSCN（硫氰酸胍，蛋白變性劑）與二氧化硅（硅珠，核酸吸附劑）。基本方法：血液（1-4μl）TES（100μl）SDS（20μl）煮沸5min；300μlGuSCN溶液與20μl硅珠液保溫15min；離心；離心加GuSCN溶液；離心加乙醇漂洗；TES56℃10min離心取上清。3.直接煮沸法，100℃10min六.注意事項(xiàng)1.

如消化不完全，可用TNE溶解后再重提。2.

消化時(shí)間宜長(zhǎng)不宜短。3.

操作輕柔。4.

混勻要充分。5.

揮干不宜過(guò)度。七.不同生物性檢材的DNA制備

1.混合斑二步提取法（精液與陰道液）

原理：精子細(xì)胞膜富含硫醇蛋白，包裹DNA的魚精蛋白富含半光氨酸，二硫鍵豐富，可抵抗蛋白酶作用。二硫蘇糖醇（DTT）可還原二硫鍵，使蛋白酶發(fā)生作用。方法:(1)分離細(xì)胞成分。

(2)常規(guī)消化。

(3)加10%SDS40μl，1mol/LDTT16μl，10μg/μl蛋白酶K4μl，37℃過(guò)夜。

(4)常規(guī)處理。八.DNA定量

1.凝膠電泳半定量分析法標(biāo)準(zhǔn)參照分析。2.分光光度計(jì)分析原理：核酸于260nm波長(zhǎng)為吸收峰，1OD值為50μg/μl雙鏈核酸（40μg/μl單鏈核酸），根據(jù)OD值可計(jì)算DNA含量。蛋白于280nm波長(zhǎng)為吸收峰，260/280比檢測(cè)核酸純度。1.6-1.8九.DNA純化

第三部分聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction，PCR）在模板DNA和4種脫氧核苷酸存在的條件下，由一對(duì)特異性引物限定的靶DNA片段，經(jīng)DNA聚合酶催化的體外合成過(guò)程。一、

PCR的基本過(guò)程

1.變性（denaturation）:在加熱的條件下（94℃左右），模板DNA配對(duì)堿基間氫鍵斷裂，DNA雙鏈變成單鏈。

2.退火（annealing）：在降溫的條件下（55℃-62℃），引物與其互補(bǔ)的模板DNA結(jié)合形成雜交雙鏈。

3.延伸（extension）：在合適的溫度下（68℃-72℃），經(jīng)DNA聚合酶催化4種脫氧核苷酸，由引物的3ˊ端為起始點(diǎn)，從5ˊ向3ˊ端延伸，合成新的與模板DNA互補(bǔ)的DNA鏈。每反應(yīng)一個(gè)循環(huán)，靶DNA片段數(shù)量增加一倍，并以指數(shù)的量堆積，經(jīng)30余次循環(huán)，產(chǎn)物量可達(dá)到2×105-7個(gè)拷貝。幾個(gè)循環(huán)后擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板。二、PCR反應(yīng)的體系標(biāo)準(zhǔn)體系為50-100μl，常用20μl。DNA模板/DNA聚合酶/一對(duì)引物/4種脫氧核苷酸/緩沖液。反應(yīng)條件：95℃4-5min,94℃30s,55℃-62℃30s,72℃30-60s,30循環(huán)后72℃5-10min。三、試劑的要求：

1.引物：人工合成的單鏈DNA。A：長(zhǎng)度15-30bp。Ln=2×(G+C)+(A+T)<38,延伸溫度大。

B：內(nèi)部的互補(bǔ)序列。

C：引物間的互補(bǔ)序列。

D：序列的隨機(jī)。

E：識(shí)別序列的單拷貝。引物決定特異性。

F：濃度：02-1μmol/L。G：應(yīng)純化低溫保存。2.DNA模板

A：量10ng左右。

B：純，無(wú)污染。3.DNA聚合酶

A：根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)要求選擇。

B：注意外切酶活性，5-3或3-5。

C：活性最適溫度70-75℃，半衰期一般95℃40min92℃130minD：鎂離子依賴。

第六章DNA多態(tài)性分型方法

一、長(zhǎng)度多態(tài)性分型擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（amplifiedfragmentlengthpolymorphisms,Amp-RLP）。主要指VNTR和STR1.步驟（1）PCR擴(kuò)增，遺傳標(biāo)記特異性由特異性引物決定。（2）電泳分離PCR產(chǎn)物

A：凝膠：聚丙烯酰氨凝（polyacrylamidegel,PAG），成分：丙烯酰氨與甲叉丙烯酰氨凝膠濃度（T）：6-8%，與分析的片段大小有關(guān)。交聯(lián)度（C）：3%，甲叉/丙烯酰氨與甲叉

B:載樣緩沖液：甘油（蔗糖）密度重力，防擴(kuò)散。泳速指示劑：溴酚藍(lán)（5%，65bp）

二甲苯青（5%，260bp）C：電壓：100-200V（3）譜帶顯示：

A：溴乙啶染色：ethidiumbromide,EB,嵌合與DNA雙鏈間，紫外線激發(fā)紅色熒光。注意：強(qiáng)致變劑。可加凝膠中或后染色。

B：銀染色：AgNO3，Ag+可與DNA穩(wěn)定結(jié)合，甲醛還原Ag+顆粒，顯黑褐色。比溴乙啶敏感度高。

C：熒光顯色:(P78)染料標(biāo)記在引物5ˊ端，激光激發(fā)。（4）基因型判定：根據(jù)等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物（alleleladder）或片段長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)物(molecularmarker)同步電泳比對(duì)判型。等位基因命名根據(jù)重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)。注意事項(xiàng)：出現(xiàn)3條譜帶或3個(gè)峰時(shí)，污染、混合樣品、變異。2.STR基因座的選擇：

A：重復(fù)序列為4個(gè)堿基。

B：等位基因數(shù)量在10個(gè)左右。

C：基因座距離足夠遠(yuǎn)。

D：引物識(shí)別序列盡可能單拷貝。

E：PCR產(chǎn)物在100bp-300bp之間。3.多基因座復(fù)合擴(kuò)增檢測(cè)

二、序列多態(tài)性分型（一）限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法

restrictionfragmentlengthpolymorphisms,RFLPs因DNA核苷酸序列的變異，使DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別部位產(chǎn)生、消失或移位，致使酶切片段長(zhǎng)度和/或數(shù)量發(fā)生變化而呈現(xiàn)的DNA多態(tài)性。1.限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性的DNA基礎(chǔ)（1）

識(shí)別部位的點(diǎn)突變：堿基的替換、修飾（甲基化）或插入與缺失。（2）

識(shí)別部位間的片段插入與缺失。（3）

識(shí)別部位間的重復(fù)序列數(shù)目的變化。2.DNA限制性內(nèi)切酶restrictionendonuclease能夠識(shí)別特定的DNA序列，與DNA分子結(jié)合后在特定部位將DNA雙鏈切斷的核酸水解酶。（1）生物學(xué)功能：水解核酸的磷酸二酯鍵。（2）命名：根據(jù)微生物的種（第一個(gè)字母大寫）、屬（前二個(gè)字母小寫）、變種第一個(gè)字母大寫）、發(fā)現(xiàn)分離的順序（羅馬數(shù)字）。（3）分類：A：Ⅰ型：遠(yuǎn)離識(shí)別部位隨即切割，非特異。

B：Ⅱ型：在識(shí)別部位內(nèi)部切割，特異。

C：Ⅲ型：在識(shí)別部位后定點(diǎn)切割，特異。單位：1U：在標(biāo)準(zhǔn)條件下，1h完全水解1μgλ噬菌體的酶量。Ⅱ型DNA限制性內(nèi)切酶：A：識(shí)別核酸序列數(shù)目4-6個(gè)。B：識(shí)別序列為回紋序列。C：切割后產(chǎn)生的末端分為粘行末端與平末端。例：PstⅠ5ˊ-C↓TGCAG-3ˊ3ˊ-GACGT↑C-5ˊHaeⅢ5ˊ-GG↓CC-3ˊ3ˊ-CC↑GG-5ˊ3.分型法：

酶+緩沖液+樣品----一定的溫度----電泳檢測(cè)。4.注意事項(xiàng)：A：星號(hào)活力。

B：消化時(shí)間宜長(zhǎng)不宜段。

C：陽(yáng)性可肯定序列，陰性序列不定。（二）等位基因特異性寡核苷酸探針雜交分析法

allelespecificoligonucleotide,ASO根據(jù)鹼基互補(bǔ)的原則,制備識(shí)別特定寡核苷酸序列的單鏈DNA探針,并標(biāo)記示蹤物,在高強(qiáng)度條件下與變性DNA樣品雜交,檢測(cè)示蹤物,陽(yáng)性者為檢出相應(yīng)的等位基因。

1.

相關(guān)概念：A：雜交：兩條異源寡核苷酸單鏈按照鹼基互補(bǔ)的原則復(fù)性為雙鏈的過(guò)程。B：探針：標(biāo)記有示蹤物，能夠識(shí)別靶核苷酸序列并與之退火雜交的具有以知序列的寡核苷酸單鏈。2.探針的條件:A:長(zhǎng)度為20bp左右。B：具備高度特異性。C：容易標(biāo)記示蹤物。D：在雜交過(guò)程中本身性質(zhì)穩(wěn)定。3.對(duì)示蹤物的要求A:高靈敏度。B:不影響探針的特異性。C:不影響探針的雜交特性。D：不改變本身的特性。E：檢測(cè)方法特異。F：安全可靠無(wú)公害。G：檢測(cè)方法簡(jiǎn)單，重復(fù)性好。4.示蹤物的種類A：放射性同位素--靈敏度高，有放射性污染。B：非放射性同位素：半抗原生物素?zé)晒馕镔|(zhì)酶—常見辣根過(guò)氧花物酶堿性磷酸酶5.檢測(cè)方法—斑點(diǎn)印跡雜交dotblothybridization

反向斑點(diǎn)雜交reversedotblot6.基本操作過(guò)程A：固相濾膜印跡-打點(diǎn)、Southern轉(zhuǎn)移、真空轉(zhuǎn)移、電轉(zhuǎn)移。常用尼龍膜。B：DNA變性—堿變性、紫外線照射、真空烘烤。C：預(yù)雜交—封閉D：雜交：高強(qiáng)度雜交-溫度高，離子強(qiáng)度低。特異不利于復(fù)性。低強(qiáng)度雜交-溫度低，離子強(qiáng)度高。利于復(fù)性不特異。E：漂洗F：示蹤物顯示。三、等位基因特異性PCR（序列特異性引物PCR）allelespecificPCR，ASPCR（sequencespecificprimers,SSP-PCR）基本原理：根據(jù)待測(cè)等位基因的堿基差異設(shè)計(jì)3條特異性引物，其中2條引物為上游（或下游）引物，其3端第1個(gè)堿基（或第2、3個(gè)堿基）分別與等位基因特異性堿基互補(bǔ)，作為等位基因特異性引物；1條下游（或上游）引物作為共通引物。分為兩個(gè)體系同時(shí)PCR擴(kuò)增，對(duì)比電泳，依據(jù)PCR產(chǎn)物的有無(wú)判定等位基因的型別，有PCR產(chǎn)物者為陽(yáng)性，證實(shí)該等位基因存在。

方法：1.設(shè)計(jì)3條引物，2條等位基因特異性引物，其5端長(zhǎng)度有差異（5端差4-6bp），與共通引物引物在1個(gè)體系中同時(shí)PCR擴(kuò)增，電泳后，依據(jù)PCR產(chǎn)物片段的有無(wú)與譜帶的位置判定等位基因的型別。2.同一片段多等位基因同時(shí)檢測(cè)：依據(jù)片段上等位基因數(shù)目，設(shè)計(jì)兩組多條等位基因特異性引物，分別與共通引物在1個(gè)體系中同時(shí)PCR擴(kuò)增，對(duì)比電泳后，依據(jù)PCR產(chǎn)物片段的有無(wú)與譜帶的位置判定等位基因的型別。3.不同染色體上多等位基因同時(shí)檢測(cè)：設(shè)計(jì)兩組多條等位基因特異性引物及相應(yīng)的共通引物，并在引物的5端人工設(shè)計(jì)10bp左右堿基序列，PCR產(chǎn)物對(duì)比電泳后，依據(jù)PCR產(chǎn)物片段的有無(wú)與譜帶的位置判定等位基因的型別。技術(shù)關(guān)鍵點(diǎn)：1.引物特異性堿基設(shè)計(jì)的位置。2.多位點(diǎn)復(fù)合擴(kuò)增的PCR反應(yīng)條件。四、隨機(jī)引物PCRrandomprimerPCR

特點(diǎn)：1.PCR反應(yīng)僅1條引物。2.引物堿基序列隨機(jī)。3.引物長(zhǎng)度10bp左右。4.復(fù)性溫度低。5.擴(kuò)增片段多,但符合孟德爾遺傳規(guī)律。6.可多引物復(fù)合擴(kuò)增,增加信息含量。7.重復(fù)性欠佳。五、PCR單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析PCR-singlestrandconformationpolymorphism,PCR-SSCP

1、基本原理：PCR產(chǎn)物熱變性后形成單鏈DNA，在非變性凝膠中，因DNA片段堿基排列順序的不同，單鏈DNA形成不同的（空間構(gòu)型，導(dǎo)致電泳遷移率的差別而呈現(xiàn)多態(tài)性，根據(jù)譜帶的位置判定型別。2、特點(diǎn)：A：樣品需要充分變性（加樣品緩沖液，沸水浴10min），并保持至電泳前。

B：電泳凝膠為非變性凝膠。

C：泳動(dòng)過(guò)程中溫度保持恒定。

D：分辨率高，可檢測(cè)出單一堿基變異，檢出率90%以上。

E：重復(fù)性稍差，多用于篩選實(shí)驗(yàn)。

F：不能確定突變堿基的種類與位置。

G：樣品片段應(yīng)短于500bp。H：電泳譜型可能出現(xiàn)四條片段（1處變異）：同源雙鏈；異源雙鏈；兩種堿基排列順序不同的單鏈DNA。六、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性檢測(cè)法amplifiedfragmentlengthpolymorphism,AMP-PCR1、基本原理：應(yīng)用一對(duì)特異性引物，選擇VNTR或STR基因座進(jìn)行PCR擴(kuò)增，由于基因座不同等位基因串聯(lián)重復(fù)次數(shù)的差異，導(dǎo)致PCR產(chǎn)物DNA片段數(shù)目與長(zhǎng)度不同，經(jīng)電泳后，依據(jù)譜帶的數(shù)目和位置判定型別。2、特點(diǎn)：A：操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好。

B：泳動(dòng)中根據(jù)等位基因標(biāo)準(zhǔn)品認(rèn)定型別。

C：可檢測(cè)的基因座數(shù)量多。

D：可將多基因座復(fù)合擴(kuò)增。[復(fù)合擴(kuò)增要求]：A：引物間無(wú)互補(bǔ)序列。

B：基因座不在同一染色體上，或距離足夠遠(yuǎn)。

C：不同基因座PCR產(chǎn)物片段長(zhǎng)度分布不交叉。

D：不同基因座PCR擴(kuò)增條件相近。

E：片段長(zhǎng)度差異不宜過(guò)大。（優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增）

F：變性膠檢測(cè)效果好。3、用于檢測(cè)的STR基因座選擇條件：

A：重復(fù)序列堿基數(shù)目3-5之間，易于分辨。

B：等位基因數(shù)目適中，10個(gè)左右。

C：各等位基因頻率分布均勻。

D：雜合度高。

E：擴(kuò)增片段長(zhǎng)度小于300bp。F：突變率低。

G：避免檢測(cè)連鎖的基因座.（影響計(jì)算結(jié)果）七、小衛(wèi)星重復(fù)單位變異分型ministatellitevariantrepeatmapping,MVR-PCR1、基本原理：部分VNTR基因座的重復(fù)序列存在堿基變異，據(jù)此設(shè)計(jì)相應(yīng)的序列特異性引物，與共通引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分泳道對(duì)比電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，根據(jù)譜帶的有無(wú)與位置編碼后判定型別。2、特點(diǎn)：A：DNA片段數(shù)目多，類似DNA指紋圖。

B：分辨率高，個(gè)人識(shí)別能力高。

C：編碼分型，不需標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。

D：普通檢測(cè)手段不能夠反映全基因狀況。

E：反映了基因座長(zhǎng)度多態(tài)性與已知序列多態(tài)性的性質(zhì)。

八、DNA序列分析（雙脫氧核苷酸末端終止法）

1、基本原理：在常規(guī)PCR反應(yīng)體系中加入四種2，3-雙脫氧單核苷酸，由1條引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，在正常的模DNA復(fù)制同時(shí)，當(dāng)有2，3-雙脫氧單核苷酸結(jié)合到產(chǎn)物3端后，下一個(gè)單核苷酸不能夠與之形成磷酸二酯鍵，使DNA片段延伸終止于該2，3-雙脫氧單核苷酸處，根據(jù)不同長(zhǎng)度含有2，3-雙脫氧單核苷酸片段的檢測(cè)結(jié)果判定PCR產(chǎn)物的單核苷酸序列。

2、特點(diǎn)：A：完全忠實(shí)地反映靶片段核苷酸排列順序。

B：測(cè)序反應(yīng)為1條引物（濃度低于常規(guī)PCR反應(yīng)）。

C：根據(jù)方法學(xué)，一次反應(yīng)可測(cè)200-500bp。D：產(chǎn)物分析分別有手工與機(jī)器自動(dòng)化方法。

第五部分DNA遺傳標(biāo)記的特殊意義一、線粒體DNA遺傳標(biāo)記的法醫(yī)學(xué)意義1.線粒體DNA（mitochondrialDNA,mtDNA）基本結(jié)構(gòu)特點(diǎn)環(huán)形雙鏈；無(wú)組蛋白而裸露；全長(zhǎng)16569bp；除基因區(qū)域外有5%-7%的D-環(huán)區(qū)（displacementloop），多態(tài)性高；單倍體無(wú)重組。2.線粒體DNA的特征與法醫(yī)學(xué)意義A：穩(wěn)定的母系遺傳：母系血緣親屬具有完全相同的mtDNA。適合特殊類型的親權(quán)鑒定（母-子；同胞兄妹；母系血緣）。B：拷貝數(shù)多：有利于微量檢材；檢測(cè)敏感度高。C：片段短：抗降解，有利于降解檢材，如角化組織（毛發(fā)等）。D：突變率高：多態(tài)性高，個(gè)人識(shí)別能力強(qiáng)。E：屬于序列多態(tài)性，檢測(cè)方法RFLP；ASPCR；PCR-ASO；測(cè)序等。F：?jiǎn)伪扼w型具有民族特征。G：?jiǎn)伪扼w型具有種屬特征。3.線粒體DNA法醫(yī)學(xué)應(yīng)用的問(wèn)題點(diǎn)A：遺傳的特殊性帶來(lái)的個(gè)人識(shí)別局限性。B：異質(zhì)性；同一個(gè)體不同器官或同一器官出現(xiàn)序列不同的mtDNA。二、Y染色體DNA遺傳標(biāo)記的法醫(yī)學(xué)意義1.Y染色體DNA特征與法醫(yī)學(xué)意義A：父系伴性遺傳：父系血緣男性具有完全相同的Y染色體DNA遺傳標(biāo)記。適合特殊類型的親權(quán)鑒定（父-子；同胞兄弟；父系血緣）。B：男性僅有：適合于含有男性成分的混合斑檢驗(yàn)。C：?jiǎn)伪扼w型具有民族特征。D：同時(shí)進(jìn)行性別鑒定。E：多態(tài)性種類以STR為主，并2.線粒體DNA法醫(yī)學(xué)應(yīng)用的問(wèn)題點(diǎn)A：遺傳的特殊性帶來(lái)的個(gè)人識(shí)別局限性。B：其他男性成分地污染。C：約5%的X染色體重組區(qū)的STR基因座的X染色體共有。三、DNA分子水平的性別與種屬鑒定1.DNA分子水平的性別鑒定DNA分子水平的性別鑒定的基本原理是X與Y染色體的特異基因的檢測(cè)。

A：牙釉基因（amelogenin,AMG）-X染色體的特異編碼牙釉蛋白基因；類牙釉基因（amelogenin-like,AMGL）-Y染色體的特異編碼牙釉蛋白基因，與AMG基因有90%同源性，AMG基因有一段插入序列，導(dǎo)致基因片段長(zhǎng)度長(zhǎng)。由1對(duì)引物可同時(shí)擴(kuò)增出X與Y染色體的相應(yīng)基因片段。X染色體-977bp產(chǎn)物；Y染色體-977bp與788bp兩個(gè)產(chǎn)物。

B：Y染色體的性別決定區(qū)（sexdeteminationregionY,SRY）,位于Y染色體的著絲點(diǎn)近擬常染區(qū)，一個(gè)外顯子，約1kb，表達(dá)蛋白誘導(dǎo)睪丸發(fā)育。根據(jù)該基因的一段保守序列設(shè)計(jì)引物，可以擴(kuò)增出254bp的片段。分析要點(diǎn)：避免擴(kuò)增失敗假陰性，應(yīng)加Alu序列作對(duì)照；不等交換所至性別異常；基因突變所至性別異常。

C：Y染色體的特異STR基因座的檢出。2.DNA分子水平的種屬鑒定DNA分子水平的種屬鑒定的基本原理是染色體上人類特異基因(片段)的檢測(cè)。包括人與動(dòng)物的鑒別和動(dòng)物間的鑒別。

A：Alu序列；屬于散在重復(fù)序列短片段間隔型（shortinterspersedsegment,SINEs），具有人及靈長(zhǎng)類動(dòng)物特征的SINEs片段長(zhǎng)約300bp，300-900萬(wàn)個(gè)，內(nèi)部存在限制性內(nèi)切酶AluⅠ識(shí)別部位，稱之Alu序列。檢測(cè)法（1）Alu探針雜交斑點(diǎn)法，基因組DNA直接點(diǎn)膜。（2）PCR法：Alu片段特異性引物，130bp的產(chǎn)物。

B：28srRNA、SON基因3ˊ非編碼區(qū)等，依據(jù)不同種屬動(dòng)物相應(yīng)片段內(nèi)部的堿基插入與缺失，PCR片段長(zhǎng)度差異鑒別動(dòng)物。

C：mtDNA細(xì)胞色素b基因：人與其他哺乳動(dòng)物細(xì)胞色素b基因內(nèi)部有AluⅠ識(shí)別部位；鳥類有NcoⅠ識(shí)別部位，依據(jù)不同種屬動(dòng)物細(xì)胞色素b基因堿基序列不同，其PCR產(chǎn)物酶切片段長(zhǎng)度與數(shù)目產(chǎn)生差別而鑒定種屬。

D：STR基因座的種屬差異。

斑跡檢查一、血痕檢測(cè)順序：肉眼觀察-預(yù)備試驗(yàn)-確證試驗(yàn)-種屬鑒別-遺傳標(biāo)記檢測(cè)-其他檢測(cè)。1、肉眼觀察：數(shù)量、形態(tài)、位置、色澤、大小等，案件發(fā)生過(guò)程。2、預(yù)備實(shí)驗(yàn)preliminarytest目的：是否為血液。檢測(cè)指標(biāo)：血紅蛋白或正鐵血紅素-血液的主要成分?；驹恚貉t蛋白或正鐵血紅素具有過(guò)氧化物酶活性，使過(guò)氧化氫分解產(chǎn)生新生態(tài)氧，0可以氧化某種化學(xué)物質(zhì)形成有顏色的新化學(xué)物質(zhì)，以證明可能是血液。特點(diǎn)：敏感性高，特異性差。陰性可否定血痕，陽(yáng)性疑為血痕。方法：聯(lián)苯胺試驗(yàn)---聯(lián)苯胺藍(lán)酚酞試驗(yàn)----在堿性環(huán)境中還原酚酞---酚酞（紅色）2、確證試驗(yàn)conclusivetest目的：是否為血液。檢測(cè)指標(biāo)：血紅蛋白或其衍生物-血液的主要成分?；驹恚貉t蛋白在酸（堿）性條件下可分解成血紅素，血紅素與某些化學(xué)物質(zhì)反應(yīng)可生成血紅素結(jié)晶。以證明是血液。特點(diǎn)：敏感性較高，特異性好。陰性可否定血痕，陽(yáng)性為血痕。方法：血色原結(jié)晶試驗(yàn)-含氮化合物（吡啶）血色原結(jié)晶桃紅色。氯化血紅素結(jié)晶試驗(yàn)-氯化血紅素結(jié)晶。血紅蛋白吸收光譜檢測(cè)，血細(xì)胞涂片檢測(cè)。3、種屬鑒別speciesidentification目的：是否為人血或何種動(dòng)物血液。檢測(cè)指標(biāo)：人及動(dòng)物血紅蛋白或血清蛋白?；驹恚簯?yīng)用血紅蛋白或血清蛋白特異性抗體，根據(jù)血清學(xué)抗原抗體反應(yīng)原理，出現(xiàn)免疫復(fù)合物為陽(yáng)性，判定種屬。常用抗體：抗人血紅蛋白抗體—種屬、器官雙特異性?？谷搜宓鞍卓贵w—種屬特異性。方法：沉淀反應(yīng)precipitation；

環(huán)狀沉淀反應(yīng)；瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)（單向與雙向）；對(duì)流免疫電泳；酶聯(lián)免疫試驗(yàn)。注意：交叉反應(yīng)；種屬特異性。生物化學(xué)方法：血紅蛋白等電聚焦。4、遺傳標(biāo)記檢測(cè)A：ABO型檢測(cè)：吸收實(shí)驗(yàn)absorption-標(biāo)準(zhǔn)化抗體1：32解離試驗(yàn)elution-高效價(jià)抗體混合凝集試驗(yàn)mixedagglutination-高親合力抗體。

B：其他遺傳標(biāo)記檢測(cè)二、精斑檢驗(yàn)1、定性試驗(yàn)1）.預(yù)備試驗(yàn)：酸性磷酸酶檢出法法醫(yī)學(xué)意義：酸性磷酸酶在前列腺分泌物中含量最高。酸性磷酸酶化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。檢測(cè)方法簡(jiǎn)單敏感，萬(wàn)余倍。2）.確證試驗(yàn)：A:精子檢出：最可靠，注意無(wú)精子癥患者。B:乳酸脫氫酶-X(lactatedehydrogenase,LDH)檢出：源于精子，活性最高。意義同精子檢出。3-4之間。C:γ-精漿蛋白(γ-seminoprotein,γ-sm檢出：源于前列腺，為糖蛋白，也稱作P30（分子量3萬(wàn)），化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，無(wú)精子癥患者無(wú)影響。D：β-微精漿蛋白(β-microseminoprotein,β-MSP檢出：源于前列腺的蛋白，無(wú)精子癥患者無(wú)影響。E：精子黃遞酶（diaphorase,DIA）3多態(tài)性檢出：源于精子，意義同精子檢出。3）遺傳標(biāo)記檢測(cè)：A：二步消化法，檢測(cè)常染色體遺傳標(biāo)記。B：Y染色體遺傳標(biāo)記檢測(cè)。C：常規(guī)血型檢測(cè)（ABO吸收、解離；PGM1、DIA3、GLOⅠ等酶型；GC、ORM1、GM、KM等血清蛋白型。）D：DIA3型檢測(cè)（無(wú)精子癥，精子對(duì)照）。三、精液與陰道液混合斑的檢驗(yàn)1、定性試驗(yàn)A：陰道脫落上皮的檢出。B：陰道肽酶（vaginalpeptidase,Vp）的檢出。2、混合斑的男性遺傳標(biāo)記檢測(cè)。A：常規(guī)血型檢測(cè)結(jié)果對(duì)比推斷法：B：二步消化法，檢測(cè)常染色體遺傳標(biāo)記。C：Y染色體遺傳標(biāo)記檢測(cè)。D：男性成分分離檢測(cè)法；1）

DIA3型檢測(cè)。2）

α2-精漿糖蛋白（α2-seminoglycoprotein,α2-SGP）檢測(cè)。源于精囊腺，為精液ABH物質(zhì)，應(yīng)用其抗體分離混合斑的男性ABH物質(zhì)，檢測(cè)ABO血型。3）抗人精漿抗體分離男性成分ABO血型檢測(cè)。一、基因型頻率計(jì)算基因型頻率（genotypefrequency）：在一個(gè)群體中，某基因座上不同基因型在全部個(gè)體中所占的百分比。根據(jù)等位基因頻率計(jì)算。例：MN系統(tǒng)：M=0.526；N=0.474MM=M=0.526×0.526=0.2767MN=2MN=2×0.526×0.474=0.4986NN=N=0.474×0.474=0.2247二、基因頻率計(jì)算基因頻率（genefrequency）：在一個(gè)群體中，某基因座上不同等位基因在全部個(gè)體中所占的百分比。1.

計(jì)數(shù)法基因頻率=某基因座特定等位基因數(shù)/某基因座所有等位基因數(shù)例：MN系統(tǒng)：1000個(gè)體MM有372個(gè)，MN有496個(gè)，NN有132個(gè)等位基因數(shù)為2000個(gè)M（等位基因數(shù)）=2MM+MN=2×372+496=1240M（基因頻率）=2MM+MN/2000=0.62P（A）=2×AA+AB/2×個(gè)體總數(shù)Q（B）=2×BB+AB/2×個(gè)體總數(shù)多個(gè)等位基因：P（A）=2×AA+AB+AC+AD/2×個(gè)體總數(shù)三、Hardy-Weinberg定律：在一個(gè)無(wú)限大的、不發(fā)生突變、遷移和選擇并隨機(jī)交配的群體中，基因頻率和基因型頻率在世代傳遞中保持不變，處于平衡狀態(tài)。一、

雜合度計(jì)算雜合度（heterozygosity）某群體某一遺傳標(biāo)記所有基因型中雜合子所占的比例。h=雜合子數(shù)/個(gè)體總數(shù)一、

人識(shí)別能力個(gè)人識(shí)別能力（powerofdiscrimination，DP）在同一群體中隨機(jī)抽取兩名個(gè)體，其基因型不同的概率，即遺傳標(biāo)記可以識(shí)別無(wú)關(guān)個(gè)體的能力。

nDP=1-Pm=1-ΣPi2J=1n為某遺傳標(biāo)記的基因型數(shù)目。Pi為該群體第I個(gè)基因型的頻率。

nΣPi2為群體中隨機(jī)抽取兩名個(gè)體，基因型由于機(jī)會(huì)而一致的概率。

J=1也稱作隨機(jī)匹配概率（probabilityofmatching,Pm）累計(jì)個(gè)人識(shí)別能力TDP=1-（1-DP1）（1-DP2）（1-DP3）（1-DPk）=1-Pm1×Pm2×Pm3×Pm4×Pm5×Pmkk1-

ΣPjj-1似然率（likelihood,LR）某種表型組合頻率的倒數(shù)，即：隨機(jī)匹配概率。例：TPOX8-110.3280.323D3S135815-160.2420.078FGA22-230.1030.008D5S81811-120.1540.0012CSF1PO11-120.1900.00023D7S82011-120.1430.000033D8S117913-140.0750.0000025THO17-90.2940.000000074VWA14-170.1310.0000000097D13S3178-110.1050.000000001D16S5399-110.1440.0000000001D18S5114-150.0860.00000000001D21S1129-310.0920.000000000001第一節(jié)

概述

血型（bloodgroup）：人類血液由遺傳控制的個(gè)體性狀之一，是血液的遺傳標(biāo)記(geneticmarker)紅細(xì)胞血型：指紅細(xì)胞表面抗原由遺傳所決定的個(gè)體差異廣義的血型概念：指包括血液、體液、分泌液、排泄物及組織細(xì)胞上，由遺傳所控制的個(gè)體性狀

一、紅細(xì)胞血型抗原血型抗原分類1．從來(lái)源上分

2．從抗原特異性結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上分血型基因產(chǎn)物糖基轉(zhuǎn)移酶、糖蛋白

類似的血型抗原還可存在于某些動(dòng)物，植物和微生物中

三．紅細(xì)胞血型抗體

天然抗體、免疫抗體寒冷抗體、溫暖抗體IgM抗體、IgG抗體四．紅細(xì)胞血型檢測(cè)凝集反應(yīng)顆粒性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合并集聚成團(tuán)塊。紅細(xì)胞凝集反應(yīng)紅細(xì)胞與對(duì)應(yīng)抗體發(fā)生的凝集反應(yīng)。（一）紅細(xì)胞的凝集反應(yīng)

致敏：抗原抗體發(fā)生特異性結(jié)合，這種結(jié)合是可逆的。細(xì)胞結(jié)構(gòu)無(wú)改變，無(wú)肉眼可見的凝集團(tuán)塊。凝集：抗原抗體結(jié)合物繼續(xù)反應(yīng)，細(xì)胞黏著并凝結(jié)成肉眼可見的凝集團(tuán)塊。為不可逆反應(yīng)動(dòng)電位（zetapotential）

由紅細(xì)胞表面的靜電荷與正離子團(tuán)外自由正離子間形成的電位差。動(dòng)電位的大小取決于紅細(xì)胞表面負(fù)電荷的程度與介質(zhì)中的離子濃度，也決定了紅細(xì)胞間距，與凝集反應(yīng)的發(fā)生有密切關(guān)系

（二）紅細(xì)胞凝集反應(yīng)的促進(jìn)因素

縮小紅細(xì)胞的間距，降低紅細(xì)胞的動(dòng)電位

1.用水解酶或神經(jīng)氨酸酶處理紅細(xì)胞

2.加入牛血清白蛋白可降低介質(zhì)中離子的介電常數(shù)

3.用低離子強(qiáng)度溶液作為反應(yīng)介質(zhì)

物理作用

離心作用

第二節(jié)ABO血型

1900年由Landsteiner發(fā)現(xiàn)特點(diǎn)：個(gè)體血清中含有與自身紅細(xì)胞ABO抗原相對(duì)應(yīng)的“天然”抗體，恒定地存在于正常人的血清中，為“規(guī)則抗體”

利用抗A和抗B血清可以測(cè)定未知血液的ABO血型一．ABO抗原的結(jié)構(gòu)ABO血型抗原的類型酯溶性糖酯類水溶性糖蛋白膜糖蛋白ABO血型抗原的基礎(chǔ)物質(zhì)

H物質(zhì)和血型前身物質(zhì)

血型前身物質(zhì)由單糖順序連接形成糖鏈，根據(jù)其非還原末端核心結(jié)構(gòu)中糖的種類和二糖之間的糖苷鍵連接方式可分為6種類型（I~VI型）。不同類型的血型前身物質(zhì)存在于人體不同部位，用于不同產(chǎn)物的合成。紅細(xì)胞膜上為II型結(jié)構(gòu)。

Gal-GlcNAc-Gal-GalNAc

H物質(zhì)

Gal-GlcNAc-Gal-GalNAc

FUCA抗原

GalNAc—Gal-GlcNAc-Gal-GalNAc

FUC

B抗原

Gal—Gal-GlcNAc-Gal-GalNAc

FUCO（H抗原）

Gal-GlcNAc-Gal-GalNAc

FUCABO抗原不是基因的直接產(chǎn)物，基因的直接產(chǎn)物是糖基轉(zhuǎn)移酶，通過(guò)催化不同糖鏈的生成而產(chǎn)生ABO抗原

二．等位基因結(jié)構(gòu)與ABO血型表型

ABO基因位于人類第9號(hào)染色體（9q34），有7個(gè)外顯子，編碼產(chǎn)生糖基轉(zhuǎn)移酶。ABO基因長(zhǎng)度約1060bp，編碼353個(gè)氨基酸。A和B基因的cDNA有7個(gè)堿基差異，造成第176、235、266、268位置上4個(gè)氨基酸的不同。是A和B基因產(chǎn)物特異性不同的分子基礎(chǔ)。

O基因由于258位堿基G缺失和第349位堿基缺失導(dǎo)致框架密碼位移，終止密碼提前出現(xiàn)，合成無(wú)酶活性短肽。

Bernstein三復(fù)等位基因?qū)W說(shuō)

ABO基因座主要有三個(gè)等位基因A、B和OA、B對(duì)O為顯性，O為隱性表型與基因型關(guān)系

A（AA，AO）；B（BB，BO）；AB（AB）；O（OO）ABO基因型可通過(guò)表型的家系調(diào)查推定，也可通過(guò)DNA分技術(shù)直接檢測(cè)。

ABO血型的亞型與變異型

最常見的A亞型A1與A2亞型

異常的ABO血型

CISAB型獲得性B抗原過(guò)路人抗原型、脫乙酰酶型三．群體遺傳學(xué)

表現(xiàn)型頻率：中國(guó)漢族絕大多數(shù)地區(qū)為B>O>A>AB

四．分型方法

血清學(xué)方法—正試驗(yàn)、反試驗(yàn)玻片法試管法DNA分型方法

PCR-SSPPCR-RFLP

第三節(jié)

H抗原與分泌型

H抗原是ABO抗原的前身物質(zhì)。由α2-L-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶（α2-FUT）催化L-巖藻糖（α2-FUC）轉(zhuǎn)移至血型前身物質(zhì)上形成

除了孟買型紅細(xì)胞Oh外，所有人紅細(xì)胞表面都有H抗原

一．H抗原與分泌型抗原的性質(zhì)

概念：在唾液和其他體液中可檢出ABH血型物質(zhì)者，稱為分泌型。否則為非分泌型除紅細(xì)胞上有H抗原外，在大約80%的人唾液中用中和試驗(yàn)檢出H抗原，為分泌型另外20%的唾液H抗原中和試驗(yàn)為陰性，是非分泌型

分泌型人唾液中與H抗原同時(shí)存在的還有A和B抗原，其體內(nèi)其他分泌液排泄液中都存在ABH抗原ABH物質(zhì)存在于血清，精液，唾液，淚液，消化液，尿液等體液中，不同分泌液中血型物質(zhì)的分泌量有明顯差別，以唾液、精液為最多，其他含量較少分泌液：

Galβ1-3GlcNAc—Gal—GalNAc紅細(xì)胞：Galβ1-4GlcNAc—Gal—GalNAc*化學(xué)成分相同，但結(jié)構(gòu)有微小差異*紅細(xì)胞上的ABH物質(zhì)屬脂蛋白，醇溶性，不溶于水；而分泌液與體液中的ABH物質(zhì)為水溶性糖蛋白，人以I型結(jié)構(gòu)為主

二．基因結(jié)構(gòu)與命名

分泌型表達(dá)是由雙結(jié)構(gòu)基因控制的位于第19號(hào)染色體兩個(gè)緊密連鎖的FUT1（H）和FUT2（Se）基因座，各自編碼表達(dá)一種α2-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶FUT1基因座編碼365個(gè)氨基酸殘基組成的巖藻糖轉(zhuǎn)移酶FUT2基因座編碼332個(gè)氨基酸殘基組成的巖藻糖轉(zhuǎn)移酶，只作用于分泌腺細(xì)胞紅細(xì)胞上的H抗原為II型糖鏈，分泌型人唾液腺細(xì)胞有Se和H基因，因此唾液中同時(shí)表達(dá)I型和II型H抗原；非分泌型為se隱性基因，唾液中不表達(dá)H抗原三、H抗原缺失型—孟買型（Oh）

概念：是紅細(xì)胞上和唾液中全無(wú)A、B與H抗原的O型變異型，不能與抗-A、抗-B與抗-H發(fā)生凝集反應(yīng)，血清中含有抗-A、-B與抗-H抗體，可分別凝集A、B、O型紅細(xì)胞兩種類型：(1)

FUT1和FUT2基因是hh和sese純合子，沒有巖藻糖轉(zhuǎn)移酶合成。也無(wú)H物質(zhì)合成。即使有正常的ABO基因，也無(wú)A、B、H物質(zhì)。

(2)具有正常H和Se基因，分泌液中也有正常的巖藻糖轉(zhuǎn)移酶，但沒有H物質(zhì)生成。認(rèn)為是巖藻糖轉(zhuǎn)移酶在催化H物質(zhì)合成過(guò)程中由于缺乏某種條件所致

四．Se和nS的檢查

中和試驗(yàn)（凝集抑制試驗(yàn)haemagglutinationinhibitiontest,HAI）

檢測(cè)唾液和精液中的HAB物質(zhì)，來(lái)區(qū)分分泌型和非分泌型。胎兒檢測(cè)羊水，新生兒檢測(cè)唾液即可區(qū)分

第五節(jié)MNSs血型系統(tǒng)

第二個(gè)被發(fā)現(xiàn)的紅細(xì)胞血型抗體是免疫獲得，分別命名為抗M、抗N出生時(shí)已發(fā)育完好，只存在于紅細(xì)胞上，腎上皮，口腔黏膜上皮，毛發(fā)中有MN抗原人以外的動(dòng)物，僅在黑猩猩和某些低級(jí)猴類證明有M型物質(zhì)，N型物質(zhì)僅見于類人猿。其他動(dòng)物均未能發(fā)現(xiàn)。對(duì)人獸血的鑒別有重要意義人血清中通常無(wú)抗M抗N抗體存在，但偶爾可遇到S抗原與MN抗原呈緊密連鎖關(guān)系

一、MNSs血型抗原的結(jié)構(gòu)

MN和Ss血型抗原決定簇分別由血型糖蛋白A（glycophorinA,GPA）和血型糖蛋白B(glycophorinB,GPB)攜帶，是人紅細(xì)胞表面的唾液酸糖蛋白紅細(xì)胞膜的構(gòu)成成分。無(wú)水溶性形式，用唾液酸酶或蛋白酶處理，可喪失M與N的抗原活性抗原性質(zhì)

一般性質(zhì)：A）MN抗原發(fā)生早，胚胎期可證明。Ss出生后可證明。B）MN抗原十分穩(wěn)定，耐高溫，高壓和反復(fù)凍融。

劑量效應(yīng)：純合子較雜合子表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗原性。這種現(xiàn)象稱之為劑量效應(yīng)。類N特異性：抗N抗體可被M型紅細(xì)胞吸收，由于M型紅細(xì)胞上存在類似于N的受體。

分型方法

MN血型判定：凝集反應(yīng)—玻片法和試管法Ss型判定：抗人球蛋白法（Coombs法）血痕的MN型判定：吸收試驗(yàn)，解離試驗(yàn)

第六節(jié)Rh血型系統(tǒng)

1940年，landersteiner與wiener用恒河猴RBC免疫家兔得到一種抗體，發(fā)現(xiàn)抗血清不僅能與猴子RBC發(fā)生反應(yīng)，還與紐約85%白人的RBC發(fā)生反應(yīng)。

因?yàn)檫@類抗原存在于所有恒河猴（rhesusmonkey）的紅細(xì)胞上，故命名為RH因子。將凡能與這種抗RH血清起反應(yīng)的85%白人稱之為RH陽(yáng)性，不能起反應(yīng)的15%白人稱之為RH陰性。

一．RH抗原結(jié)構(gòu)

RH蛋白(RHD分子、RHCcEe分子）RH相關(guān)糖蛋白——與RH抗原性無(wú)關(guān)

RH蛋白為含有12個(gè)跨膜區(qū)多肽，N末端和C末端均位于細(xì)胞質(zhì)，6個(gè)親水性多肽環(huán)位于細(xì)胞外

二．等位基因結(jié)構(gòu)與命名

RH基因由緊密連鎖且高度同源的RHD和RHCE基因組成

RHCE基因：由10個(gè)外顯子組成編碼417個(gè)氨基酸多肽。根據(jù)氨基酸序列不同，有Ce，CE，cE，ce四種抗原RHD基因：也有10個(gè)外顯子，編碼一條417個(gè)氨基酸殘疾的多肽RHD座位有兩種表現(xiàn)型D（+），D（－）。RHCE座位有4種表型，所以共有8種單倍型

RH抗原多態(tài)性的分子學(xué)基礎(chǔ)

RHD基因編碼D抗原，RHCE基因編碼C，c，E，e抗原Cc抗原的產(chǎn)生是由于RHCE基因第1-2外顯子發(fā)生了6個(gè)堿基替代，而使4個(gè)氨基酸發(fā)生改變，以致產(chǎn)生C或c抗原Ee產(chǎn)生與RHCE基因第五外顯子上一個(gè)堿基替代有關(guān)，從而使位于第4個(gè)細(xì)胞外多肽環(huán)上的一個(gè)氨基酸發(fā)生改變，表現(xiàn)為E或e特異性RHD（+）人具有RHD基因，RHD（－）人缺乏RHD基因

變異型

Du型

Du與D只有量的差別，無(wú)質(zhì)的差異。可與某些抗D血清發(fā)生弱反應(yīng)，與另一些血清不發(fā)生反應(yīng)

RH缺失型（—D—型）

紅細(xì)胞上無(wú)CcEe抗原，血清中有抗C，抗c，抗E，抗e抗體。為稀有變異型，多見于近親婚配

Rhnull型（RH無(wú)效型，RH-）：RBC不與任何抗RH血清反應(yīng)，本質(zhì)是基因表達(dá)受抑制。Xr基因純合子阻斷RH抗原合成。家系調(diào)查子女仍有正常的RH基因遺傳

檢查法

膠體介質(zhì)法

原理：水溶性膠體介質(zhì)可提高水的介電常數(shù)，增加RBC表面極性，降低ζ電位，使RBC間斥力減弱，距離靠近，在不完全抗體作用下，發(fā)生凝集

木瓜酶法（酶法）原理：蛋白水解酶使RBC膜上唾液酸及含有唾液酸的糖蛋白游離，細(xì)胞表面電荷減少，細(xì)胞膨脹，血型受體露出細(xì)胞表面，與不完全抗體作用發(fā)生凝集反應(yīng)。有木瓜酶，菠蘿蛋白酶，胰蛋白酶等?？谷饲虻鞍追ǎ–oobms’法）原理：不完全抗體不能使RBC發(fā)生凝集，但可使RBC上的相應(yīng)抗原致敏。不完全抗體是球蛋白，本身也是一種抗原。當(dāng)加入抗人球蛋白抗體后，即可產(chǎn)生抗原抗體反應(yīng)使RBC凝集。直接凝集反應(yīng)

一、概述二十世紀(jì)初發(fā)現(xiàn)移植排斥現(xiàn)象免疫反應(yīng)本質(zhì)主要組織相容性抗原復(fù)合體（MHC）與移植排斥有關(guān)，也參與機(jī)體免疫應(yīng)答得誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)MHC結(jié)構(gòu)、功能、進(jìn)化及其與臨床醫(yī)學(xué)之間的關(guān)系，是近代免疫遺傳學(xué)研究的核心二、人類MHC發(fā)現(xiàn)人類第一個(gè)白細(xì)胞抗原Mac存在于白細(xì)胞表面，含量最多，采集外周血白細(xì)胞檢驗(yàn)，稱之為人類白細(xì)胞抗原系統(tǒng)（HLA）人類MHCHLA復(fù)合體

三、HLA基因定位與結(jié)構(gòu)HLA基因復(fù)合體位于人第六號(hào)染色體短臂6p21.31。HLA-I類基因集中在遠(yuǎn)離著絲點(diǎn)的一端，包括B、C、A三個(gè)座位，其產(chǎn)物是HLA-I類分子HLA-II類基因在復(fù)合體中位于近著絲點(diǎn)一端，由DP、DQ、DR三個(gè)亞區(qū)組成血清補(bǔ)體成分編碼基因C2、C4A、C4B、Bf四、HLA命名

1.

以大寫字母A、B、C等表示HLA遺傳區(qū)域中的座位。2.HLA抗原特異性用數(shù)字表示。3.HLA-C抗原特異性以Cw為字首命名。4.HLA基因命名一般以4位數(shù)字表示，其中前2位數(shù)字表示對(duì)應(yīng)最相近的HLA抗原特異性，后2位數(shù)字則用于表示亞型的等位基因。5.如果出現(xiàn)第五位數(shù)字，則代表“沉默取代”。6.第6、7位數(shù)字代表相應(yīng)的啟動(dòng)子（包含內(nèi)含子或側(cè)翼區(qū)等）序列的多態(tài)性。7.末尾加英文字母N表示無(wú)效等位基因或不表達(dá)基因。8.在不能區(qū)分等位基因時(shí)，可允許取最前面的2位或4位數(shù)字表示該HLA的特異性。五、HLA復(fù)合體遺傳特征單倍型遺傳方式復(fù)等位基因共顯性遺傳，是HLA高度多態(tài)性的最主要原因。某些基因比其他基因能更多或更少地連鎖在一起出現(xiàn)，從而出現(xiàn)連鎖不平衡。六、HLA抗原系統(tǒng)HLA-I類分子由α鏈和β2m組成，分布于所有有核細(xì)胞表面。分為多肽結(jié)合區(qū)、免疫球蛋白樣區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。HLA-II類分子由由α鏈和β鏈組成的異源二聚體。同樣分四個(gè)區(qū)。僅表達(dá)于淋巴樣組織中的各種細(xì)胞表面，如APC細(xì)胞、胸腺上皮細(xì)胞和人的活化T細(xì)胞七、HLA分型

一、血清學(xué)分型（微量淋巴細(xì)胞毒性試驗(yàn)）二．細(xì)胞學(xué)分型（淋巴細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)）三．DNA分型（一）PCR-RFLP技術(shù)（二）PCR-SSO技術(shù)（三）PCR-SSP技術(shù)（四）測(cè)序技術(shù)概述血清的組成血清型概念血清型分類特異性抗體分型：同種異型電泳技術(shù)分型：電泳多態(tài)性法醫(yī)學(xué)應(yīng)用的血清蛋白型Haptoglobin(Hp)Group-specificcomponent(Gc)Transferrin(Tf)α1-antitrypsin(α1-AT)Immunoglobulin(Ig)Low-densitylipoprotein(LDL),Component等第一節(jié)

結(jié)合珠蛋白

Haptoglobin，HP一、HP的分子結(jié)構(gòu)糖蛋白，分子式（αβ）2，pI=4.1α鏈有，β

鏈無(wú)多態(tài)性HP1α(83個(gè)氨基酸)，第53位為L(zhǎng)ys或Glu，構(gòu)成HP1αF和HP1αS兩條多肽鏈HP2α(142個(gè)氨基酸)，第53和112位上或Lys或Glu，構(gòu)成2F，2S，2FS三種不同的結(jié)構(gòu)二、HP的生理功能與血紅蛋白Hb結(jié)合成Hp-Hb復(fù)合物，并很快被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)所清除。還可以使Hb的過(guò)氧化酶活性增高。三、HP的表現(xiàn)型及遺傳Swithies和Walker（1955）用凝粉凝膠電泳技術(shù)，將HP分為三型：HP1、HP2-1及HP2。用尿素將血清變性處理，再用巰基乙醇還原后進(jìn)行電泳，可檢出6種表型，Hp1S-1S、Hp1S-1F、Hp1F-1F、Hp2-1S、Hp2-1F、Hp2-2。由三個(gè)共顯性等位基因Hp*1F，Hp*1S，Hp*2所控制。

等電聚焦還可進(jìn)一步分為10余種表型，由5個(gè)共顯性等位基因控制

四、Hp的遺傳變異

HP0型

用常規(guī)檢測(cè)方法不能檢出Hp。血液中無(wú)HP，亦稱無(wú)結(jié)合珠蛋白血癥

HP2-1M型

電泳譜帶特點(diǎn)是HP1和HP2譜帶中的快泳動(dòng)帶成分比例增多，而其余譜帶非常弱。HPCa型

特征是HP2譜帶中快泳動(dòng)帶比例減少，而其余譜帶明顯增加HPJ-1型

特點(diǎn)是1譜帶分裂為兩條帶，陰極側(cè)的譜帶增多，系HP2-1型的變異型。HPK-1型特點(diǎn)是1區(qū)的譜帶分裂為兩條，其余區(qū)域無(wú)蛋白帶，可能有1型演變而來(lái)。其他變異型有：HP2-1（Trans），HP2-1（Haw）等

五、HP分型原理、方法

聚丙烯酰胺凝膠電泳（圓盤、垂直板）原理：利用聚丙烯酰胺凝膠（PAG）的分子篩和電場(chǎng)的作用，在凝膠中分離不同型別Hp蛋白。然后利用Hp-Hb復(fù)合物中Hb的過(guò)氧化物酶活性，使聯(lián)苯胺氧化成聯(lián)苯胺藍(lán)。從而使譜帶顯色進(jìn)行判型。第二節(jié)維生素D結(jié)合蛋白型

維生素D結(jié)合蛋白（vitaminDblindinprotein,DPB）又稱型特異性成分（groupspecificcomponent,GC）屬血清α2球蛋白Hirschfeld于1959年發(fā)現(xiàn)其多態(tài)性

主要生物學(xué)功能是結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)維生素D及其代謝產(chǎn)物。GC可在體內(nèi)或體外與肌動(dòng)蛋白（actin）結(jié)合，形成1:1的復(fù)合物。GC與肌動(dòng)蛋白結(jié)合有利于肌動(dòng)蛋白從組織中清除。

GC基因定位于第四對(duì)染色體長(zhǎng)臂（4q12-13）GC系統(tǒng)屬常染色體單基因座共顯性遺傳，按孟德爾定律遺傳。Gc基因全長(zhǎng)約42.4kb，包含13個(gè)外顯子