糖尿病腎病大鼠模型制備方法及模型建立標(biāo)準(zhǔn)的研究

糖尿病腎病大鼠模型制備方法及模型建立標(biāo)準(zhǔn)的研究

近年來，隨著人們生活水平的不斷提高，飲食結(jié)構(gòu)和工作方式的變化，糖尿病的發(fā)病率顯著增加。其中糖尿病腎病(diabeticnephropathy,DN)是糖尿病最重要的合并癥之一,是糖尿病患者的主要死因之一。約有30%的糖尿病患者發(fā)展為糖尿病腎病,且多數(shù)患者將進(jìn)展為終末期腎病。但是糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚,藥物干預(yù)手段較少,研究有待于深入,因此建立較理想的動(dòng)物模型來研究該病的相關(guān)問題將具有重要意義。據(jù)報(bào)道目前已有十幾種糖尿病動(dòng)物模型,有些僅表現(xiàn)為輕度血糖升高,還有一些則不出現(xiàn)腎臟病變。其中出現(xiàn)腎臟病變的動(dòng)物模型有如:db/db小鼠、KK小鼠、Gk大鼠、SHR/N-cp大鼠等。這些動(dòng)物模型來源稀少,飼養(yǎng)條件苛刻,有些動(dòng)物模型不能真正模擬人類糖尿病腎臟病變且模型建立標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一,不利于科學(xué)研究。急需來源廣泛,經(jīng)濟(jì)廉價(jià),易于控制的動(dòng)物模型及一套完善的模型建立標(biāo)準(zhǔn)。近年來研究主要采用幾種模型制備方法,單獨(dú)鏈脲佐菌素造模,鏈脲佐菌素配合高脂高糖飲食,鏈脲佐菌素配合單腎切除,鏈脲佐菌素配合單腎結(jié)扎,但模型建立標(biāo)準(zhǔn)不盡相同,難以統(tǒng)一。通過文獻(xiàn)查閱對以上幾種模型制備方法進(jìn)行分析、比較,總結(jié)出合理且易于控制的模型制備方法。對于模型建立標(biāo)準(zhǔn),則提出一種思路。1模型制備方法的選擇1.1糖尿病腎病大鼠模型的制備靜脈或腹腔注射大量鏈脲佐菌素造成糖尿病模型,然后依其自然病情發(fā)展成糖尿病腎病模型。張潤云等通過研究中藥糖腎清1號(hào)對糖尿病腎病模型大鼠腎組織中纖維化因子表達(dá)的影響,進(jìn)行糖尿病腎病大鼠模型制備,采用SD大鼠,SPE/VAF級(jí),按64mg/kg腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)檸檬緩沖液進(jìn)行造模。王月華等通過研究活血化瘀消癥通絡(luò)中藥對糖尿病腎病的干預(yù)作用,進(jìn)行糖尿病腎病大鼠模型制備,采用健康雄性SD大鼠清潔級(jí)一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)60mg/kg,72h后測血糖≥16.7mmol/L為糖尿病腎病模型建立標(biāo)準(zhǔn)。1.2糖尿病腎病模型制備高脂高糖飲食配合鏈脲佐菌素造成糖尿病模型,然后依其自然病情發(fā)展成糖尿病腎病模型。張燕等通過研究雷公藤多苷對糖尿病腎病大鼠腎組織轉(zhuǎn)化生長因子β1骨形成蛋白7及Gremlin表達(dá)的影響,采用SD大鼠進(jìn)行糖尿病腎病模型制備,予高脂高糖飼料喂養(yǎng)4周,一次性腹腔注射40mg/kg鏈脲佐菌素。72h后采血測血糖,隨機(jī)血糖≥16.7mmol/L為模型制備成功。田國偉等通過益氣解毒活絡(luò)法對早期糖尿病腎病大鼠血清脂聯(lián)素與血清超敏C反應(yīng)蛋白影響的實(shí)驗(yàn)研究,采用SD大鼠,高脂高糖喂養(yǎng)的大鼠均以35mg/kg(STZ)1次尾靜脈注射,72h后尾靜脈取血測量血糖值,以空腹血糖≥16.7mmol/L列入觀察對象。1.3型糖尿病腎病大鼠模型的制備及造模方法的選擇單側(cè)腎臟切除后腹腔鏈脲佐菌素注射,然后依其自然病情發(fā)展為糖尿病腎病模型。李秀秀等通過研究益腎膠囊對糖尿病腎病大鼠模型腎組織TLR4表達(dá)的影響,采取Wistar大鼠切除右側(cè)腎臟,于右腎切除2周后,腹腔一次性注射50mg/kgSTZ,72h后尾尖采血,血糖高于16.7mmol/L為模型制備成功。張浩軍等通過研究糖腎方對糖尿病腎病大鼠腎組織TGF-β1及MMP-9表達(dá)的影響,采用SPF級(jí)Wistar大鼠實(shí)施右側(cè)腎切除,1周后按40mg/kg腹腔注射的鏈脲佐菌素,72h后尾尖采血測血糖,以高于16.7mmol/L為模型制備成功。通過大量文獻(xiàn)查閱,國內(nèi)普遍采用SD、Wistar大鼠進(jìn)行模型制備,其來源廣泛,經(jīng)濟(jì)廉價(jià),飼養(yǎng)方便。王麗等通過實(shí)驗(yàn)對以上提到的幾種常見的造模方法進(jìn)行研究,結(jié)果顯示高脂高糖飲食配合小劑量STZ誘導(dǎo)的2型糖尿病模型在切除腎臟后較早的出現(xiàn)了明顯的蛋白尿以及糖尿病腎臟病理變化,明顯有別于單純STZ誘導(dǎo)的糖尿病模型。單側(cè)腎臟的切除有助于加速腎臟的病變,其機(jī)制主要是單側(cè)腎切除后導(dǎo)致了對側(cè)腎臟的血流動(dòng)力學(xué)改變,從而導(dǎo)致腎小球出現(xiàn)濾過性增高和高跨膜壓的病理改變。所以,高脂高糖飲食聯(lián)合單側(cè)腎切除術(shù)后誘導(dǎo)出的糖尿病腎病動(dòng)物模型具有成模率高、成模時(shí)間短、病理改變與臨床貼近等優(yōu)點(diǎn)。在前期試驗(yàn)中,采用單側(cè)腎動(dòng)脈結(jié)扎的造模方法,但是大鼠由于腎功能急劇衰竭極易死亡,因此認(rèn)為單側(cè)腎臟動(dòng)脈結(jié)扎的方法不適于造模使用。芝敏等也對2型糖尿病腎病大鼠模型的建立進(jìn)行研究,認(rèn)為一次性大劑量注射STZ這種模型制作周期長,產(chǎn)生的腎臟損壞輕微,結(jié)果傾向于1型糖尿病腎病。同時(shí)也認(rèn)為高脂高糖飲食配合STZ單腎切除,能夠在短時(shí)間內(nèi)獲得較為滿意的2型糖尿病腎病大鼠模型,并且采用3次小劑量注射STZ代替1次中計(jì)量注射STZ的方法,提高了成模率,縮短了成模時(shí)間。綜上所述,三聯(lián)法(高脂高糖飲食+手術(shù)切除單腎+STZ注射)已較為成熟,能夠在短時(shí)間內(nèi)獲得2型糖尿病腎病大鼠模型,且病理改變與臨床貼近,通過改變STZ的注射量、注射次數(shù)又能夠有效的提高成模率。為復(fù)制糖尿病腎病大鼠模型的首選方法。2糖尿病腎病模型建立在糖尿病腎病大鼠的造模過程中,各家模型建立標(biāo)準(zhǔn)不盡統(tǒng)一。鄭亞萍等對DN大鼠進(jìn)行模型制備,采用單腎摘除配合高脂高糖和小劑量STZ的模型制備方法,在STZ注射72h后,將血糖高于16.7mmol/L為DN大鼠模型建立標(biāo)準(zhǔn)。黃平等對DN大鼠模型的復(fù)制,采用單腎切除配合STZ注射的模型制備方法,在STZ注射72h后,將血糖大于16.7mmol/L,尿糖陽性,尿量大于正常組50%者為模型復(fù)制成功。傅曉駿等對DN大鼠進(jìn)行模型制備,采用高脂高糖配合STZ注射,STZ注射后72h,血糖≥16.7mmol/L為糖尿病模型復(fù)制成功,1周后留取大鼠尿即可,測尿微量白蛋白及肌酐,模型組的尿微量白蛋白/尿肌酐顯著高于正常對照組,即為糖尿病腎病模型復(fù)制成功。馬麗娟等采用高脂高糖配合STZ注射的造模方法,STZ注射后1周測空腹血糖和葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)2h血糖,取FPG≥7mmol/L和(或)2hPG≥11.1mmol/L者為2型糖尿病大鼠,成模大鼠在STZ注射后分別在6周和7周時(shí)用尿微量白蛋白試紙連續(xù)測大鼠晨尿3次以上,若為陽性,則為2型糖尿病腎病的大鼠?？梢娔Ｐ徒?biāo)準(zhǔn)各異,規(guī)范不統(tǒng)一,不利于科研工作的開展進(jìn)行,因此建立科學(xué)的統(tǒng)一的模型標(biāo)準(zhǔn)成為急需解決的關(guān)鍵問題。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)的原理,在糖尿病腎病大鼠模型標(biāo)準(zhǔn)確定中可以引入醫(yī)學(xué)參考值范圍。醫(yī)學(xué)臨床中,常將就診者的某些生理、生化、免疫學(xué)等指標(biāo)的測定結(jié)果,與排除了對所研究指標(biāo)有影響的疾病和有關(guān)因素的大多數(shù)“正常人”的相應(yīng)數(shù)值進(jìn)行比較,以就診者的測定值是否超出了大多數(shù)“正常人”相應(yīng)指標(biāo)的波動(dòng)范圍,它主要用于劃分正常與異常的界限,作為臨床診斷的重要參考。因此參考值范圍也稱為正常值范圍,是指絕大多數(shù)“正常人”的某指標(biāo)值范圍。這里的“絕大多數(shù)”可以是90%、95%、99%等,最常用的是95%。根據(jù)95%參考值范圍進(jìn)行計(jì)算可以得出大鼠正常的指標(biāo)范圍,參考正常的指標(biāo)范圍來確定診斷標(biāo)準(zhǔn),也就確定了大鼠的模型建立標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)大量樣本正常大鼠的血糖值統(tǒng)計(jì)結(jié)果推算出參考值范圍,超出參考值范圍即為異常,也就確定糖尿病大鼠的血糖成模標(biāo)準(zhǔn)。同理根據(jù)大樣本大鼠尿蛋白的參考值范圍推算出糖尿病腎病大鼠的成模標(biāo)準(zhǔn)。3糖尿病腎病大鼠模型制備方法通過大量文獻(xiàn)查閱,分析、比較常見的幾種糖尿病腎病大鼠的造模方法,認(rèn)為三聯(lián)法(高脂高糖飲食+手術(shù)切除單腎+STZ注射)已較為成熟,能夠在短時(shí)間內(nèi)獲得2型糖尿病腎病大鼠模型,且病理改變與臨床貼近,通過改變STZ的注射量、注射次數(shù)又能夠有效的提高成模率。如不采用高脂高糖飲食,單腎摘除配合增加STZ注射劑量,則模型更接近1型糖尿病大鼠模型。綜上方法為糖尿病腎病大鼠模型制備的首選方法。成模標(biāo)準(zhǔn)則根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理,醫(yī)學(xué)參考值范圍進(jìn)行確定。4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的基本特征實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的醫(yī)學(xué)參考值范圍需要大樣本統(tǒng)計(jì)計(jì)算,因此通過對大量的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生理正常值的統(tǒng)計(jì),來建立地區(qū)內(nèi)、范圍內(nèi)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)據(jù)庫,對于實(shí)驗(yàn)造模等科學(xué)研究工作都有重要意義。包玉龍、杜佳林等通過大樣本的統(tǒng)計(jì)分析,得出遼寧地區(qū)遼寧地區(qū)普通級(jí)和SPF級(jí)SD大鼠血液生理、生化指標(biāo)。這樣的基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)不斷積累,使地域內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的數(shù)據(jù)庫不斷完善,有利于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的規(guī)范化。代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后發(fā)展起來的一門新的組學(xué)技術(shù),是近年來研究的熱門學(xué)科,代謝組學(xué)概念:可以定量測定生物體系對病理生理刺激或遺傳因素改變所產(chǎn)生的代謝應(yīng)答的一種方法。代