伴皮質(zhì)下梗死及白質(zhì)腦病的ec基因突變多態(tài)類型分析

伴皮質(zhì)下梗死及白質(zhì)腦病的ec基因突變多態(tài)類型分析

皮質(zhì)下動脈硬化疾病和白質(zhì)腦病（cd-iii）顯示的顯性腦動脈疾病的遺傳因素非常重視青年腦梗死的審理因素。目前,全世界已經(jīng)有超過400個相關(guān)CADASIL家系報道,大多數(shù)為白種人。國內(nèi)2000年報道了首例家系。本研究通過對4例中國CADASIL先證者及其家系進行NOTCH3基因研究,旨在了解相關(guān)熱點基因突變區(qū)、突變類型,對臨床前期患者做出基因診斷,以便了解中國CADASIL患者的自然病程。1對象和方法1.1目標(biāo)1.1.1性別、年齡及資料系2002～2003年首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科、溫州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院、山西醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院就診患者,男3例,女1例;年齡38～62歲,平均(45±6.8)歲。臨床表現(xiàn)均為反復(fù)缺血性卒中發(fā)作及血管性癡呆(VD)。有明確家族史,無先兆性偏頭痛發(fā)作,無高血壓、糖尿病、高脂血癥、血管淀粉樣變性病史;否認吸煙、飲酒史。1.1.2前證是黨證,先證即證共14人,男9人,女5人;年齡29～48歲,平均(34±6.8)歲。6人來自家系1,與先證者有血緣關(guān)系5人,其中3人(Ⅲ1、Ⅲ7、Ⅲ13)有缺血性卒中發(fā)作史,但無VD,2人(Ⅲ2、Ⅲ3)無臨床癥狀;1人無血緣關(guān)系(Ⅱ1)。7人來自家系2,6人與先證者有血緣關(guān)系,其中5人(Ⅱ2、Ⅱ6、Ⅱ10、Ⅲ2、Ⅲ8)有與先證者相似的臨床表現(xiàn),1人(Ⅲ7)無臨床癥狀;1人無血緣關(guān)系(Ⅱ14)。1人來自家系3,與先證者有血緣關(guān)系(Ⅱ7),但無先證者相似的臨床表現(xiàn)。家系1～3譜圖見圖1。家系4未提供家系資料。1.1.3不同性別學(xué)生的健康查體系同期在首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院參加流行病學(xué)調(diào)查研究的健康查體者100名,男52名,女48名;年齡56～72歲,平均(63±8.2)歲。無神經(jīng)系統(tǒng)變性病史及精神病史,無腦血管病高危險因素及家族史。1.2方法1.2.1提取的dna入組者知情同意后,取肘靜脈血10ml(枸櫞酸鈉抗凝),4℃保存,兩周內(nèi)采用《分子克隆》第二版介紹的方法從血液白細胞中提取DNA。1.2.2pcr擴增條件(1)采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)體系:總反應(yīng)體積為25μl[去離子水18.7μl,Mg2+緩沖液(15mmol/L)2.5μl,dNTP(2.5mmol/L)2μl,引物F0.5μl,引物R0.5μl,模板DNA0.5μl及Taq酶0.3μl;引物序列見表1,其中第3、4、18、20外顯子引物序列引用相關(guān)文獻,余引物序列均為使用oligo及DNAstar軟件自行設(shè)計。(2)PCR擴增的熱循環(huán)條件如下:95℃預(yù)變性5min;95℃,30s,[第2外顯子(60℃,45s);第3外顯子(57℃,45s);第4外顯子(58℃,45s);第5～22外顯子(60℃,45s);第23外顯子(59℃,45s)],72℃,70s,35個循環(huán);72℃延伸10min。(3)取5μlPCR產(chǎn)物加入0.5μl上樣緩沖液,進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,電壓為120V,30min后觀察結(jié)果,出現(xiàn)相應(yīng)長度的單一PCR擴增條帶,認為擴增成功,待變性高壓液相色譜分析(DHPLC)檢測。(4)DHPLC檢測條件:2～3μl的PCR產(chǎn)物被流動相為0.9ml/min的速度帶至DNA分離柱而得以分離,分析一個樣品需要8～10min。對經(jīng)DHPLC檢測為單峰的PCR產(chǎn)物調(diào)整柱溫,調(diào)整范圍在1～3℃,以觀察峰形變化。分別選取CADASIL組及正常對照組突變峰型及正常單峰進行二次PCR擴增,送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司,使用美國ABI公司377機型進行雙向測序,確定致病性突變、多態(tài)及野生型基因序列。2結(jié)果2.1外顯子3、4突變見表2及圖2～4。4例先證者及其家系中共發(fā)現(xiàn)3種致病性突變,分別位于外顯子3及4中。家系2中所有發(fā)病者及1名未發(fā)病者出現(xiàn)與先證者相同的基因突變。家系1中所有發(fā)病者及1名未發(fā)病者出現(xiàn)與先證者相同的基因突變。2.2骨葬的先證人及其家人系統(tǒng)的成員非物質(zhì)遺傳因素的多態(tài)性類型見表3。4例先證者及其家系中共發(fā)現(xiàn)NOTCH3基因15種多態(tài)類型。3cadasil基因檢測1977年Sourander等首先報道了1個CADASIL家族,稱之為遺傳性多梗死性癡呆;1993年Tournier-Lasserve等將致病基因定位于19號常染色體;1996年進一步定位為NOTCH3基因。NOTCH3基因編碼含有2321個氨基酸的跨膜受體蛋白,其細胞外區(qū)包含34個表皮樣生長因子重復(fù)序列(EGF-like),每個EGF-like包含6個高度保守的半胱氨酸殘基,并形成3個二硫鍵。正常組織中,NOTCH3基因的表達嚴格限于血管平滑肌細胞。NOTCH3基因致病性突變導(dǎo)致EGF序列半胱氨酸殘基數(shù)量的奇數(shù)化,破壞了規(guī)范的二硫鍵的配對,導(dǎo)致血管平滑肌細胞功能異常而致病。CADASIL是系統(tǒng)性動脈疾病,但首先表現(xiàn)為腦部癥狀,其病理生理基礎(chǔ)主要依賴于一些特殊的腦血管構(gòu)筑特征和循環(huán)模式。血管平滑肌細胞在維持腦部穿通動脈灌注區(qū)域的灌注壓和腦血流自身調(diào)節(jié)中起著重要作用,故患者頭顱影像學(xué)改變多為穿通動脈供血區(qū)的腔隙性梗死。本研究中家系1～3先證者頭顱磁共振檢查顯示多發(fā)皮質(zhì)下梗死,家系2先證者同時伴有腦橋梗死,均為長穿通動脈供血區(qū)。CADASIL作為卒中、癡呆、偏頭痛、癲癎的病因,其診斷標(biāo)準為:(1)中年起病,有反復(fù)腦缺血發(fā)作史,多伴有認知功能障礙及偏頭痛發(fā)作史;(2)具有家族遺傳性;(3)頭顱影像學(xué)檢查顯示多灶性皮質(zhì)下梗死及白質(zhì)腦病;(4)電鏡下發(fā)現(xiàn)小動脈中層平滑肌細胞表面存在嗜鋨顆粒物質(zhì)(GOM)沉積;(5)NOTCH3基因檢測可發(fā)現(xiàn)致病性突變。其中病理改變和基因檢測為診斷的金指標(biāo),其余均缺乏特異性。臨床常見的線粒體腦肌病、家族性白質(zhì)腦病、Bingswanger病僅從臨床表現(xiàn)及影像學(xué)改變,很難與CADASIL進行鑒別。此外,2000年Joutel等報道首例散發(fā)的CADASIL患者,并經(jīng)測序證實患者NOTCH3基因的第4外顯子存在致病性錯義突變。對于散發(fā)的多發(fā)性梗死癡呆患者,即使沒有明確的家族史也應(yīng)考慮本病的可能性,由此可見家族遺傳史也不是診斷CADASIL的必備條件。病理活檢為有創(chuàng)傷性檢查,患者接受程度差,且相關(guān)轉(zhuǎn)基因小鼠實驗表明,特異性小動脈中層平滑肌細胞表面GOM沉積僅在疾病晚期才出現(xiàn),對臨床早期及臨床前期患者診斷意義較低。故與CADASIL表現(xiàn)相似的疾病鑒別時,NOTCH3基因突變檢測成為主要鑒別點,是目前從分子水平上診斷CADASIL的重要指標(biāo)。本研究共檢測出3種突變類型(90Arg→Cys,134Cys→Tyr,141Arg→Cys),與國外同類研究結(jié)果一致,分別造成膜外區(qū)第2、3EGF-like區(qū)Cys數(shù)量的奇數(shù)化,均為雜合錯義突變,其中一種為高度保守的Cys被Tyr替換,另外一種為Cys替代Arg。Cys134Tyr突變類型目前國內(nèi)尚無報道。上述3種突變類型均未在正常對照組中發(fā)現(xiàn)。所發(fā)現(xiàn)的NOTCH3基因致病性突變均存在于第3、第4外顯子,國內(nèi)王朝霞等進行相關(guān)CADASIL家系基因突變研究,共發(fā)現(xiàn)4種NOTCH3基因的突變類型,其中3種存在于第3外顯子,1種存在于第11外顯子。結(jié)合本研究結(jié)果,提示第3、第4外顯子亦可能是中國CADASIL患者的熱點突變區(qū)。建議在對中國CADASIL患者進行基因檢測時,首先檢測上述兩個突變位點,如未發(fā)現(xiàn)致病性突變,再進行其他的外顯子檢測。本研究同時發(fā)現(xiàn)多個多態(tài)類型,突變發(fā)生在內(nèi)含子區(qū)及外顯子區(qū),但均未造成Cys殘基數(shù)量的改變,多為同義突變,故無臨床意義。CADASIL的自然病程多為30歲出現(xiàn)伴有先兆的偏頭痛,10年后出現(xiàn)首次卒中發(fā)作,20～30年后出現(xiàn)皮質(zhì)下癡呆,病程多為20～30年。CADASIL的整個病程是千變?nèi)f化的,即使在同一個家系,病程的表現(xiàn)差異也很大,所以對家庭成員進行早期基因檢測,可及時發(fā)現(xiàn)臨床前期的患者。本研究對CADASIL家系1及家系2先證者的一級親屬進行相同位點基因檢測,發(fā)現(xiàn)了2例臨床前期患者(見家系譜圖所示家系1Ⅲ3及家系2Ⅲ7),具有與先證者相同基因位點突變,但無相應(yīng)的臨床癥