翹嘴3個(gè)群體及其家系遺傳結(jié)構(gòu)分析

翹嘴3個(gè)群體及其家系遺傳結(jié)構(gòu)分析

隸屬于圓錐體科。它是科可可分為子和科可分為子。它通常被稱為桂花魚、胖魚和秋季魚。它是中國(guó)著名的魚類育種對(duì)象。近年來(lái),由于江河捕撈過(guò)度、水環(huán)境日益惡化、傳統(tǒng)人工選育導(dǎo)致的近親配種多發(fā)等系列問(wèn)題,導(dǎo)致了翹嘴鱖種質(zhì)資源呈現(xiàn)大幅度衰退現(xiàn)象?，F(xiàn)階段育種工作應(yīng)注重對(duì)具有較高遺傳多樣性水平的翹嘴鱖繁殖群體進(jìn)行利用和保護(hù),最大限度地避免近交衰退。因此,收集和保存各地翹嘴鱖群體,分析不同群體的遺傳結(jié)構(gòu)和群體間的遺傳差異,進(jìn)一步篩選具有育種優(yōu)勢(shì)的品系,抑制養(yǎng)殖群體的遺傳退化,有利于種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)、利用和評(píng)價(jià)。微衛(wèi)星標(biāo)記(MicrosatelliteDNAmarker)為近年來(lái)發(fā)展迅速的分子標(biāo)記之一,常應(yīng)用于群體遺傳學(xué)分析、基因定位連鎖作圖、親子鑒定等,在魚類輔助育種中具有其它標(biāo)記不可比擬的優(yōu)勢(shì),已被廣泛應(yīng)用于鯽(Carassiusauratus)、斑馬魚(Daniorerio)和牙鲆(Paralichthysolivaceus)等多種水產(chǎn)動(dòng)物的遺傳背景分析和遺傳連鎖圖譜構(gòu)建等方面。本研究利用文獻(xiàn)篩選的翹嘴鱖的29個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記,對(duì)來(lái)自廣東、湖北翹嘴鱖養(yǎng)殖群體和長(zhǎng)江野生群體3個(gè)群體及建立的F1代9個(gè)家系進(jìn)行多樣性研究和比較,探討鱖資源的遺傳多樣性現(xiàn)狀,為下一步翹嘴鱖的家系選育提供分子水平的佐證,同時(shí)為翹嘴鱖的資源開(kāi)發(fā)利用提供遺傳學(xué)背景資料。1材料和方法1.1群體內(nèi)各家系間連作2010年5月,分別從廣東省佛山市南海區(qū)石啃魚苗場(chǎng)和武漢市佳恒水產(chǎn)有限公司引進(jìn)種苗5000尾,選留500尾具備生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的個(gè)體為作為廣東養(yǎng)殖群體和湖北養(yǎng)殖群體的建系親本,2012年3月從湖北省嘉魚縣長(zhǎng)江白沙洲段捕撈50尾1kg以上2齡個(gè)體作為野生群體的建系親本。對(duì)這3個(gè)群體進(jìn)行強(qiáng)化培育以加快親魚性成熟,然后分別從中挑選體格健壯、性腺發(fā)育成熟、無(wú)病癥和外傷的個(gè)體構(gòu)建全同胞或半同胞家系。采用群體內(nèi)個(gè)體巢式交配設(shè)計(jì),1尾雌性親魚擠出的卵子分別與3個(gè)雄性親魚的精子進(jìn)行人工受精,建立了30個(gè)雜交組合家系,其中湖北養(yǎng)殖群體9個(gè),廣東養(yǎng)殖群體9個(gè),長(zhǎng)江野生群體12個(gè)。經(jīng)過(guò)選育和淘汰,3個(gè)群體各保留3個(gè)家系,共計(jì)9個(gè)(圖1),每個(gè)家系采樣8尾用于后續(xù)分析。微衛(wèi)星引物選取文獻(xiàn)報(bào)道的翹嘴鱖微衛(wèi)星引物序列共29對(duì)用于各翹嘴鱖群體的微衛(wèi)星分析,引物由北京擎科生物公司合成。1.2測(cè)試方法1.2.1蛋白提取與鑒定剪取少量翹嘴鱖尾鰭,單蒸水清洗后蛋白酶K消化處理3～4h,加入ProteinPrecipitationSolution去除蛋白,異丙醇沉淀析出DNA,70%乙醇漂洗兩次,待乙醇揮發(fā)后用100μLTE緩沖液(10mmol/LTris-HCl,1mmol/LEDTA,pH=8.0)溶解過(guò)夜。通過(guò)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性,分光光度計(jì)檢測(cè)DNA純度和濃度,-20℃保存。1.2.2pcr反應(yīng)條件翹嘴鱖微衛(wèi)星重復(fù)序列的擴(kuò)增:根據(jù)已開(kāi)發(fā)的29個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)兩端的保守區(qū)域序列設(shè)計(jì)合成特異引物,以親本群體翹嘴鱖基因組DNA為模板,PCR反應(yīng)體系:總體積為50μL,其中10×Buffer緩沖液5μL,dNTP4μL,Taq酶0.25μL,引物各0.5μl,模板2μL,補(bǔ)充滅菌雙蒸水(ddH2O)至50μL。PCR反應(yīng)條件如下:94℃預(yù)變性4min,94℃變性30s,在合適溫度退火40s,72℃延伸45s,進(jìn)行38個(gè)循環(huán),72℃終延伸8min。擴(kuò)增產(chǎn)物首先在1.2%瓊脂糖凝膠上檢驗(yàn)擴(kuò)增效果,然后在6%聚丙烯酰胺凝膠經(jīng)垂直電泳分離后銀染法檢測(cè)。1.2.3roingers檢測(cè)群體間的熱價(jià)分布根據(jù)微衛(wèi)星位點(diǎn)PCR產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜的變異范圍和特征,直接從表型獲知其基因型,通過(guò)與分子標(biāo)記pBR322DNA/MspI比較來(lái)判讀等位基因位置及大小。用χ2檢驗(yàn)和馬可夫鏈方法(Markovchainmethod)檢測(cè)群體的Hardy-Weinberg平衡;利用PopGen軟件分析有效等位基因數(shù)(Ne)、基因觀測(cè)雜合度(Ho)、基因期望雜合度(He)、Shannon指數(shù)(I)及群體間遺傳距離(Ds)及基因流(Nm)等指標(biāo);采用固定指數(shù)Fis評(píng)估種群內(nèi)個(gè)體間的近交程度:Fis=1-Ho/He,根據(jù)基因頻率分布估計(jì)各基因座在群體中的基因雜合度和多態(tài)信息含量;使用arlequin3.5軟件對(duì)群體間遺傳分化系數(shù)(Fst)和分子變異(AMOVA)情況進(jìn)行分析。根據(jù)不同群體及家系間的遺傳距離矩陣,利用R軟件建立UPMEGA系統(tǒng)樹(shù)。2結(jié)果與分析2.1pcr擴(kuò)增多態(tài)性通過(guò)3個(gè)群體中選擇的17個(gè)親本進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增,篩選多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)發(fā)現(xiàn),29對(duì)引物中,有3對(duì)未檢測(cè)到理想擴(kuò)增帶型,14個(gè)基因座位點(diǎn)的擴(kuò)增圖譜顯示為單態(tài),12個(gè)基因座位點(diǎn)產(chǎn)物帶型清晰、呈現(xiàn)出較好的多態(tài)性。經(jīng)過(guò)比較和篩選,選擇D290、D295、D300、D303、SC31這5個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星座位用于9個(gè)子代家系的遺傳分析,5個(gè)微衛(wèi)星座位詳細(xì)參數(shù)見(jiàn)表1。2.2聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜的構(gòu)建利用D290、D295、D300、D303、SC31座位對(duì)家系進(jìn)行微衛(wèi)星分析。從聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜中直接獲得每個(gè)個(gè)體的基因型,對(duì)等位基因的分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果見(jiàn)表2。統(tǒng)計(jì)顯示,大部分條帶在不同群體中共享,但有些群體具有一些特有帶型:湖北D290C、D303D、SC31C,長(zhǎng)江D290G、D295D。2.3群體遺傳多樣性5個(gè)微衛(wèi)星座位在子代群體共計(jì)72個(gè)個(gè)體均獲得了穩(wěn)定、清晰的DNA條帶,并在個(gè)體間表現(xiàn)出不同程度的多態(tài)性。電泳圖譜結(jié)果統(tǒng)計(jì)表明,5個(gè)微衛(wèi)星座位共檢測(cè)到23個(gè)等位基因,平均等位基因數(shù)4.6個(gè),片段長(zhǎng)度在168-292bp之間。5個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)在不同家系中的觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、基因觀測(cè)雜合度(Ho)、基因期望雜合度(He)、香農(nóng)指數(shù)(I)及固定指數(shù)(Fis)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果分別見(jiàn)表3。不同家系的期望雜合度在0.4-0.7之間,均具有較高的多態(tài)性,群體的He平均值分別為:湖北養(yǎng)殖群體0.5472,長(zhǎng)江野生0.4811,廣東養(yǎng)殖0.4634,顯示出其遺傳多態(tài)性關(guān)系為湖北養(yǎng)殖群體(BF)>長(zhǎng)江野生群體(WBF)>廣東養(yǎng)殖群體(DF)。不同家系的Fis值大部分為負(fù)值,顯示雜合子過(guò)剩,其中WBF2群體的平均Fis最小(-0.5336),WBF3群體的平均Fis最大(-0.1275)。根據(jù)Botstein等提出的衡量基因變異程度高低的劃分標(biāo)準(zhǔn),本研究所選用的5個(gè)微衛(wèi)星座位在子代群體中的多態(tài)信息(PIC)分別為D290:0.7289,D295:0.6097,D300:0.4377,D303:0.5208,SC31:0.4068,平均為0.5372,5個(gè)標(biāo)記具有較豐富的多態(tài)性,可作為鱖魚原種群體遺傳多樣性分析的有效微衛(wèi)星標(biāo)記。2.4遺傳距離測(cè)定不同家系群體之間的遺傳分化系數(shù)Fst和遺傳距離見(jiàn)表4。群體內(nèi)遺傳變異最大為0.7564,最小為0.1336,表明家系間的遺傳距離差異較大。利用arlequin的分子方差分析(AMOVA)表明,群體內(nèi)部的變異占總變異的83.33%,群體間的變異僅占總變異的16.67%(見(jiàn)表5)。2.5群體間關(guān)系間關(guān)系基于3個(gè)群體及子代家系之間的遺傳距離,運(yùn)用R軟件進(jìn)行聚類分析,構(gòu)建UPMGA系統(tǒng)樹(shù)。群體間關(guān)系如圖2所示,長(zhǎng)江野生群體與廣東養(yǎng)殖群體首先聚類,然后再與湖北養(yǎng)殖群體匯聚。然而,不同家系間卻未按照群體關(guān)系進(jìn)行聚類(圖3),結(jié)合分子方差分析結(jié)果顯示,群體內(nèi)的變異是總變異的主要來(lái)源,不同家系間分化顯著,導(dǎo)致了9個(gè)子代家系并未完全按原群體聚類。3種質(zhì)資源的多樣性本研究中各家系群體的期望雜合度、香農(nóng)指數(shù)等參數(shù)統(tǒng)計(jì)分析表明,3個(gè)群體遺傳多樣性關(guān)系為:湖北養(yǎng)殖群體>長(zhǎng)江野生群體>廣東養(yǎng)殖群體。等位基因分布分析顯示,大部分等位基因在翹嘴鱖不同群體中共享,與長(zhǎng)江野生群體比較,湖北養(yǎng)殖群體表現(xiàn)出部分等位基因發(fā)生了丟失,同時(shí)亦產(chǎn)生了一些新的基因。一般研究認(rèn)為,養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性要低于野生群體,然而湖北養(yǎng)殖群體遺傳多樣性較高的主要原因是由于其(武漢市佳恒水產(chǎn)有限公司)種源最初源于武漢市江夏區(qū)湯遜湖(屬于內(nèi)陸隔離型淡水湖泊),并不斷從湖北地區(qū)多個(gè)隔離水域中收集優(yōu)良翹嘴鱖種質(zhì)資源,每隔3年更新一次親本,經(jīng)過(guò)人工群體選育后甚至產(chǎn)生了一些新的特有基因,保持了翹嘴鱖種質(zhì)資源的多態(tài)性。本研究中,廣東養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性相對(duì)較低,而遺傳距離UPMGA系統(tǒng)樹(shù)顯示,廣東群體與長(zhǎng)江群體聚類(P<0.01),表明廣東養(yǎng)殖群體最初是源自長(zhǎng)江野生群體,后來(lái)在人工養(yǎng)殖翹嘴鱖時(shí),為得到其高質(zhì)量和高產(chǎn)量,人們經(jīng)常篩選某一特定基因型的個(gè)體,從而使某些基因從基因庫(kù)中流失,隱性純合位點(diǎn)數(shù)增加,使人工繁殖群體遺傳多樣性降低。研究表明,通過(guò)微衛(wèi)星標(biāo)記評(píng)估親本群體的遺傳力,從基因組水平評(píng)估個(gè)體間遺傳差異,可以極大限度地避免近交繁育。在家系選育時(shí),通過(guò)個(gè)體之間的親緣關(guān)系聚類分析,可以有效地避免種質(zhì)資源的近交衰退,更好地輔助家系的建立及選育。由表5可知,群體內(nèi)部的變異占總變異的83.33%,群體之間的變異占總變異的16.67%,可見(jiàn)群體內(nèi)的變異是總變異的主要來(lái)源,這也導(dǎo)致了9個(gè)子代家系并未完全按原群體聚類。從家系育種的角度講,同一群體的子代間分化顯著,表明親本雜合度較高,為今后建立多性狀分支家系育種提供了優(yōu)良種質(zhì)。魚類具有遺傳多樣性是遺傳改良和提高品質(zhì)的重要遺傳