植物根結(jié)線線線蟲病放線菌的分離鑒定

植物根結(jié)線線線蟲病放線菌的分離鑒定

根生殖器類（meloidol.）是一個(gè)廣泛寄生于植物根部的致病性生物，會(huì)對蔬菜、果樹、藥用植物和其他經(jīng)濟(jì)作物造成嚴(yán)重危害。過去對根結(jié)線蟲的防治多采用化學(xué)殺蟲劑,不但生產(chǎn)成本高,而且毒性大、殘留多,對環(huán)境造成了極大污染。放線菌被認(rèn)為是抗生素的主要產(chǎn)生菌。近幾十年來,陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了由放線菌產(chǎn)生的莫比霉素(Milbemycin)、南昌霉素(Nanchangmycin)和阿維菌素(Avermectins)等高活性殺線蟲抗生素,其中阿維菌素的應(yīng)用已取得良好效果。但較高的生產(chǎn)成本和線蟲對其產(chǎn)生的抗藥性問題引起了人們的關(guān)注,因此尋找一類理想的殺線劑,將是一項(xiàng)相當(dāng)必要的工作。一直以來,對于控制植物寄生線蟲的研究主要集中在真菌,對放線菌的研究僅僅在其代謝產(chǎn)生的活性物質(zhì)方面,真正把放線菌作為活體菌劑來防治植物寄生線蟲的研究卻很少,且尚未見成功報(bào)道。本文從根結(jié)線蟲放線菌的分離、鑒定到生防測試作了比較系統(tǒng)的工作,以期探索放線菌在根結(jié)線蟲中的種群分布并找尋有應(yīng)用前景的生防菌株。1材料和方法1.1材料表面1.1.1采樣從北京、河北、山東、湖北、云南、海南的9個(gè)不同地點(diǎn),采集被根結(jié)線蟲寄生的植物根部,塑料袋密封于4℃保藏,一周內(nèi)處理樣品(表1)。1.1.2caco3和3g穩(wěn)定性ISP2培養(yǎng)基每升水含4g葡萄糖、4g酵母提取物、10g麥芽提取物、2gCaCO3和15g瓊脂。液體培養(yǎng)基每升水含10g葡萄糖、10g可溶性淀粉、15g大豆粉、1gK2HPO4、0.5gMgSO4、0.5gNaCl、0.01gFeSO4和1gCaCO3。1.1.3主要試劑和設(shè)備PCR試劑購于上海申能博彩公司,倒置顯微鏡。1.2離子束調(diào)控,去病蟲根據(jù)植物地上部分的癥狀,將采集的病根和土一起放入塑料袋中。用30μm、200μm孔徑篩網(wǎng)分別收集病根中的卵和雌蟲,用1%的次氯酸鈉(NaClO)處理1min后,無菌水沖洗3次去掉殘留的NaClO。經(jīng)過以上消毒步驟,附生在蟲卵或幼蟲上的細(xì)菌或真菌均不能存活。1.3成蟲的消毒培養(yǎng)將一定濃度的卵懸液涂布于PDA(Potatodextroseagar)培養(yǎng)基上(約300個(gè)/皿);將消毒的雌蟲夾碎,在PDA平板上多處點(diǎn)接,28℃培養(yǎng)。待長出放線菌落后,將其挑至ISP2(yeastextract-maltextractagar)培養(yǎng)基上純化,并刮取純培養(yǎng)物于20%甘油中-20℃保藏。1.4形態(tài)培養(yǎng)特征的觀察使用ISP2培養(yǎng)基和插片法。顯微鏡觀察形態(tài),肉眼觀察培養(yǎng)特征,記錄氣絲、基絲和色素情況。1.5對羥基氨基酸的分析采用Hasegawa的薄層層析法(Thinlayerchromatography)進(jìn)行細(xì)胞壁二氨基庚二酸(DAP)組分分析。1.61rna基因測序按Chun等報(bào)道的方法提取總DNA和PCR擴(kuò)增16SrRNA基因,引物為通用保守引物27f和1495r。測序由北京諾賽基因組研究中心完成。測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行BLAST,確定分離菌株的分類地位。1.7對菊花的起源的研究1.7.1tween-80單次給藥法將平板上生長的菌落移入裝有5mL無菌0.05%Tween-80的離心管內(nèi),漩渦震蕩1min即得孢子懸液。使用顯微鏡和血球計(jì)數(shù)板調(diào)整孢子濃度為105個(gè)/mL。1.7.2干昆蟲懸液制備從被Meloidogynehapla(北方根結(jié)線蟲)感染的溫室盆栽煙草根部收集蟲卵,并懸浮于蒸餾水中,濃度約為6000個(gè)/mL。1.7.3孔細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)取0.05mL卵懸液和1mL孢子懸液,滴入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,28℃共培養(yǎng)4d后,在倒置顯微鏡下隨機(jī)觀察100個(gè)卵,將從卵里或卵外長出菌絲的卵再培養(yǎng)3d后,確定卵的孵化率和幼蟲死亡率。1.8溫室游泳池測試1.8.1液體培養(yǎng)基的制備選出卵寄生率和幼蟲死亡率相對較高的4株菌(1-17,2-6,5-1,9-47),制成105個(gè)/mL的孢子懸液,取5mL接種于150mL的液體培養(yǎng)基中,28℃培養(yǎng)3～7d后,加入吸附劑(草炭∶硅藻土=1∶1)與液體培養(yǎng)基等體積混合,室溫避光干燥制成粉末。1.8.2塑料盤的預(yù)處理將BCAs加入無菌土壤(0.08mg/g土)混合均勻后,裝入72孔塑料盤中。將兩粒番茄種子撒入每個(gè)小孔培育3周后,幼苗移栽到Ф10cm塑料缽里,其內(nèi)裝有5000個(gè)Meloidogynehapla卵和5gBCAs混合的土壤,30℃培養(yǎng)兩月后,取出植物根部確定病情指數(shù)。2結(jié)果2.1放線菌采后生長從11份根部樣品中共分離得到形態(tài)或培養(yǎng)特征各異的放線菌20株。其中16株具有柔曲或螺旋的孢子鏈,基絲無橫隔、不斷裂;3株氣絲稀少不形成孢子鏈,或基絲、氣絲斷裂;1株頂向出芽、氣絲縊縮斷裂形成孢子。2.2ll-dap分離菌株有兩種不同的二氨基庚二酸組成:①16株(1-4,1-6,1-12,1-16,1-17,1-18,1-19,1-25,2-1,2-2,2-6,2-8,3-4,6-14,9-47,12-92)只含LL-DAP;②4株(1-1,2-4,2-11,5-1)只含meso-DAP。結(jié)合形態(tài)和DAP組成,可以確定①為鏈霉菌②為稀有放線菌。2.316個(gè)mrna基因序列分析序列分析結(jié)果顯示(表2),分離菌株中16株為鏈霉菌、3株為諾卡氏菌、1株為假諾卡氏菌。2.4幼蟲死亡率測定選取14株分離菌進(jìn)行卵寄生率、卵孵化率、幼蟲死亡率測試。結(jié)果表明:絕大多數(shù)分離菌株對卵表現(xiàn)出了較高的寄生率并抑制了卵的孵化,所有菌株對幼蟲都有致死作用(表3)。2.5諾卡氏菌的防效所有分離菌株中,3株鏈霉菌(1-17,2-6,9-47)和1株諾卡氏菌(5-1)具有較高的防效,分別為31.4%、37.7%、56.4%和42.4%(表3)。3分離菌株與根結(jié)線蟲的相互作用目前,對于定殖或寄生于根結(jié)線蟲和胞囊線蟲雌蟲和卵上的真菌進(jìn)行了大量研究,但對于定殖或寄生于線蟲卵和雌蟲的放線菌的研究還很少。我們對其進(jìn)行研究,一方面是為了了解放線菌在線蟲和蟲卵中的種群分布情況,另外還希望從土壤以外的生境中,找到產(chǎn)生新生物活性物質(zhì)和具有生防潛能的放線菌菌株。放線菌在自然環(huán)境中的分布非常廣泛,其中鏈霉菌在許多生物環(huán)境中都是優(yōu)勢菌群。本實(shí)驗(yàn)從植物病根的根結(jié)線蟲中,分離得到3個(gè)不同屬的放線菌20株,其中鏈霉菌的數(shù)量同樣占絕對優(yōu)勢,但分離菌株的數(shù)量和種類都不如自然環(huán)境多。推測這可能與分離方法、培養(yǎng)時(shí)間和兩類生物間的互作有一定關(guān)系。放線菌作為一類控制植物病原傳播的重要微生物資源,對病原生物有很高的拮抗作用和寄生性。我們測定分離菌株對卵的寄生率、卵孵化率和幼蟲死亡率,是為了篩選生防效果較好的菌株。研究結(jié)果表明:大多數(shù)鏈霉菌和諾卡氏菌對卵的寄生率和幼蟲死亡率都比較高,假諾卡氏菌較低。鏈霉菌和諾卡氏菌都是重要生物活性物質(zhì)的產(chǎn)生菌,所以我們認(rèn)為:分離菌株與根結(jié)線蟲的拮抗機(jī)制可能與菌株的代謝產(chǎn)物有關(guān)。放線菌作為根結(jié)線蟲的生防菌株具有巨大的潛能,從溫室盆栽試驗(yàn)結(jié)果看,和Streptomycesrubrogriseus(紅灰鏈霉菌)、Streptomycescapoamus(上升島鏈霉菌)、Streptomycesgriseus(灰色鏈霉菌)和Nocardiacarnea(肉色諾卡氏菌)4個(gè)種親緣關(guān)系較近的菌株生防效率相對較高?；壹t鏈霉菌和肉色諾卡氏菌的活性產(chǎn)物先前未見報(bào)道;灰色鏈霉菌和上升島鏈霉菌已報(bào)道產(chǎn)生多種活性物質(zhì),但我們的分離菌株對線蟲的防效并未達(dá)到預(yù)期結(jié)果。我們推測引入的分離菌株對根結(jié)線蟲進(jìn)行生物防治受