基因功能研究技術(shù)

第六章分子生物學(xué)研究法〔下〕基因功能研究技術(shù)隨著越來越多的基因組序列相繼被測定，人類對生物本質(zhì)的認(rèn)識已經(jīng)發(fā)生了重大變化。但是，海量序列信息也向我們提出了新的挑戰(zhàn)。如何開發(fā)利用這些序列信息，如何通過生物化學(xué)、分子生物學(xué)等方法研究基因的功能，從而進一步了解生物體內(nèi)各種生理過程，了解生物體生長發(fā)育的調(diào)節(jié)機制，了解疾病的發(fā)生、開展規(guī)律，給出控制、減緩甚至完全消除人類遺傳疾病，是新時期生物學(xué)家所面臨的主要問題。轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)、原位雜交技術(shù)、基因芯片技術(shù)為研究單個或多個基因在生物體某些特定發(fā)育階段或在不同環(huán)境條件下的表達模式提供了強有力的手段。用基因定點突變〔site-directedmutagenesis〕技術(shù)、基因敲除技術(shù)、RNAi技術(shù)可以全部或局部抑制基因的表達，通過觀察靶基因缺失后生物體的表型變化研究基因功能。酵母單雜交、雙雜交技術(shù)，四分體技術(shù)等都是研究蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)-DNA相互作用等的重要手段。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的開展，研究者可以在活細胞內(nèi)和細胞外研究蛋白質(zhì)之間的相互作用，為認(rèn)識信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、蛋白質(zhì)翻譯后修飾加工等提供了豐富的技術(shù)支持。本章將主要介紹研究基因功能的各種分子生物學(xué)技術(shù)和方法。6.1基因表達研究技術(shù)6.1.轉(zhuǎn)錄組分析和RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組〔transcriptome〕，廣義上指在某一特定生理條件或環(huán)境下，一個細胞、組織或者生物體中所有RNA的總和，包括信使RNA〔mRNA〕、核糖體RNA〔rRNA〕、轉(zhuǎn)運RNA〔tRNA〕及非編碼RNA〔non-codingRNA或sRNA〕；狹義上特指細胞中轉(zhuǎn)錄出來的所有mRNA的總和。基因組－轉(zhuǎn)錄組－蛋白質(zhì)組〔genome－transcriptome－proteome〕是中心法那么在組學(xué)框架下的主要表現(xiàn)形式。通過特定生理條件下細胞內(nèi)的mRNA豐度來描述基因表達水平并外推到最終蛋白質(zhì)產(chǎn)物的豐度是目前基因表達研究的根本思路。轉(zhuǎn)錄組研究的根本方法包括基因芯片技術(shù)〔genechip〕和轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)。我們將在節(jié)詳細表達基因芯片技術(shù)，這里主要討論轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的原理和應(yīng)用?；趥鹘y(tǒng)的Sanger測序法對轉(zhuǎn)錄組進行研究的方法主要包括：表達序列標(biāo)簽〔expressedsequencetag，EST〕測序技術(shù)，基因表達系列分析技術(shù)〔serialanalysisofexpression，SAGE〕。EST測序數(shù)據(jù)是目前數(shù)量最多，涉及物種最廣的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，但測序讀長較短〔每個轉(zhuǎn)錄本測定400bp－500bp〕，測序通量小，測序本錢較高，而且無法通過測序同時得到基因表達豐度的信息。有人使用SAGE測序法，將不同轉(zhuǎn)錄本3’端第一個CATG位點下游14bp長的短標(biāo)簽序列來標(biāo)識相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本。由于標(biāo)簽序列較短，可以將多個標(biāo)簽串聯(lián)測序，使SAGE法相對于EST測序在通量上大大提高。但過短的序列標(biāo)簽使得序列唯一性降低，即使改良過的LongSAGE用21bp標(biāo)簽測序，仍然有約一半的標(biāo)簽無法被準(zhǔn)確注釋到基因組上。高通量測序技術(shù)〔high-throughputsequencing〕，又名二代測序〔second-generationsequencing〕或深度測序〔deepsequencing〕，可以一次性測序幾十萬甚至幾百萬條序列，是傳統(tǒng)測序技術(shù)的一次革命。主要有Roche公司研發(fā)的454測序平臺和Illumina公司的Solexa測序平臺〔表6-1〕。表6-1454和Illumina高通量測序平臺比擬454Illumina讀取長度〔bp〕約70050－150單次測序數(shù)據(jù)量700Mb600Gb測序周期23小時7－14天測序本錢較高低雖然都是基于“邊合成邊測序〔sequencingbysynthesis，SBS〕〞，但是454和Illumina的實現(xiàn)方法有很大的不同。454系統(tǒng)采用焦磷酸測序〔pyrosequencing〕原理，如圖6-1a所示，在DNA聚合酶的作用下，按照T、A、C、G順序參加的單個dNTP與模板的下一個堿基配對，同時釋放一個分子的焦磷酸(PPi)，在ATP硫酸化酶的作用下，PPi和腺苷酰硫酸〔adenosine-5’-phosphosulfate,APS〕結(jié)合形成ATP，在螢光素酶的催化下，ATP和螢光素結(jié)合形成氧化螢光素，產(chǎn)生可見光，被CCD捕捉。而Illumina系統(tǒng)〔圖6-1b〕采用帶有螢光標(biāo)記的dNTP，其3’羥基末端帶有可被化學(xué)切割的局部，每個循環(huán)反響只允許摻入一個堿基，由激光掃描反響板外表，讀出這一輪反響新加的螢光信號，從而判定堿基種類。之后，經(jīng)過化學(xué)切割恢復(fù)3’端粘性，進行下一輪聚合反響。從上述描述中不難看出，隨著反響的進行，已有螢光信號會使新的熒光難以準(zhǔn)確分辨，因此該方法的測序讀長較短，測序錯誤主要是堿基替換。而454那么由于缺少終止反響的元件，相同堿基的連續(xù)摻入常會帶來利用高通量測序技術(shù)對轉(zhuǎn)錄組進行測序分析，對測序得到的大量原始讀長〔reads〕進行過濾、組裝及生物信息學(xué)分析的過程被稱為RNA-Seq。對于有參考基因組序列的物種，需要根據(jù)參考序列進行組裝〔referenceassembly〕，對于沒有參考序列的，需要進行從頭組裝〔denovoassembly〕，利用大量讀長之間重疊覆蓋和成對讀長〔pair-endreads〕的相對位置關(guān)系，組裝得到盡可能完整的轉(zhuǎn)錄本，并以單位長度轉(zhuǎn)錄本上覆蓋的讀長數(shù)目〔readsperkilo-basegenepermillionbases，RPKM〕作為衡量基因表達水平的標(biāo)準(zhǔn)〔圖6-2〕。在實際組裝過程中，圖中紅色標(biāo)示區(qū)域覆蓋度過低，且讀長缺乏相對位置信息的區(qū)域，其可信度較低，應(yīng)當(dāng)剔除，保存兩側(cè)序列?，F(xiàn)以棉花轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)為例，簡單分析不同組織或纖維不同發(fā)育時期基因表達情況〔表6-2〕。Illumina平臺測序得到26.86Gb數(shù)據(jù)，經(jīng)過從頭組裝總共獲得了42,773條非重復(fù)序列，平均長度1,054堿基。每個不同組織中分別有23,265至26,427個獨立轉(zhuǎn)錄本。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)不但能用來分析不同組織中獨立轉(zhuǎn)錄本數(shù)量，還被用于分析特定轉(zhuǎn)錄本在某個組織中的表達強度〔表6-3〕。RNA-Seq還可以用于轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄本SNP檢測、非編碼區(qū)功能鑒定以及挖掘低豐度轉(zhuǎn)錄本等研究。表6-2陸地棉6個組織的RNA-Seq數(shù)據(jù)分析組織樣品讀長數(shù)堿基數(shù)Q201(%)N50獨立基因總數(shù)獨立基因長度(nt)開花后0天胚珠47907298359304735082726427778開花后5天胚珠53022210397666575084223520786花48049786360373395082323265775葉54191238406434285082025280776根79438254714944286078623905753莖49713024447417216078224088746總計3323218102686140492013064277310541Q20，測序準(zhǔn)確率到達99％。表6-3棉花組織特異性轉(zhuǎn)錄因子表達強度分析序列標(biāo)識基因RPKM序列標(biāo)識基因RPKM根莖根莖Unigene58528MYB-LUnigene85367FAR10.4065.51Unigene58563B3Unigene29146HD-ZIP0.0044.49Unigene58582B3Unigene51008HB0.2443.60Unigene58458DofUnigene18073MIKC0.1336.74Unigene55872DofUnigene64521MYB0.1531.71Unigene51911bHLHUnigene58698B30.0924.01Unigene58446NACUnigene62109MYB0.0418.45Unigene57837bHLHUnigene52681bZIP0.2017.62Unigene58640S1Fa-LUnigene64531G2-L0.3416.92Unigene55579B3Unigene64486bHLH0.0014.49轉(zhuǎn)錄組組裝過程中，同一個非重復(fù)序列上復(fù)蓋有來自根、莖等不同組織的讀長，不同讀長數(shù)目通過歸一化轉(zhuǎn)變?yōu)镽PKM值，進而篩選得到組織特異表達的轉(zhuǎn)錄因子。6.1.2RNA的選擇性剪接是指用不同的剪接方式〔選擇不同的剪接位點組合〕從一個mRNA前體產(chǎn)生不同的mRNA剪接異構(gòu)體的過程。一般將選擇性剪切分為如下幾類：平衡剪切、5’選擇性剪切、36.原位雜交(InSituHybridization，ISH)是用標(biāo)記的核酸探針，經(jīng)放射自顯影或非放射檢測體系，在組織、細胞、間期核及染色體上對核酸進行定位和相對定量研究的一種手段，通常分為RNA原位雜交和染色體原位雜交兩大類。RNA原位雜交用放射性或非放射性〔如地高辛、生物素等〕標(biāo)記的特異性探針與被固定的組織切片反響，假設(shè)細胞中存在與探針互補的mRNA分子，兩者雜交產(chǎn)生雙鏈RNA，就可通過檢測放射性標(biāo)記或經(jīng)酶促免疫顯色，對該基因的表達產(chǎn)物在細胞水平上做出定性定量分析〔圖6-6〕。熒光原位雜交〔fluorescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH〕技術(shù)首先對寡核苷酸探針做特殊的修飾和標(biāo)記，然后用原位雜交法與靶染色體或DNA上特定的序列結(jié)合，再通過與熒光素分子相耦聯(lián)的單克隆抗體來確定該DNA序列在染色體上的位置〔圖6-7〕。FISH技術(shù)不需要放射性同位素，實驗周期短，檢測靈敏度高，假設(shè)用經(jīng)過不同修飾的核苷酸分子標(biāo)記不同的DNA探針，還可能在同一張切片上觀察幾種DNA探針的定位，得到相應(yīng)位置和排列順序的綜合信息。6.1.定點突變是重組DNA進化的根底，該方法通過改變基因特定位點核苷酸序列來改變所編碼的氨基酸序列，常用于研究某個〔些〕氨基酸殘基對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、催化活性以及結(jié)合配體能力的影響，也可用于改造DNA調(diào)控元件特征序列，修飾表達載體，引入新的酶切位點等。由于迄今尚未建立能精確預(yù)測特定氨基酸殘基變化對整個蛋白結(jié)構(gòu)及活性影響的模型，選擇氨基酸突變的位點存在一定的盲目性。因為即使知道了該蛋白的三維結(jié)構(gòu)，人們?nèi)匀粺o法了解某個氨基酸殘基對其高級結(jié)構(gòu)的影響。少數(shù)幾個氨基酸殘基的改變，有時根本不影響靶蛋白的功能，有時影響了靶蛋白的活性位點，有時還能從根本上改變整個蛋白的高級結(jié)構(gòu)。所以，基因的定點突變是我們進一步了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的重要手段。最早在20世紀(jì)70年代初進行小噬菌體ΦX174單鏈基因組易突變位點圖譜分析工作時認(rèn)識到基因定點突變的可能性。在人工成功合成寡聚核苷酸、獲得高品質(zhì)DNA聚合酶和DNA連接酶的根底上，科學(xué)家建立了體外寡核苷酸介導(dǎo)的DNA突變技術(shù)〔圖6-8〕。PCR技術(shù)的出現(xiàn)大大促進了定點突變技術(shù)的開展，簡化了實驗操作程序，提高了突變效率?？茖W(xué)家主要采用兩種PCR方法，重疊延伸技術(shù)和大引物誘變法，在基因序列中進行定點突變。圖6-9闡述了重疊延伸介導(dǎo)的定點誘變機制。首先將模板DNA分別與引物對1〔正向誘變引物FM和反向引物R2〕和2〔正向引物F2和反向誘變引物RM〕退火，通過PCR1和2反響擴增出兩種靶基因片段。FMR2和RMF2片段在重疊區(qū)發(fā)生退火，用DNA聚合酶補平缺口，形成全長雙鏈DNA，進行PCR3擴增。最后，用引物F2和R2擴增出帶有突變位點的全長DNA片段〔PCR4〕。大引物誘變法首先用正向突變引物〔M〕和反向引物〔R1〕，擴增模板DNA產(chǎn)生雙鏈大引物〔PCR1〕，與野生型DNA分子混合后退火并使之復(fù)性，第二輪PCR中參加正向引物〔F2〕，與PCR1中產(chǎn)生的一條互補鏈配對，擴增產(chǎn)生帶有突變的雙鏈DNA〔圖6-10〕。由于F2的退火溫度顯著高于第一輪PCR所使用的引物M和R1，因此，可以忽略引物M和R1在本輪反響中所造成的干擾。獲得定點突變PCR產(chǎn)物以后，一般需進行DNA序列分析以驗證突變位點。與經(jīng)典定點突變方法相比，PCR介導(dǎo)的定點突變方法具有明顯的優(yōu)勢：1、突變體回收率高，以至于有時不需要進行突變體篩選；2、能用雙鏈DNA作為模板，可以在任何位點引入突變；3、可在同一試管中完成所有反響；4、快速簡便，無需在噬菌體M13載體上進行分子克隆。所以，PCR介導(dǎo)的定點突變方法已成為定點突變的主要技術(shù)。6.2基因敲除技術(shù)6.2.1根本原理經(jīng)典遺傳學(xué)〔Forwardgenetics〕是從一個突變體的表型出發(fā)，研究其基因型，進而找出該基因的編碼序列。在后基因組時代，大規(guī)?；蚬δ艿难芯空蔀樯茖W(xué)研究的熱點，現(xiàn)代遺傳學(xué)〔Reversegenetics，反向遺傳學(xué)〕首先從基因序列出發(fā)，推測其表現(xiàn)型，進而推導(dǎo)出該基因的功能?；蚯贸瞘eneknock-out〕又稱基因打靶，該技術(shù)通過外源DNA與染色體DNA之間的同源重組，進行精確的定點修飾和基因改造，具有專一性強、染色體DNA可與目的片段共同穩(wěn)定遺傳等特點。1985年，科學(xué)家利用同源重組將一段外源質(zhì)粒p△β117插入到人類染色體DNAβ-珠蛋白位點，首次在哺乳動物細胞中進行基因打靶并獲得成功。目前，在胚胎干細胞中進行同源重組已經(jīng)成為遺傳修飾基因組位點的常規(guī)技術(shù)。通過對這些基因敲除生物個體的表型分析，鑒定或推測該基因的生物學(xué)功能?；蚯贸譃橥耆蚯贸蜅l件型基因敲除〔又稱不完全基因敲除〕兩種。完全基因敲除是指通過同源重組法完全消除細胞或者動物個體中的靶基因活性，條件型基因敲除是指通過定位重組系統(tǒng)實現(xiàn)特定時間和空間的基因敲除。噬菌體的Cre/Loxp系統(tǒng)、Gin/Gix系統(tǒng)、酵母細胞的FLP/FRT系統(tǒng)和R/RS系統(tǒng)是現(xiàn)階段常用的四種定位重組系統(tǒng)，尤以Cre/Loxp系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛。1．完全基因敲除實驗中一般采用取代型或插入型載體〔圖6-11〕在ES細胞中根據(jù)正-負(fù)雙向選擇〔positive-negativeselection,PNS〕原理〔圖6-12〕進行完全基因敲除實驗。正向選擇基因neo通常被插入載體靶DNA功能最關(guān)鍵的外顯子中，或通過同源重組法置換靶基因的功能區(qū)。neo基因有雙重作用，一方面形成靶位點的插入突變，同時可作為正向篩選標(biāo)記。負(fù)向選擇基因HSV-tk〔humansemianvirus-thymidinekinase〕那么被置于目的片段外側(cè)，含有該基因的重組細胞不能在選擇培養(yǎng)基上生長。如果細胞中發(fā)生了隨機重組，負(fù)向選擇基因就可能被整合到基因組中，導(dǎo)致細胞死亡。由于基因轉(zhuǎn)移的同源重組自然發(fā)生率極低，動物的重組概率約為10-2～10-5，植物的概率為10-4～10-5，即使采用雙向選擇法也很難保證一次就從眾多細胞中篩選出真正發(fā)生了同源重組的胚胎干細胞，必須用PCR及Southern雜交等多種分子篩選技術(shù)驗證確實獲得了目的基因被敲除的細胞系。2．條件型基因敲除對于許多有重要生理功能的基因來說，完全基因敲除往往導(dǎo)致胚胎死亡，有關(guān)該基因功能的研究便無法開展。而條件型基因敲除，特別是應(yīng)用Cre/LoxP和FLP/FRT系統(tǒng)所開展的組織特異性敲除，由于其可調(diào)節(jié)性而受到科學(xué)家的重視。構(gòu)建條件型基因敲除打靶載體時，常將正向選擇標(biāo)記neor置于靶基因的內(nèi)含子中，并在靶基因重要功能域兩側(cè)內(nèi)含子中插入方向相同的LoxP位點〔圖6-13〕。當(dāng)實驗中需要消除靶基因活性時，與帶有Cre重組酶基因的ES細胞雜交，Cre重組酶就能把兩個LoxP位點中間的DNA片段切除，導(dǎo)致靶基因失活。標(biāo)記基因兩側(cè)也常常帶有LoxP序列，因為許多時候即使標(biāo)記基因位于內(nèi)含子中也會阻斷靶基因的轉(zhuǎn)錄。一旦出現(xiàn)這種情況，可以用Cre重組酶表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染中靶ES細胞，通過LoxP位點重組將neo抗性基因刪除。以Cre/loxp系統(tǒng)為根底，可以在動物的一定發(fā)育階段和一定組織細胞中實現(xiàn)對特定基因進行遺傳修飾。利用控制Cre表達的啟動子活性或所表達的Cre酶活性具有可誘導(dǎo)性的特征，人們常常通過設(shè)定誘導(dǎo)時間的方法對動物基因突變的時空特異性進行人為控制，以防止出現(xiàn)死胎或動物出生后不久即死亡的現(xiàn)象。6.2.2高等動物基因敲除技術(shù)胚胎干細胞〔ES細胞〕別離和體外培養(yǎng)的成功奠定了哺乳動物基因敲除的技術(shù)根底。真核生物基因敲除的技術(shù)路線主要包括構(gòu)建重組基因載體，用電穿孔、顯微注射等方法把重組DNA導(dǎo)入胚胎干細胞純系中，使外源DNA與胚胎干細胞基因組中相應(yīng)局部發(fā)生同源重組，將重組載體中的DNA序列整合到內(nèi)源基因組中并得以表達，主要實驗流程及篩選步驟如圖6-14所示。利用Neo基因替換目的基因外顯子IV至外顯子VI區(qū)段，得到腸堿性磷酸酶〔IntestinalAlkalinePhosphatase，IAP〕基因敲除的ES細胞，用顯微注射或電穿孔法將IAP基因敲除的ES細胞注入早期胚胎的囊胚腔中，誘導(dǎo)胚胎分化，獲得嵌合體胚胎后與野生型純合體胚胎回交，獲得由ES細胞分化產(chǎn)生的IAP基因敲除小鼠，實驗證明，純合小鼠體內(nèi)檢測不到IAP蛋白，而該基因的敲除導(dǎo)致小鼠變胖〔圖6-15〕。在條件型基因敲除實驗中，首先構(gòu)建帶有S6基因的LoxP打靶載體的ES細胞，經(jīng)過雜交篩選，獲得純合體小鼠；再與帶有肝組織特異性、受INF-α誘導(dǎo)的Mx-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，刪除neo和外顯子3-5，得到肝組織特異性敲除S6基因小鼠后發(fā)現(xiàn)，［3H］胸腺嘧啶不能摻入S6基因敲除小鼠肝組織，細胞不能進入S期，不能正常分裂增殖〔圖6-16〕。一般來說，動物基因敲除時用顯微注射胚胎干細胞命中率較高，技術(shù)難度相對大些。電穿孔法命中率比顯微注射低，但操作相對簡單易行。因為同源重組常常發(fā)生在某一條染色體上,要得到穩(wěn)定遺傳的純合體基因敲除模型，至少需要兩代以上的遺傳。除了基因敲除法，還有人用基因捕獲的方法通過隨機插入突變破壞靶基因表達〔圖6-17〕。基因捕獲載體包括一個無啟動子的報告基因〔通常為neor基因〕，當(dāng)該基因插入到ES細胞染色體某個部位，利用所在位點的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件得到表達時，該ES細胞就獲得在含G418的選擇性培養(yǎng)基上生長的能力。可通過分析標(biāo)記基因側(cè)翼cDNA或染色體DNA序列來獲得靶基因的相關(guān)信息。由于受整合位點附近染色質(zhì)區(qū)的影響，轉(zhuǎn)基因整合具有顯著的位置效應(yīng)，基因5’端啟動子和增強子區(qū)，3’端終止子區(qū)都會對轉(zhuǎn)基因的整合產(chǎn)生影響，這是某些打靶載體選擇組織特異性啟動子的原因之一。外源轉(zhuǎn)基因的有效表達有時還取決于其是否有內(nèi)含子，因為內(nèi)含子中存在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件可影響除了研究基因功能之外，基因敲除技術(shù)還被廣泛應(yīng)用于建立人類疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型，為醫(yī)學(xué)研究提供遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，為遺傳病的治療、為生物新品種的培育奠定新根底。6.2.3植物基因敲除技術(shù)由于動植物細胞結(jié)構(gòu)顯著不相同，植物細胞基因敲除常采用不同于動物細胞的策略。T-DNA插入失活技術(shù)是目前在植物中使用最為廣泛的基因敲除手段。T-DNA插入失活就是利用根瘤農(nóng)桿菌T-DNA介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，將一段帶有報告基因的DNA序列標(biāo)簽整合到基因組DNA上，如果這段DNA插入到目的基因內(nèi)部或附近，就會影響該基因的表達，從而使該基因“失活〞。由于該基因內(nèi)部或附近插入了一段序列的DNA，可據(jù)此設(shè)計引物，用PCR方法將被破壞的靶基因序列別離出來〔圖6-18A〕。假設(shè)將靶基因〔假定編碼區(qū)為900個堿基對〕兩端的引物L(fēng)P、RP及插入載體上的引物L(fēng)B參加同一反響體系中進行PCR，理論上能得到三種類型的條帶〔圖6-18B〕。野生型植株中，只有LP和RP引物配對擴增出來的靶基因條帶；如果實驗材料來自純合型基因敲除植株，那么，只有靶基因一端的引物可以與LB引物配對完成PCR擴增；如果實驗材料來自雜合型基因敲除植株，那么，PCR擴增后會同時出現(xiàn)兩種條帶。T-DNA無專一整合位點，在植物基因組中發(fā)生隨機整合，所以，只要突變株的數(shù)目足夠大，從理論上就可能獲得任何一個功能基因都發(fā)生突變的基因敲除植物庫。擬南芥基因組冗余序列少，基因密度高，幾乎每一個DNA插入都會導(dǎo)致某個基因功能的喪失，結(jié)合已完成的擬南芥基因組信息，人們很容易篩選到新的功能基因。已經(jīng)用T-DNA插入失活方法建立了擬南芥大規(guī)?；蚯贸蛔凅w庫，研究人員可以方便地在多個數(shù)據(jù)庫中檢索到感興趣基因的突變體，再開展深入的表型分析和功能研究。6.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)6.3.1酵母單雜交系統(tǒng)酵母單雜交系統(tǒng)〔yeastone-hybridsystem〕是上個世紀(jì)90年代中期開展起來的新技術(shù)，可識別穩(wěn)定結(jié)合于DNA上的蛋白質(zhì)，可在酵母細胞內(nèi)研究真核生物中DNA-蛋白質(zhì)之間的相互作用，并通過篩選DNA文庫直接獲得靶序列相互作用蛋白的編碼基因。此外，該體系也是分析鑒定細胞中轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子與順式作用元件相互作用的有效方法。酵母單雜交的根本原理如圖6-19所示，首先將的特定順式作用元件構(gòu)建到最根本啟動子〔minimalpromoter，Pmin〕的上游，把報告基因連接到Pmin下游。然后，將編碼待測轉(zhuǎn)錄因子cDNA與酵母轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域〔transcriptionactivationdomain,AD〕融合表達載體導(dǎo)入酵母細胞，該基因產(chǎn)物如果能夠與順式作用元件相結(jié)合，就能激活Pmin啟動子，使報告基因得到表達。目前，酵母單雜交體系主要被用于確定某個DNA分子與某個蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用，用于別離編碼結(jié)合于特定順式調(diào)控元件或其他DNA位點的功能蛋白編碼基因，驗證反式轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，準(zhǔn)確定位參與特定蛋白質(zhì)結(jié)合的核苷酸序列。由于該方法的敏感性和可靠性，現(xiàn)已被廣泛用于克隆細胞中含量極低且用生化手段難以純化的那局部轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。常用的酵母單雜交體系根本選用HIS3或LacZ作為報告基因，雖然有的體系將帶有報告基因的載體直接整合于酵母染色體上，在大局部的實驗中報告基因都位于質(zhì)粒DNA上。圖6-20是利用酵母單雜交體系和的順式作用元件DRE從擬南芥cDNA文庫中篩選轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的根本流程。實驗中如果將不同的未知基因與酵母GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域相融合，通過檢測位于GAL4順式作用元件下游的報告基因的表達狀況，還可以鑒定出該轉(zhuǎn)錄因子是否具有轉(zhuǎn)錄激活功能。6.3.2酵母雙雜交系統(tǒng)〔Yeasttwo-hybridsystem〕該體系巧妙地利用真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的組件式結(jié)構(gòu)〔modular〕特征，因為這些蛋白往往由兩個或兩個以上相互獨立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，其中DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域〔bindingdomain，BD〕和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域AD是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必須的。單獨的BD能與特定基因的啟動區(qū)結(jié)合，但不能激活基因的轉(zhuǎn)錄，而由不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的BD和AD所形成的雜合蛋白卻能行使激活轉(zhuǎn)錄的功能。實驗中，首先運用基因重組技術(shù)把編碼蛋白的DNA序列連接到帶有酵母轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子〔常為GAL1、GAL4或GCN1〕DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域編碼區(qū)〔BD〕的表達載體上。導(dǎo)入酵母細胞中使之表達帶有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的雜合蛋白，與報告基因上游的啟動調(diào)控區(qū)相結(jié)合，準(zhǔn)備作為“誘餌〞捕獲與蛋白相互作用的基因產(chǎn)物。此時，假設(shè)將的編碼轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域〔AD〕的DNA分別與待篩選的cDNA文庫中不同插入片段相連接，獲得“獵物〞載體，轉(zhuǎn)化含有“誘餌〞的酵母細胞。一旦酵母細胞中表達的“誘餌〞蛋白與“獵物〞載體中表達的某個蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的AD和BD結(jié)構(gòu)域就會被牽引靠攏，激活報告基因表達。別離有報告基因活性的酵母細胞，得到所需要的“獵物〞載體，就能得到與蛋白相互作用的新基因〔圖6-21〕。6.1、等離子外表共振技術(shù)該技術(shù)是將誘餌蛋白結(jié)合于葡聚糖外表，將葡聚糖層固定于納米級厚度的金屬膜外表。當(dāng)有蛋白質(zhì)混合物經(jīng)過時，如果有蛋白質(zhì)同“誘餌〞蛋白發(fā)生相互作用，那么兩者的結(jié)合將使金屬膜外表的折射率上升，從而導(dǎo)致共振角度的改變。而共振角度的改變與該處的蛋白質(zhì)濃度成線性關(guān)系，由此可以檢測蛋白質(zhì)之間的相互作用〔圖6-22〕。該技術(shù)不需要標(biāo)記物和染料，平安靈敏快速，還可定量分析。缺點是需要專門的等離子外表共振檢測儀器。圖6-23應(yīng)用SPR技術(shù)研究COI1蛋白與JAZ1蛋白之間的相互作用。研究人員首先在葡聚糖芯片外表固定1000共振單位的茉莉酸〔JA〕信號通路負(fù)調(diào)控因子JAZ1蛋白，當(dāng)體系中同時有茉莉酸－異亮氨酸〔JA-Ile〕及COI蛋白存在時，可以檢測到最高達380共振單位的SPR反響信號。參加一種在結(jié)構(gòu)和功能上與茉莉酸甲脂〔MeJA〕非常相似的名為冠毒素(COR)的細菌毒素，也能使COI1和JAZ1發(fā)生相互作用。2、免疫共沉淀技術(shù)(Co-ImmunoPrecipitation，CoIP)該技術(shù)的核心是通過抗體來特異性識別候選蛋白。首先，將靶蛋白的抗體通過親和反響連接到固體基質(zhì)上，再將可能與靶蛋白發(fā)生相互作用的待篩選蛋白參加反響體系中，用低離心力沉淀或微膜過濾法在固體基質(zhì)和抗體的共同作用下將蛋白復(fù)合物沉淀到試管的底部或微膜上。如果靶蛋白質(zhì)與待篩選蛋白發(fā)生了相互作用，那么，這個待篩選蛋白質(zhì)就通過靶蛋白與抗體和固體基質(zhì)相互作用而被別離出來〔圖6-24〕。免疫共沉淀實驗中常用pGADT7和pGBKT7質(zhì)粒載體分別以融合蛋白形式表達靶蛋白，體外轉(zhuǎn)錄、翻譯后將產(chǎn)物混合溫育，分別用Myc或HA抗體沉淀混合物，過柱后再用SDS－PAGE電泳別離，檢測兩個靶蛋白之間是否存在相互作用〔圖6-25〕。實驗說明，棉花乙烯合成酶基因ACS2與鈣離子依賴性蛋白激酶CDPK1之間存在相互作用，而該蛋白與CDPK32及CRK5沒有發(fā)生相互作用。ACO1與這三個蛋白都沒有發(fā)生相互作用〔圖6-26〕。3、GST及GAD融合蛋白沉降技術(shù)該技術(shù)利用GST對谷胱甘肽偶聯(lián)的瓊脂糖球珠的親和性，從混合蛋白質(zhì)樣品中純化得到相互作用蛋白〔圖6-27〕。GST沉降試驗通常有兩種應(yīng)用：確定探針蛋白與未知蛋白間的相互作用，確證探針蛋白與某個蛋白之間的相互作用。與此相類似，實驗中把GAD與PIF3的不同區(qū)段相連接成為釣餌，研究該重組蛋白在體外與光敏素B(phyB)、其缺失N-37位氨基酸的突變體或光敏素A(phyA)的相互作用情況。研究發(fā)現(xiàn)，光敏素B(phyB)能與PIF3發(fā)生強烈的相互作用〔超過30％的光敏素B能被PIF3沉淀下來〕，但缺失N-37位氨基酸的phyB突變體以及光敏素A(phyA)只能與PIF3發(fā)生較弱的相互作用，約5％的光敏素A，或約10％的N-37位氨基酸缺失突變光敏素B能被沉淀下來〔圖6-28〕。4、細胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用研究—熒光共振能量轉(zhuǎn)移法〔FRET〕FRET現(xiàn)象是21世紀(jì)初葉發(fā)現(xiàn)的。FRET熒光能量給體與受體之間通過偶極－偶極耦合作用以非輻射方式轉(zhuǎn)移能量的過程又稱為長距離能量轉(zhuǎn)移，有三個根本條件：〔1〕給體與受體在適宜的距離〔1～10nm〕；〔2〕給體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜有一定的重疊〔這是能量匹配的條件〕；〔3〕給體與受體的偶極具有一定的空間取向〔這是偶極-偶極耦合作用的條件〕。FRET需要有兩個探針，即熒光給體和熒光受體，要求給體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜有局部重疊，而與受體的發(fā)射光譜盡量沒有重疊。常用的探針有三種：熒光蛋白，傳統(tǒng)有機染料和鑭系染料。熒光蛋白是一類能發(fā)射熒光的天然蛋白或突變體，常見的有綠色熒光蛋白〔GFP〕、藍色熒光蛋白〔BFP〕、青色熒光蛋白〔CFP〕和黃色熒光蛋白〔YFP〕等。不同蛋白的吸收和發(fā)射波長不同，可根據(jù)需要組成不同的探針對。傳統(tǒng)有機染料是指一些具有特征吸收和發(fā)射光譜的有機化合物組成的染料對。常見的有熒光素、羅丹明類化合物和青色染料Cy3、Cy5等，該類染料分子體積較小，種類較多且大局部為商品化的分子探針染料，因此被廣泛應(yīng)用。鑭系染料一般與有機染料聯(lián)合使用，分別作為FRET的給體或受體，檢測的準(zhǔn)確性和信噪比擬之傳統(tǒng)染料有提高。研究蛋白質(zhì)間相互作用時，F(xiàn)RET一般與熒光成像技術(shù)聯(lián)用，將蛋白標(biāo)記上熒光探針，當(dāng)?shù)鞍组g不發(fā)生相互作用時，其相對距離較大，無FRET現(xiàn)象，而蛋白發(fā)生相互作用時，其相對距離縮小，有FRET現(xiàn)象發(fā)生〔圖6-29〕，可根據(jù)成像照片的色彩變化直觀地記錄該過程。6.3.4染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)〔ChromatinImmunoPrecipitation，ChIP〕是一項新開展的研究活體細胞內(nèi)染色質(zhì)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)，其主要實驗流程是：在活細胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)－DNA復(fù)合物，并通過超聲或酶處理將其隨機切斷為一定長度的染色質(zhì)小片段，然后通過抗原抗體的特異性識別反響,沉淀該復(fù)合體，從而富集與目的蛋白相結(jié)合的DNA片段，通過對目的片段的純化及PCR檢測〔圖6-30〕，獲得該蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息，包括具體的DNA序列特征，位置，結(jié)合時間、親和程度以及對基因表達的影響等〔圖6-31〕。ChIP技術(shù)不僅可以用來檢測體內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子與DNA的動態(tài)作用，還可以研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達的關(guān)系，定性或定量檢測體內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子與DNA的動態(tài)作用。如果能將你所研究的目的蛋白定位到染色質(zhì)DNA上某個或某些功能基因的啟動子區(qū)或附近，對于確定你所感興趣的蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能可能會是一次質(zhì)的飛躍。6.3.5RNAi〔RNAinterference,RNA干預(yù)〕技術(shù)及其應(yīng)用RNAi技術(shù)利用雙鏈小RNA高效、特異性降解細胞內(nèi)同源mRNA從而阻斷靶基因表達，使細胞出現(xiàn)靶基因缺失的表型。研究發(fā)現(xiàn)，對線蟲注射外源雙鏈RNA〔double-strandedRNA〕可誘發(fā)與該RNA高度同源的基因序列的特異性“沉默〞?，F(xiàn)在已經(jīng)知道，RNAi是一個多步驟反響過程，包括對觸發(fā)物的加工、與目標(biāo)mRNA的結(jié)合以及目標(biāo)mRNA的降解。至今已在果蠅、錐蟲、渦蟲、線蟲等許多動物及大局部植物中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了RNAi效應(yīng)。雙鏈RNA是RNAi的觸發(fā)物，引發(fā)與之互補的單鏈RNA〔ssRNA,single-strandedRNA〕的降解。經(jīng)過Dicer〔一種具有RNAaseIII活性的核酸酶〕的加工，細胞中較長的外源雙鏈RNA〔30個核苷酸以上〕首先被降解形成21～25個核苷酸的小分子干擾核糖核酸〔siRNA，shortinterferingRNA〕，并有效地定位目標(biāo)mRNA。因此，siRNA是導(dǎo)致基因沉默和序列特異性RNA降解的重要中間媒介。較短的雙鏈RNA不能被有效地加工為siRNA，因而不能介導(dǎo)RNAi。siRNA具有特殊的結(jié)構(gòu)特征，即5’端磷酸基團和3’端的羥基，其兩條鏈的3’端各有兩個堿基突出于末端。由siRNA中的反義鏈指導(dǎo)合成一種被稱為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體〔RISC〕的核蛋白體，再由RISC介導(dǎo)切割目的mRNA分子中與siRNA反義鏈互補的區(qū)域，從而實現(xiàn)干擾靶基因表達的功能〔圖6-32〕。siRNA還可作為特殊引物，在依賴于RNA的RNA聚合酶的作用下，以目的mRNA為模板合成dsRNA，后者又可被降解為新的siRNA，重新進入上述循環(huán)。因此，即使外源siRNA的注入量較低，該信號也可能迅速被放大，導(dǎo)致全面的基因沉默。在哺乳動物細胞內(nèi)，較長的dsRNA會導(dǎo)致非特異性基因沉默，只有大約21-25個核苷酸的siRNA才能有效地引發(fā)特異性基因沉默。非哺乳動物細胞可以利用較長的雙鏈RNA直接誘導(dǎo)產(chǎn)生RNAi而無須合成siRNA，因此，設(shè)計非哺乳動物細胞RNAi實驗的步驟比擬簡便，只要通過目的基因體外轉(zhuǎn)錄得到所需要的dsRNA，再通過浸泡、注射或轉(zhuǎn)染靶細胞即可實現(xiàn)RNAi。6.4基因芯片及數(shù)據(jù)分析應(yīng)用傳統(tǒng)的實驗方法如RT-PCR或Northern印跡雜交法研究基因的表達調(diào)控規(guī)律，受電泳泳道數(shù)量的限制，每次一般只能研究很少量的靶基因。隨著功能基因組學(xué)研究的不斷深入，迫切需要能同時監(jiān)測大量靶基因表達的實驗手段，以期迅速準(zhǔn)確地在基因組水平上闡述不同生物組織或細胞中各種轉(zhuǎn)錄本的變化規(guī)律?；蛐酒睤NAchip〕，又稱DNA微陣列〔DNAmicroarray〕技術(shù)就是在這種情況下應(yīng)運而生的。6.4.1基因芯片技術(shù)原理基因芯片是一種小型分析裝置，能夠快速和精確地研究生物體、組織、器官或細胞內(nèi)基因組的遺傳信息。制作基因芯片時，可用機械臂將大量或未知序列的DNA片段點在玻璃片〔通常為2×2厘米2〕、金屬片或尼龍膜上，再經(jīng)過物理吸附作用使之固定化。也可以直接在玻璃板或金屬外表進行化學(xué)合成，從而得到寡聚核苷酸芯片。將芯片與待研究的cDNA或其它樣品雜交，經(jīng)過計算機掃描和數(shù)據(jù)處理，便可以觀察到成千上萬個基因在不同組織或同一組織不同發(fā)育時期或不同生理條件下的表達情況〔圖6-33〕。熒光標(biāo)記的cDNA與芯片上相匹配的DNA序列發(fā)生雜交反響，使得芯片上的點呈現(xiàn)出熒光信號，熒光信號的強度和基因表達的豐度成正相關(guān)。基因芯片這種微型化裝置具有巨大的容量，使科學(xué)家能在一個實驗中分析整個基因組的變化。用基因芯片進行研究一般包括五個步驟：生物學(xué)問題的提出、樣品制備、生化反響、檢測、數(shù)據(jù)模型分析。6.4.2基因芯片的點制過程1、簡易基因芯片制作簡易基因芯片時，使用機械臂把DNA片段點在玻璃片或尼龍膜上，再經(jīng)過物理吸附作用〔85℃〕烘烤或化學(xué)處理使DNA分別固定在載體上。將芯片與待研究的cDNA或其它樣品雜交，經(jīng)過計算機掃描和數(shù)據(jù)處理，便可以觀察到大規(guī)模的基因群在不同組織或同一組織不同發(fā)育時期或不同生理條件下的表達調(diào)控情況〔圖6-34〕。2、大規(guī)?；蛐酒笠?guī)模基因芯片通常涉及基因組規(guī)模與數(shù)量〔一般大于10,000個基因〕，可采用接觸式點樣、非接觸式點樣或者半導(dǎo)體技術(shù)制備樣品。其主要工作流程如下：〔1〕經(jīng)大規(guī)模PCR擴增獲得獨立cDNA片段；〔2〕用機械手將PCR產(chǎn)物點在適宜的介質(zhì)上，變性、固定；〔3〕分別從不同器官、組織或細胞中別離mRNA，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA；〔4〕用不同的熒光染料標(biāo)記不同的cDNA樣本；〔5〕將標(biāo)記后的cDNA與點好的芯片進行雜交；〔6〕激光掃描芯片雜交結(jié)果，計算機處理；〔7〕分析雜交數(shù)據(jù)。6.4.3基因芯片數(shù)據(jù)分析基因芯片數(shù)據(jù)分析包括兩局部，數(shù)據(jù)可靠性分析和生物學(xué)意義分析。數(shù)據(jù)可靠性分析。因為用基因芯片進行雜交分析，每次實驗結(jié)果都會有些變化，因為包括靶DNA濃度、探針濃度、雜交雙方的序列組成、鹽濃度以及溫度等許多因素影響了雜合雙鏈的形成和穩(wěn)定性。因此，需要進行重復(fù)試驗以確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確。主要的方法是通過兩次平行雜交反響，將每個基因在兩個反響中的表達水平做成對應(yīng)散點圖，只要絕大多數(shù)基因的雜交結(jié)果都在45度斜線附近，就說明實驗結(jié)果是可靠的〔圖6-35〕。為了保證基因芯片數(shù)據(jù)的可靠性，芯片中還需要加上多個持家基因〔housekeepinggenes〕作為內(nèi)對照。持家基因，如呼吸作用的酶類和細胞骨架蛋白基因等，是維持細胞正常生長發(fā)育的必須基因，其表達水平在細胞內(nèi)根本不變。數(shù)據(jù)處理時，認(rèn)為持家基因的反響信號在兩種組織中不變，依此確定其它基因表達信號的相對變化。生物學(xué)意義分析。主要指通過分析芯片雜交數(shù)據(jù)，研究差異表達基因的生物學(xué)意義。通常，在芯片中某一器官或發(fā)育時期可能有成百上千個差異表達基因。例如，基因芯片分析植物根部可能有400多個特異表達的基因，如果要將這些基因的來龍去脈都搞清楚，可能要追溯超過4000篇以上的文獻〔假設(shè)1個基因需要查閱10篇文獻〕。這種不撿重點的方法耗時耗力，所獲得的結(jié)果也往往不一定有意義。因此，首先將差異表達基因定位于不同的生化代謝途徑，統(tǒng)計每條生化代謝途徑中固有的基因數(shù)量和被基因芯片定位的差異表達的基因數(shù)量，可以計算出特定器官或特定發(fā)育階段表達有顯著差異的代謝途徑。圖6-36是11,832個棉花cDNA的玻璃芯片雜交圖譜的差異表達基因聚類分析，發(fā)現(xiàn)有超過700個基因在棉花纖維伸長期特異性高表達。將這些基因定位到不同代謝途徑中并經(jīng)過統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，乙烯合成、細胞骨架和脂肪酸合成及延伸是三個在纖維細胞中特異性表達的代謝途徑〔表6-4〕。在后續(xù)生物學(xué)研究中，以這些最具代表性的代謝途徑為突破口，闡述了這些途徑在纖維細胞發(fā)育中的重要性。表6-4用途徑分析法研究基因芯片數(shù)據(jù)中可能具有生物學(xué)意義的代謝途徑生物體代謝途徑芯片中被定位的基因數(shù)定位的差異表達基因數(shù)P值Q值總數(shù)2914162乙烯合成53細胞骨架7510脂肪酸合成及延伸649糖胺降解164抗壞血酸代謝638油菜素內(nèi)脂合成626.5利用酵母鑒定靶基因功能釀酒酵母作為單細胞真核生物，具有和動植物細胞相似的結(jié)構(gòu)特征，包括細胞核，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，高爾基體，線粒體，過氧化物酶體，細胞骨架等，而且其細胞生長發(fā)育過程和動植物細胞也有很高的相似性，很多基因在酵母和動植物細胞中是高度保守的。而且，酵母細胞很容易進行生物化學(xué)和分子生物學(xué)操作，因此，酵母是基因功能研究中常用的模式生物。6.5.1酵母的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)簡介釀酒酵母〔Saccharomycescerevisiae〕有穩(wěn)定的單倍體和二倍體細胞，是最早完成基因組DNA全序列測定的真核生物。鑒于其快速生長能力、無性繁殖能力以及簡便的平板影印能力，它是生命科學(xué)領(lǐng)域里廣泛應(yīng)用的模式生物之一。理論上，與任何一種遺傳學(xué)特征相對應(yīng)的不同物種的結(jié)構(gòu)基因都可以通過質(zhì)粒文庫的互補作用而在酵母缺失突變體中得到鑒定。導(dǎo)入酵母細胞中的DNA既能以自主復(fù)制的形式存在，也可能以被整合到基因組的方式存在。酵母中轉(zhuǎn)化DNA的整合重組主要通過同源重組方式進行，整合效率較高。酵母細胞的直徑大約有5μM,在光學(xué)顯微鏡下可以觀察它的許多重要特征。釀酒酵母細胞是以出芽方式生長的。出芽的細胞被稱為母細胞，產(chǎn)生的芽就成為子細胞〔圖6-37〕。新生的芽從酵母細胞分裂周期一開始就出現(xiàn)，直到細胞周期結(jié)束才從母細胞上別離下來。由于酵母細胞的全部生長都集中在芽上，而且這種生長貫穿整個細胞周期，所以通過觀察芽的大小就可以粗略估計哪個細胞處于某種生長發(fā)育階段。當(dāng)培養(yǎng)基中營養(yǎng)元素耗盡時，酵母細胞會停止生長而滯留在特定生長發(fā)育階段，因此，可以通過觀察顯微鏡下酵母細胞的出芽頻率確定酵母的營養(yǎng)狀態(tài)。酵母單倍體和二倍體細胞在形態(tài)上有相似性，但也存在重要的差異。首先，二倍體細胞的直徑大約是單倍體的1.3倍。其次，二倍體細胞呈長形或卵圓形而單倍體細胞通常接近圓形。第三，二倍體細胞和單倍體細胞的出芽方式不同。每個酵母細胞衰老前一般出芽20次，在母細胞外表以一定的方式連續(xù)出芽。單倍體細胞按照沿軸線的方向出芽，新芽與前一個芽緊密相連。二倍體細胞按極性方向出芽，新芽可以出現(xiàn)在長形細胞的任何一端。酵母細胞有三種交配型MATa，MATα以及由這兩種細胞相互交配形成的第三種交配型MATa/α。MATa/α不能與MATa和MATα中任何一種細胞交配。一般而言，MATa和MATα為單倍體，MATa/α為二倍體，但有例外。帶有不同突變的單倍體細胞之間發(fā)生交配可以將不同的突變基因組合在同一個細胞中，為研究基因之間的相互關(guān)系提供了良好的實驗材料。野生型酵母屬于原養(yǎng)型，只要培養(yǎng)基中有足夠可利用的碳源和氮源，酵母細胞就能合成自身需要的各種營養(yǎng)物質(zhì)。酵母首選碳源是葡萄糖，但也能利用其它很多種糖類。如果碳源適宜，酵母細胞首選通過酒精發(fā)酵產(chǎn)生能量。酵母細胞是條件性厭氧菌，在有氧和無氧狀態(tài)下都能生存。二倍體酵母細胞在低氮、無發(fā)酵性碳源的條件下〔營養(yǎng)缺乏，“饑餓〞條件〕能通過減數(shù)分裂形成單倍體孢子。此時，每個單倍體細胞在遺傳背景上完全相同，從單個孢子來源的所有細胞都帶有一套相同的染色體DNA。這些單倍體細胞中的某些重要基因發(fā)生突變后，因為不存在等位基因，很容易導(dǎo)致酵母細胞生長發(fā)育異常而發(fā)生表型變化。圖6-38以酵母亮氨酸合成基因為例介紹了二倍體細胞通過減數(shù)分裂形成單倍體細胞的過程。6.5.2酵母基因轉(zhuǎn)化與性狀互補利用Yip〔整合型質(zhì)?！晨梢詫湍富蚪M中的任意基因進行精確的敲除〔置換〕，并通過孢子繁殖中的四分體分析技術(shù)進行觀測和研究。帶有致死突變位點和可能的外源功能互補基因的酵母二倍體細胞在饑餓條件下形成四分體孢子，將這四個孢子用酵母四分體別離系統(tǒng)分開，如果所引入的外源基因具備互補突變位點的功能，含有突變基因的單倍體可以存活，否那么就不能存活。圖6-39中將多個棉花KCS基因〔編碼超長鏈脂肪酸合成酶〕克隆到含有URA3篩選標(biāo)記的表達質(zhì)粒上，用帶有URA3篩選標(biāo)記的表達質(zhì)粒替換帶有TRP1篩選標(biāo)記的質(zhì)粒，實驗發(fā)現(xiàn)，KCS12和KCS6基因都能完全互補野生型的表型，KCS13和KCS2雖然沒有導(dǎo)致野生型的表型，但仍能使酵母細胞恢復(fù)生長，說明這些KCS基因都具備與elo2或elo3相似功能。6.5.3外源基因在酵母中的功能鑒定將外源基因克隆于酵母表達載體上，轉(zhuǎn)化野生型或突變酵母菌株，通過觀察酵母的表型變化或分析細胞中化學(xué)成分的變化即可推測該基因的生物學(xué)功能。例如，在酵母細胞中表達外源基因與綠色熒光蛋白基因的融合蛋白后，可通過熒光顯微鏡觀察熒光所在的亞細胞區(qū)域，從而了解該基因產(chǎn)物在細胞中的定位。野生型酵母細胞中18碳不飽和脂肪酸主要是C18:1，這些細胞不能產(chǎn)生含有兩個或多個雙鍵的不飽和脂肪酸，假設(shè)將棉花中可能編碼ω-6脂肪酸脫氫酶的基因轉(zhuǎn)入野生型酵母細胞中，誘導(dǎo)該基因的表達，然后用氣相色譜和質(zhì)譜技術(shù)分析細胞的脂肪酸組成，在帶有棉花基因的酵母細胞中可能出現(xiàn)C18：2不飽和脂肪酸，證明該基因編碼了有功能的ω-6脂肪酸脫氫酶〔圖6-40〕。因為酵母細胞中有與動植物細胞比擬接近的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄后修飾系統(tǒng)，許多在大腸桿菌中不產(chǎn)生功能蛋白質(zhì)的動植物基因在酵母中表達后往往具有生物學(xué)功能。6.6其它分子生物學(xué)技術(shù)6.6.1凝膠滯緩實驗?zāi)z滯緩試驗〔ElectrophoreticMobilityShiftAssay，EMSA〕，是體外分析DNA與蛋白質(zhì)相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)。其根本原理是，蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合后將大大增加分子質(zhì)量，而凝膠電泳中DNA朝正電極移動的距離與其相對分子質(zhì)量的對數(shù)成正比，因此，沒有結(jié)合蛋白的DNA片段跑得快，而與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物的DNA由于受到阻滯而跑得慢。歷史上，該技術(shù)首次為大腸桿菌乳糖阻遏物與其DNA結(jié)合位點的相互作用提供了動態(tài)數(shù)據(jù)。實驗中，當(dāng)特定的DNA片段與細胞提取物混合后，假設(shè)該復(fù)合物在凝膠電泳中的遷移速率變小，就說明該DNA可能與提取物中某個蛋白質(zhì)分子發(fā)生了相互作用。這一方法簡單、快捷，是別離純化特定DNA結(jié)合蛋白質(zhì)的經(jīng)典實驗方法。在EMSA試驗中，用放射性同位素標(biāo)記待檢測的DNA片段〔即探針DNA〕，然后與細胞提取物共溫育，形成DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，將該復(fù)合物加到非變性聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳。通常用32P標(biāo)記DNA分子，而不標(biāo)記蛋白質(zhì)。電泳結(jié)束后，用放射自顯影技術(shù)顯現(xiàn)具放射性標(biāo)記的DNA條帶位置。如果細胞蛋白提取物中不存與同放射性標(biāo)記的DNA探針相結(jié)合的蛋白質(zhì)，那么所有放射性標(biāo)記都將出現(xiàn)在凝膠的底部；反之，將會形成DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，由于受到凝膠阻滯的緣故，放射性標(biāo)記的DNA條帶就會出現(xiàn)在凝膠的不同部位〔圖6-41A〕。此外，EMSA還被用于研究與蛋白質(zhì)相結(jié)合的DNA序列的特異性。在DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物中參加超量的非標(biāo)記競爭DNA分子，如果它與標(biāo)記的探針DNA結(jié)合同一種蛋白質(zhì)，由于競爭DNA〔非標(biāo)記〕遠遠多于探針DNA〔標(biāo)記〕，絕大局部蛋白質(zhì)會與競爭DNA結(jié)合，探針DNA那么可能處于自由狀態(tài)，凝膠電泳的放射自顯影圖上的阻滯條帶就會顯著變?nèi)?。相反，如果競爭DNA不能與探針DNA所結(jié)合的蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，那么，探針DNA將仍舊與其結(jié)合蛋白形成復(fù)合物，阻滯條帶強度不發(fā)生變化。另外，通過設(shè)計一系列引入一個或數(shù)個突變堿基的放射性標(biāo)記探針，我們可以運用EMSA來評估這些突變對探針DNA與結(jié)合蛋白相互作用的影響，進而確定該探針DNA分子中與蛋白質(zhì)直接發(fā)生相互作用的關(guān)鍵性堿基〔圖6-41B〕。6.6.2噬菌體展示技術(shù)噬菌體是細菌病毒的總稱，英文為Bacteriophage，來源于希臘文“phagos〞，有“吞噬〞之意。噬菌體可在脫離宿主細胞的狀態(tài)下保持自己的生命，但一旦脫離了宿主細胞，它們就既不能生長也不能復(fù)制，因為大多數(shù)的噬菌體只能利用宿主核糖體、合成蛋白質(zhì)的因子、各種氨基酸及能量代謝體系進行生長和增殖。噬菌體可被分為溶菌周期和溶源周期兩種不同的類型。在溶菌周期，噬菌體將其感染的宿主細胞轉(zhuǎn)變成為噬菌體的“制造廠〞，產(chǎn)生出大量的子代噬菌體顆粒。實驗室常將只具有溶菌生長周期的噬菌體叫作烈性噬菌體。而溶源生長周期是指噬菌體DNA被整合到宿主細胞染色體DNA上，成為它的一個組成局部，感染過程中不產(chǎn)生子代噬菌體顆粒。具有溶源周期的噬菌體被稱為溫和噬菌體。噬菌體展示技術(shù)是將基因表達產(chǎn)物與親和選擇相結(jié)合的技術(shù)，其根本原理是將編碼“誘餌〞蛋白〔你研究中所發(fā)現(xiàn)的任何感興趣的蛋白質(zhì)〕的DNA片段插入噬菌體基因組，并使之與噬菌體外殼蛋白編碼基因相融合。該重組噬菌體侵染宿主細菌后，復(fù)制形成大量帶有雜合外殼蛋白的噬菌體顆粒，直接用于捕獲靶蛋白庫中與“誘餌〞相互作用的蛋白質(zhì)〔圖6-42〕。噬菌體次要結(jié)構(gòu)蛋白pIII和主要結(jié)構(gòu)蛋白〔外殼蛋白〕pVIII均可作為載體來展示外源多肽。pIII基因融合時表達強度低(每個噬菌體上有不超過5個拷貝)，與pVIII基因融合時，表達強度高(每個噬菌體外殼上可能有2,700-3,000個拷貝)。在pIII和pVIII基因的信號肽與成熟蛋白質(zhì)編碼區(qū)之間都有單一的克隆位點便于外源基因插入，表達的融合蛋白被分泌到細胞間質(zhì)并由宿主蛋白酶切除信號肽，融合蛋白被作為結(jié)構(gòu)外殼蛋白呈現(xiàn)到病毒粒子的外表。直接法親和篩選是將靶蛋白質(zhì)分子耦聯(lián)到固相支持物上，文庫噬菌體與固相支持物溫育后洗去未結(jié)合的噬菌體，即獲得與所篩選蛋白有親和性的噬菌體。間接法親和篩選是將生物素標(biāo)記的蛋白質(zhì)分子與文庫噬菌體溫育后鋪在含有鏈親和素〔能與生物素相結(jié)合〕的平皿上，洗去未結(jié)合的噬菌體，保存在平皿上的就是結(jié)合狀態(tài)的噬菌體。洗脫結(jié)合狀態(tài)噬菌體后感染細菌，擴增噬菌體，開始新一輪的篩選，連續(xù)幾次親和純化反響后就能選擇性富集并擴增結(jié)合靶蛋白的噬菌體。6.6.3蛋白質(zhì)磷酸化分析技術(shù)細胞的生長發(fā)育、周期調(diào)控、基因表達、蛋白合成以及神經(jīng)功能、肌肉收縮等都離不開蛋白質(zhì)特異性磷酸化，因此，由蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶所催化的蛋白質(zhì)可逆磷酸化過程，是生物體內(nèi)一種普遍且重要的調(diào)節(jié)方式，控制著眾多的生理生化反響和生物學(xué)過程。許多復(fù)雜的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)還涉及到由多個蛋白激酶所催化的磷酸化級聯(lián)反響。通常蛋白激酶催化ATP或GTP的γ磷酸基團轉(zhuǎn)移到底物蛋白的絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基上，促使底物蛋白發(fā)生磷酸化，而蛋白質(zhì)磷酸酯酶那么能催化底物蛋白發(fā)生去磷酸化〔圖6-43〕。此外，底物蛋白的組氨酸、賴氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和半胱氨酸殘基上也能發(fā)生可逆磷酸化。實驗室研究蛋白質(zhì)磷酸化主要包括底物蛋白磷酸化和蛋白激酶活性檢測，一般采用雙向電泳及質(zhì)譜分析等檢測底物蛋白磷酸化。由于細胞內(nèi)可能有多達上千個蛋白激酶，體內(nèi)檢測某個蛋白激酶活性非常困難，科學(xué)家常用體外激酶活性分析法來檢測蛋白激酶活性。該方法能十分可靠地鑒定某個蛋白激酶對底物的磷酸化作用，篩查激酶的特異性底物。蛋白激酶體外磷酸化活性分析如圖6-44所示，主要分為獲取底物蛋白或待檢測蛋白激酶和進行蛋白質(zhì)體外磷酸化反響兩步?？梢灾苯訌慕M織中提取目的蛋白〔包括底物蛋白及待檢測蛋白激酶〕，也可由原核或真核表達載體誘導(dǎo)表達目的蛋白。如圖6-45所示，將體外表達的棉花鈣離子依賴性蛋白激酶CDPK1與乙烯合成酶基因ACS2置于蛋白質(zhì)體外磷酸化實驗體系中，研究發(fā)現(xiàn)，有鈣離子存在時，ACS2能被有效地磷酸化，ACO1及SUS蛋白那么不能被磷酸化。6.6.4蛋白質(zhì)免疫印跡實驗1．蛋白質(zhì)免疫印跡實驗〔Westernblotting〕。是分子生物學(xué)中最常用的蛋白質(zhì)研究技術(shù)，是二十世紀(jì)70年代末80年代初在蛋白質(zhì)凝膠電泳和固相免疫測定根底上開展起來的一種技術(shù)，為檢測樣品中是否存在蛋白抗原提供了一種可靠的方法。免疫印跡法的根本原理是被測蛋白只能與標(biāo)記的特異性抗體相結(jié)合，而這種結(jié)合不改變該蛋白在凝膠電泳中的相對分子質(zhì)量。免疫印跡法具有高效、簡便、靈敏等特點，能被用于測定抗原的相對豐度或與其它抗原的關(guān)系，也是評價新抗體特異性的一種有用方法。免疫印跡程序可分為五個步驟：1、蛋白樣品的制備；2、SDS電泳別離樣品;3、將已別離的蛋白轉(zhuǎn)移到尼龍或其它膜上，轉(zhuǎn)移后首先將膜上未反響的位點封閉起來以抑制抗體的非特異性吸附；4、用固定在膜上的蛋白質(zhì)作為抗原，與對應(yīng)的非標(biāo)記抗體〔一抗〕結(jié)合；5、洗去未結(jié)合的一抗，參加酶偶聯(lián)或放射性同位素標(biāo)記的二抗，通過顯色或放射自顯影法檢測凝膠中的蛋白成分〔圖5-46〕。2．抗體制備。免疫學(xué)研究中，利用抗原分子刺激機體，使其產(chǎn)生免疫學(xué)反響，由機體的漿細胞合成并分泌的能與抗原分子特異性結(jié)合的一組免疫球蛋白被定義為抗體。由于抗原分子通常是由多個抗原決定簇組成的，由單一抗原決定簇刺激機體，由一個B淋巴細胞克隆接受該抗原所產(chǎn)生的抗體就被稱為單克隆抗體〔monoclonalantibody〕，而由多種抗原決定簇產(chǎn)生的一組含有針對各個抗原決定簇的混合抗體，就被稱為多克隆抗體〔polyclonalantibody〕。制備技術(shù)主要分為：1、抗原準(zhǔn)備。對于某個特定的蛋白質(zhì)，常有多種抗原形式，包括形成特異性藕聯(lián)多肽、重組表達該蛋白全長或局部以及重組表達的融合蛋白等。2、動物選擇。實踐中供免疫用的動物主要是哺乳動物，常選擇家兔、綿羊、山羊、小鼠等。動物選擇常依據(jù)抗體的用途和需用量決定，如需大量制備抗體，多采用體型較大的動物。如期望獲得直接用于標(biāo)記診斷的抗體，那么應(yīng)采用與診斷目標(biāo)相同的動物，而如需獲取間接的標(biāo)記診斷用抗體，那么必須采用異源動物。3、動物免疫。針對不同的動物及要求抗體的特性等不同，需采用不同的免疫劑量、免疫周期來對動物進行免疫。以小鼠為例，首次的免疫劑量為50-400μg/次，免疫周期間隔為5-7天，在一定的范圍內(nèi)，抗體的效價