高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法測(cè)定人血漿及尿液中記憶喪失性貝毒軟骨藻酸

高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法測(cè)定人血漿及尿液中記憶喪失性貝毒軟骨藻酸

骨藻酸（da）是海洋中的一種生物毒素。它可以通過(guò)沉積物在貝類中積聚，并通過(guò)食物鏈對(duì)人類、海鳥(niǎo)和海洋哺乳動(dòng)物產(chǎn)生毒性作用?，F(xiàn)已建立的軟骨藻酸檢測(cè)分析方法有小鼠生物分析法、高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、酶聯(lián)免疫分析法、膠體金免疫層析法、氣相色譜法、受體分析法、薄層色譜法和生物傳感器法等?；诟咝б合嗌V-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)軟骨藻酸的方法也得到不斷地改進(jìn),目前主要用于海水、水產(chǎn)品和浮游生物中軟骨藻酸含量的檢測(cè)。準(zhǔn)確測(cè)定人血漿和尿液中微量軟骨藻酸含量,是開(kāi)展軟骨藻酸中毒患者病因診斷及其代謝動(dòng)力學(xué)研究的前提條件。本研究建立了快速測(cè)定人體血漿和尿液中軟骨藻酸的高效液相-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)檢測(cè)方法。該方法操作簡(jiǎn)便,靈敏度高,重復(fù)性好,能夠滿足相關(guān)檢測(cè)的需要。1實(shí)驗(yàn)部分1.1標(biāo)準(zhǔn)工作液和色譜HPLC-1200高效液相色譜儀(美國(guó),安捷倫公司);ABI4000QTRAP質(zhì)譜儀(美國(guó),ABSciex公司);CPA2P百萬(wàn)分之一天平(德國(guó),Sartorius公司);Mili-Q超純水機(jī)(德國(guó),Millipore公司);H-1650高速離心機(jī)(湖南湘儀)。軟骨藻酸標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司)溶液:精密稱取1.15mg軟骨藻酸標(biāo)準(zhǔn)品于10mL容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得質(zhì)量濃度為115mg/L的儲(chǔ)備液,標(biāo)準(zhǔn)工作液由甲醇稀釋而成。甲醇(色譜純,Merck公司);甲酸(色譜純,Tedia公司)。人體血漿由廈門(mén)市中心血站提供,尿液由健康自愿者提供。1.2樣品處理1.2.1軟骨藻酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備精密移取100μL人體血漿于1.5mL離心管中,加入20μL軟骨藻酸標(biāo)準(zhǔn)工作液,渦旋混勻,加入600μL的甲醇溶液,充分振蕩3min,12000r/min離心10min,取上清液,用0.22μm的濾膜過(guò)濾后,進(jìn)樣分析。1.2.2軟骨藻酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備精密移取100μL人體尿液于1.5mL離心管中,加入20μL軟骨藻酸標(biāo)準(zhǔn)工作液,渦旋混勻,加入600μL的甲醇溶液,充分振蕩3min,12000r/min離心10min,取上清液,用0.22μm的濾膜過(guò)濾后,進(jìn)樣分析。1.3苯甲酸溶液進(jìn)樣量色譜條件:ZorbaxSBC18色譜柱(150×4.6mm,5μm),柱溫30℃;流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸水溶液(13∶87,V/V),流速:1.0mL/min,進(jìn)樣量:5μL。質(zhì)譜條件:采用ESI源,正離子模式掃描,噴霧電壓IS為5500V,霧化溫度為500℃、霧化氣為60L/h,氣簾氣CUR為20L/h,離子去簇電壓(DP)為65V,聚焦電壓(EP)為10V,碰撞活化電壓(CE)為8V。2結(jié)果與討論2.1乙酸乙酯的沉淀本實(shí)驗(yàn)分別考察了甲醇、乙腈和乙酸乙酯三種沉淀劑。結(jié)果發(fā)現(xiàn),采用乙酸乙酯時(shí),較易揮發(fā),重復(fù)性較差,且回收率較低,可能是因?yàn)橐宜嵋阴サ臉O性較小,對(duì)軟骨藻酸的溶解性較差;用乙腈沉淀提取,血漿樣品沉淀成團(tuán)狀,造成提取不完全,重復(fù)性較差;而用甲醇沉淀時(shí),其沉淀呈均勻絮狀,重復(fù)性較好。同時(shí),分別考察了4、6、8、10倍量沉淀劑對(duì)軟骨藻酸響應(yīng)值的影響,結(jié)果表明隨著沉淀劑量的增加,軟骨藻酸信號(hào)峰逐漸下降,從峰信號(hào)強(qiáng)弱以及沉淀是否完全考慮,選用6倍體積甲醇作為沉淀劑。2.2流動(dòng)相比例和流速參考文獻(xiàn)中采用的色譜條件,當(dāng)將流動(dòng)相中水相改為0.1%甲酸水溶液時(shí),色譜峰形較好。同時(shí),選用了乙腈-0.1%甲酸水溶液體積比為30∶70、20∶80、13:87和10∶90,考察流動(dòng)相比例對(duì)樣品峰的影響。實(shí)驗(yàn)表明,當(dāng)采用體積比13∶87的乙腈-0.1%甲酸水溶液時(shí),其信噪比達(dá)到最大。以此比例,分別考察流速為0.6、0.8和1.0mL/min對(duì)樣品出峰的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)流速為0.6mL/min時(shí),出峰時(shí)間較長(zhǎng)、峰較寬;當(dāng)流速為0.8mL/mim時(shí),峰形拖尾。因此流速選擇1.0mL/min。此外,還考察了進(jìn)樣量對(duì)樣品色譜峰信號(hào)的影響,結(jié)果表明,當(dāng)進(jìn)樣量大于5μL時(shí),色譜峰面積不再隨進(jìn)樣量增加而明顯增加。2.3分離檢測(cè)離子的確定軟骨藻酸母離子[M+1]+為m/z312.2,2個(gè)信號(hào)較強(qiáng)的碎片離子為m/z161.3、266.2,處理后樣品進(jìn)行分離檢測(cè)時(shí),m/z266.2碎片離子豐度較高,因此,選擇離子對(duì)m/z312.2/266.2作為定量峰。在上述色譜條件下,血漿和尿液樣品色譜分離良好,內(nèi)源性物質(zhì)不干擾軟骨藻酸的測(cè)定,見(jiàn)圖1、2。2.4血液和尿液樣本中軟骨藻類酸的測(cè)定2.4.1線性范圍考察取0.1mL空白血漿或空白尿液,加入軟骨藻酸對(duì)照品溶液,配制1.8、3.6、7.2、14.4、28.8、57.6和115μg/L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液按1.2節(jié)方法沉淀提取,并進(jìn)行質(zhì)譜分析,記錄軟骨藻酸色譜峰面積,以峰面積(Y)對(duì)質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行線性回歸,血漿樣品中標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:Y=65.7X-386(r=0.999),線性范圍1.8~115μg/L;尿液樣品中標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=124X-134(r=0.999),線性范圍為1.8~115μg/L。2.4.2標(biāo)準(zhǔn)回收率實(shí)驗(yàn)2.4.3血漿和歷史樣品處理取100μL空白血漿或空白尿液,精密加入系列對(duì)照品溶液20μL,分別配制成質(zhì)量濃度為18、72、288μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品和尿液樣品各5份,按照1.2節(jié)方法處理并進(jìn)行分析;同法分別用水代替血漿和空白尿液,按照上述方法處理。以每一種濃度的兩種不同處理方法分析得到的峰面積比值計(jì)算基質(zhì)效應(yīng),見(jiàn)表2。由表內(nèi)數(shù)據(jù)可知,血漿、尿液均對(duì)軟骨藻酸基質(zhì)效應(yīng)不顯著。2.4.4精密度和rsd分別取含有軟骨藻酸的低、中、高3種不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品與標(biāo)準(zhǔn)尿液樣品,分別測(cè)定5次,計(jì)算精密度。血漿與尿液中測(cè)定的RSD均小于10%(n=5)。可見(jiàn)分析方法的精密度符合藥物動(dòng)力學(xué)研究要求。2.4.5凍融法制備高3種不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)血漿與標(biāo)準(zhǔn)高校樣品考察了軟骨藻酸在不同貯存條件下的穩(wěn)定性。配制含有軟骨藻酸的低、中、高3種不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品與標(biāo)準(zhǔn)尿液樣品,并分別于-80℃凍融3次。結(jié)果表明血漿樣品和尿液樣品凍融3次后測(cè)得的濃度為初始溶度的87.0%~119.3%,凍融對(duì)樣品的穩(wěn)定性沒(méi)有影響,見(jiàn)表3。2.4.6檢出限和測(cè)定下限以信噪比(S/N)為3作為檢出限,以S/N比為5作為定量下限,經(jīng)過(guò)不斷稀釋樣品并分析檢測(cè)可得,血漿樣品中軟骨藻酸的檢出限為0.9μg/L,定量限為1.8μg/L;尿液樣品中軟骨藻酸的檢出限為0.9μg/L,定量限為1.8μg/L。3軟骨藻酸的檢測(cè)方法本研究建立了人體血漿及尿液中記憶喪失性貝毒軟骨藻酸(DA)的LC/MS/MS測(cè)定方法。該方法快速、準(zhǔn)確,