超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測蜂蜜中12種大環(huán)內(nèi)酯和林可酰胺類抗生素殘留

超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測蜂蜜中12種大環(huán)內(nèi)酯和林可酰胺類抗生素殘留

大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是放線菌或小單胞菌產(chǎn)生的一種合成藥物。它對革蘭氏陽性和具體生物的細(xì)菌感染有很強的抑制作用。廣泛用于醫(yī)學(xué)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對細(xì)菌感染的治療和預(yù)防。然而，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的殘留會引起過敏反應(yīng)，并會導(dǎo)致藥物不利的擴散。林可酰胺類抗生素(lincosamides)是具有抗革蘭陽性需氧菌和革蘭陽性或陰性厭氧菌活性的抗生素,通常用于需氧及厭氧混合感染的治療,林可酰胺類抗生素殘留可引起腎功能障礙和革蘭陽性菌的耐藥性增加。大環(huán)內(nèi)酯和林可酰胺類抗生素可用于防治蜜蜂的美洲幼腐病,林可酰胺類和大環(huán)內(nèi)酯類獸藥由于藥效好,廣泛用于蜜蜂疾病的預(yù)防和治療,其在蜂蜜中殘留問題不容忽視。目前各國尚未設(shè)定蜂產(chǎn)品中大環(huán)內(nèi)酯和林可酰胺類抗生素殘留的最大限量要求(MRL),但按日本肯定列表要求每種藥物的殘留限量不得超過10μg/kg,因此建立快速測定蜂蜜中低含量大環(huán)內(nèi)酯和林可酰胺類抗生素殘留的檢測方法非常必要。大環(huán)內(nèi)酯和林可酰胺類抗生素殘留檢測方法主要有高效液相色譜法、液/質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS/MS)。高效液相色譜法測定時通常使用紫外檢測器,靈敏度較低,陽性樣品還需進一步確證;LC-MS/MS作為確證檢測獸藥殘留的理想方法,目前已應(yīng)用于蜂蜜中多種大環(huán)內(nèi)酯和林可酰胺類抗生素殘留的測定,但樣品前處理比較復(fù)雜,一般都采用固相萃取方法,成本高,操作煩瑣。本研究建立的UPLC-MS-MS方法,無需固相萃取等復(fù)雜樣品前處理技術(shù),樣品經(jīng)溶劑溶解后直接進樣分析,可以快速檢測蜂蜜中12種大環(huán)內(nèi)酯和林可酰胺類抗生素殘留,方法簡便、準(zhǔn)確,可以滿足大批量樣品高靈敏的測定,為食品安全提供可靠的確證檢測方法。1材料和方法1.1標(biāo)準(zhǔn)使用液的配制AquityUPLC-QuattroPremierXE超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀,配有電噴霧離子源,Masslynx4.1工作站(美國Waters公司);MS2旋渦混旋器(德國IKA公司);TGL-16C高速臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠);2510超聲波清洗機(美國Branson公司);GradientA10Mill-Q超純水器(法國Millipore公司);20μl~300μl電子移液槍(法國Gilson公司);針頭過濾器(13mmGHP0.2μm,美國Pall公司)。甲醇和乙腈為HPLC級(德國Merck公司);乙酸銨為HPLC級(美國Tedia公司);泰樂菌素(98.0%)、螺旋霉素(96.0%)、替米考星(98.5%)、竹桃霉素(96.5%)等標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)購自德國Dr.Ehrenstorfer公司;紅霉素(92.3%)、克拉霉素(97.5%)、林可霉素(86.2%)、克林霉素(86.5%)、吉他霉素、交沙霉素、阿奇霉素、麥迪霉素和羅紅霉素等化學(xué)對照品購自中國藥品生物制品檢定所;分別用甲醇配制成1.0mg/ml標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液,再混合稀釋成10μg/ml混合標(biāo)準(zhǔn)使用液,保存于-35℃冰箱中。臨用時用甲醇稀釋至所需濃度。1.2羅紅霉素-羅紅霉素的制備對無結(jié)晶的蜂蜜樣品,將其攪拌均勻。對有結(jié)晶的樣品,在密閉情況下,置于不超過60℃的水浴中溫?zé)?振蕩,待樣品全部融化后攪勻,冷卻至室溫。稱取混合均勻的試樣1.00g,置于10ml具塞離心管中,加入500μl2mol/L乙酸銨水溶液、20μl內(nèi)標(biāo)物羅紅霉素(1.0mg/L),加20%甲醇水溶液至5.0ml,旋渦混勻,超聲5min,取上清液1.0ml于safe-lock尖底離心管中,12000rpm離心5min,取中層清液待測。在7支具塞離心管中各稱取1.00g空白樣品,加入500μl2mol/L乙酸銨水溶液、20μl內(nèi)標(biāo)物羅紅霉素(1.0mg/L),分別按加入適量的混合標(biāo)準(zhǔn)液,使12種待測物的濃度分別為:0μg/kg、0.50μg/kg、1.0μg/kg、5.0μg/kg、50.0μg/kg、100μg/kg、200μg/kg,余下操作同樣品的處理方法,供制作基質(zhì)工作曲線用。1.3測量條件1.3.1柱溫mm色譜柱:ACQUITYUPLCHSST3柱(100mm×2.1mm,1.8μm),VanGuardBEHC18保護柱(5mm×2.1mm,1.7μm)(美國Waters公司);柱溫:45℃;樣品室溫度:5℃;進樣體積10μl。流動相A為含0.5%甲酸的5mmol/L乙酸銨水溶液,流動相B為甲醇液,流速為0.200ml/min,采用梯度洗脫,在1.5min內(nèi)流動相B從40%線性梯度至60%,再在2.5min內(nèi)線性梯度至80%并保持2min,在0.1min內(nèi)增加至95%再保持2min,然后流動相B的比例下降至40%,平衡色譜柱2min。1.3.2質(zhì)譜參數(shù)采用電噴霧離子源,通過正離子多反應(yīng)監(jiān)控掃描(MRM)模式,毛細(xì)管電壓:3.2kV;離子源溫度:130℃;錐孔反吹氣流量:50L/hr,脫溶劑溫度:380℃,脫溶劑氣流量:600L/hr,碰撞室氬氣壓力:0.346Pa(3.46×10-3mbar)。其它質(zhì)譜參數(shù)詳見表1。運行開始時,色譜柱流出液經(jīng)六通切換閥切換至廢液中直到1.6min,質(zhì)譜從1.6min開始采集數(shù)據(jù)直到5.5min結(jié)束,同時六通切換閥又將柱流出液切換至廢液中。2結(jié)果與討論2.1質(zhì)譜條件優(yōu)化分子離子檢測利用注射泵以20μl/min流速將每種2.0μg/ml的待測組分標(biāo)準(zhǔn)溶液通過三通管匯合一定比例的流動相注入到離子源中,在正離子模式下,得到每種組分的準(zhǔn)分子離子峰。然后對每種準(zhǔn)分子離子峰進行二級質(zhì)譜分析(子離子掃描),得到碎片離子信息,然后再對錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)進行優(yōu)化,使每種組分的準(zhǔn)分子離子與產(chǎn)生的特征碎片離子對強度達到最大;然后將UPLC和串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀聯(lián)機,選擇每種化合物的監(jiān)測離子對,再對離子源溫度、脫溶劑氣溫度、脫溶劑氣流量等進行優(yōu)化,使樣液中每種待測物的離子化效率達到最佳。遵循國際慣例,確證分析需要4個識別點,選擇兩對分子離子對,再選擇干擾小、信噪比大的離子對作為定量離子對。設(shè)定合適的峰駐留時間(dwelltime)確保色譜峰的采樣點數(shù)在15~20點,從而得到較好的定量重復(fù)性。優(yōu)化后的測定條件見表1。2.2流動相的優(yōu)化ACQUITYUPLCHSST32.1×100mm,1.8μm柱作為分析柱,分別采用不同濃度的乙酸銨水溶液和乙酸銨甲醇液系統(tǒng)作為流動相進行優(yōu)化,試驗發(fā)現(xiàn)在流動相A中加入甲酸時靈敏度和分離效果都更好,流動相B中加入不同濃度乙酸銨溶液,影響不明顯,故最終選用流動相A為含0.5%甲酸的5mmol/L乙酸銨水溶液,流動相B為甲醇液,選擇適當(dāng)?shù)奶荻认疵摮绦蚴?3種待測組分得到較好地分離,一次分析僅需10min。2.3蜂蜜提取的回收率測量大環(huán)內(nèi)酯類和林可酰胺類抗生素均為弱堿性化合物,易溶于酸性水溶液和極性溶劑,在pH6-8的中性溶液中較穩(wěn)定,在酸性(pH<4)和堿性(pH>9)條件下均不穩(wěn)定,特別是紅霉素、替米考星、阿奇霉素和螺旋霉素對酸非常敏感。文獻報道的樣品凈化方法主要有正己烷液液萃取脫脂和固相萃取法,試驗發(fā)現(xiàn)羅紅霉素、替米考星、阿奇霉素和螺旋霉素脂溶性較大,在近中性條件下用正己烷脫脂,損失較大,回收率僅有38%~51%;固相萃取法的柱類型主要有反相的C18和HLB、陽離子交換的MCX和SCX。采用陽離子交換固相萃取法時,樣品的上樣溶液要調(diào)至酸性,洗脫液也為酸性,通常含有5%甲酸,而這些酸性條件都會使某些酸敏感的大環(huán)內(nèi)酯類成分分解;而基于反相機理的固相萃取法與反相液相色譜柱分離的機理相同,反相固相萃取去雜質(zhì)的效果采用反相液相色譜分離結(jié)合在線切換閥流路切換技術(shù)也能達到,增加固相萃取凈化,洗脫液還需氮吹濃縮,反而增加了樣品前處理的步驟,使之冗長、耗時。綜合上述原因,本法不經(jīng)凈化,將蜂蜜樣品用20%甲醇水液溶解稀釋5倍后直接進樣分析,采用在線切換閥切換技術(shù)將色譜柱最初流出的含有糖類、有機酸等強極性成分的組分切換至廢液中,質(zhì)譜只對待測成分流出部分進行檢測,最后又將甲醇強洗脫的弱極性組分切換到廢液中,避免質(zhì)譜儀受到污染。為了盡可能地減少基質(zhì)效應(yīng)的影響,采用以羅紅霉素作為內(nèi)標(biāo)物的基質(zhì)工作曲線內(nèi)標(biāo)法定量。蜂蜜富含有有機酸,pH值多呈酸性,試驗發(fā)現(xiàn)蜂蜜直接用20%甲醇水液溶解后進樣分析,紅霉素、替米考星、阿奇霉素和螺旋霉素的回收率僅有54%~72%,故在溶劑提取之前先加入500μl2mol/L乙酸銨使得蜂蜜的pH值調(diào)節(jié)至近中性,可有效地避免待測物在提取過程中分解,顯著增加紅霉素、替米考星、阿奇霉素和螺旋霉素的回收率,采用20%甲醇水液可較好地溶解蜂蜜樣品,再加以超聲提取能提高待測物的提取率。實驗發(fā)現(xiàn)阿奇霉素、螺旋霉素和替米考星會被0.22μm的濾膜吸附,標(biāo)準(zhǔn)的0.1%乙酸乙腈液通過濾膜后的回收率僅有63%~71%,故提取液經(jīng)高速離心后直接進樣。為了進一步確保待測物的穩(wěn)定,防止其在液相進樣前分解,將樣品室的溫度設(shè)為5℃。2.4定量離子對檢測的影響用陰性樣品加入標(biāo)準(zhǔn)溶液制作6點系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,以羅紅霉素作為內(nèi)標(biāo),在選定的色譜和質(zhì)譜條件下進行測定,進樣量10μl,基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見圖1。采用Masslynx4.1中Targetlynx組件以定量離子對的峰面積與內(nèi)標(biāo)物的比值對基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中被測組分的濃度作圖,12種待測物在0.50μg/L~200μg/L呈線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)均大于0.999,以定性離子對與定量離子對的峰面積比值作為確證依據(jù)。在本法操作條件下,信噪比為3時,定量離子對信號對應(yīng)的樣品濃度為檢出限(LOD);信噪比為10時,定量離子對信號對應(yīng)的樣品濃度為定量限(LOQ),具體結(jié)果見表2。12種待測成分的檢出限均在0.1μg/kg~1.0μg/kg之間,能夠滿足蜂蜜中藥物殘留檢測的要求。2.5反應(yīng)物回收率和精密度試驗用陰性蜂蜜樣品進行加標(biāo)回收率和精密度實驗,樣品先加入500μl2