復元膠囊對骨關(guān)節(jié)炎軟骨及血清il-6的影響

復元膠囊對骨關(guān)節(jié)炎軟骨及血清il-6的影響

骨關(guān)節(jié)炎（oa）是老年人常見的慢性和進展性關(guān)節(jié)疾病，也是老年人導致關(guān)節(jié)障礙的主要原因。OA以關(guān)節(jié)軟骨退化和破壞為主要病理特征,其發(fā)病與衰老、外傷、炎癥、代謝、免疫、遺傳、過度運動等多種因素有關(guān),但確切發(fā)病機制尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn),白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)參與介導骨關(guān)節(jié)炎的免疫及炎癥反應,是OA發(fā)展中重要的炎癥介質(zhì)。在骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨組織及血清中,IL-6含量明顯升高,并與病情嚴重程度相關(guān)。復元膠囊(Fuyuancapsule,Fyc)為一臨床治療OA的有效復方,前期研究表明,其可減輕軟骨病變,抑制IL-1表達。本文主要研究復元膠囊對骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨及血清IL-6的影響,探討其抗OA的作用機制。1軟骨標本的檢測1.1藥品試劑復元膠囊(由重慶希爾安藥業(yè)公司生產(chǎn))主要成分為鹿角膠、淫羊霍、黃芪、人參、三七粉、川芎等中藥組成,每粒0.41g,每克粉末含生藥3g。大鼠IL-6免疫組化試劑盒及ELISA試劑盒由武漢博士德生物科技有限公司提供。1.2實驗方法雄性SD清潔級大鼠60只,9~10周齡,體質(zhì)量(300±10)g,由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供。隨機選12只為對照組,行皮膚切開后縫合;其余48只為造模組,采用Hulth法造模。將大鼠用5%水合氯醛按0.7ml/100g(體質(zhì)量)腹腔注射麻醉,無菌條件下剪斷內(nèi)側(cè)副韌帶及前后交叉韌帶,完整切除內(nèi)側(cè)半月板,逐層縫合,無菌包扎。術(shù)后予青霉素8×104U·kg-1·d-1,肌肉注射7d。術(shù)后1周將造模動物隨機分為模型組,復元膠囊高、中、低劑量組,每組12只,每天驅(qū)趕大鼠跑步30min。分別于給藥4,8,12周各組隨機處死4只大鼠,取血清及軟骨標本。1.3給藥方法根據(jù)Meeh—Rubner公式計算復元膠囊給藥劑量。復元膠囊高、中、低劑量組給藥量分別為:371.65,743.30,2229.90mg·kg-1·d-1;分別配成2ml溶液于造模后1周開始灌胃。模型組及對照組給予生理鹽水2ml。1.4觀察指標1.4.1大體觀察關(guān)節(jié)軟骨取軟骨標本,觀察關(guān)節(jié)囊、滑膜、關(guān)節(jié)軟骨大體形態(tài)及有無關(guān)節(jié)積液,并按以下原則評分:關(guān)節(jié)面光整,色澤正常為0分;關(guān)節(jié)面粗糙,有裂隙,色澤灰暗為1分;關(guān)節(jié)面糜爛,軟骨缺損達軟骨表中層為2分;關(guān)節(jié)面潰瘍形成,軟骨缺損達軟骨深層為3分;軟骨剝脫,軟骨下骨暴露為4分。1.4.2光鏡觀察關(guān)節(jié)軟骨取股骨內(nèi)髁全層軟骨及脛骨平臺軟骨標本置于4%多聚甲醛溶液中固定,10%EDTA脫鈣2周,常規(guī)石蠟包埋,切片HE染色觀察軟骨組織的結(jié)構(gòu)、細胞數(shù)量和潮線的完整性。依據(jù)Mankin’s評分標準進行評分。1.4.3免疫組化檢測軟骨IL-6表達待檢軟骨標本常規(guī)石蠟包埋,連續(xù)切片5μm,撈片于多聚賴氨酸防脫處理過的載玻片上,切片脫蠟至水,3%H2O2室溫10min滅活內(nèi)源性過氧化物酶。沖洗后PBS浸泡5min,復合消化液修復抗原活性。正常血清封閉,滴加1∶100稀釋抗大鼠IL-6抗體(武漢博士德),4℃孵育過夜。PBS沖洗5min,3次。滴加生物素標記的二抗(美國SantaCruz公司),37℃孵育20min,PBS沖洗5min,3次。滴加SABC—HRP(美國santaCruz公司),37℃孵育20min。PBS沖洗5min,3次。二甲基聯(lián)苯胺(DAB)室溫下顯色至滿意,自來水終止顯色反應。蘇木素復染細胞20s,洗去多余染液,酒精梯度脫水后封片,顯微鏡下觀察。圖像分析:每個標本取5張切片,每張切片OLYMPUSBX50顯微鏡下放大400倍,隨機取5個視野,用北航醫(yī)學圖像分析管理系統(tǒng),測定其陽性細胞的百分數(shù)。1.4.4ELISA法測定大鼠血清中IL-6水平吸取100μl樣品、稀釋標準品和質(zhì)控分別至每孔,加50μl稀釋生物素標記檢測抗體后,室溫孵育1h,洗板3次,吸走液體后,加100μl親和素-HRP,再室溫孵育30min,洗板3次,吸走液體后,每孔加TMB,避光反應12~15min后,加100μlH2SO4中止反應,于5min內(nèi)酶標儀上在450nm處讀取吸光度(A)值。以標準濃度為橫坐標,A值為縱坐標繪制標準曲線,根據(jù)標本A值,在標準曲線上查出IL-6的水平,計算結(jié)果,以pg/ml表示。1.5統(tǒng)計學處理所有數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示,采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件分析,組間差異顯著性檢驗用F檢驗,兩兩比較用q檢驗,IL-6水平與Mankin’s評分指數(shù)采用Pearson相關(guān)分析,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。2結(jié)果2.1fyc各組的損傷情況對照組實驗過程中,未見明顯異常。4周:各造模組關(guān)節(jié)軟骨色稍黃,關(guān)節(jié)液稍增多,模型組較明顯,無明顯裂紋、糜爛及潰瘍。8周時各造模組病變加重,滑膜增生,軟骨面粗糙,呈毛刺狀,模型組有裂紋、糜爛和潰瘍出現(xiàn)。Fyc各組損傷較模型組輕。12周時Fyc各組部分軟骨有裂紋、糜爛及細小潰瘍形成。模型組滑膜顯著增生,軟骨面多見潰瘍,可深達骨質(zhì),軟骨下骨暴露。各組軟骨評分見表1。2.2fyc各時間點的線性相關(guān)系數(shù)表1對照組軟骨結(jié)構(gòu)正常,細胞排列整齊。各造模組損傷隨時間推移加重,Mankin’s評分差異具有顯著性:模型組8周高于4周(P<0.01)、12周高于8周(P<0.01);Fyc各組8周高于4周(P<0.01),12周高于8周(P<0.05)。各時間點Fyc各組Mankin’s評分低于模型組,以8周及12周差異顯著;8周及12周時,Fyc高、中、低劑量組Mankin’s評分差異具有顯著性(p<0.05)。各組Mankin’s評分見表2。2.3軟骨和血清的il-6水平2.3.1il-6表達情況4,8,12周時IL-6表達造模組較對照組顯著升高(P<0.01),Fyc各劑量組較模型組低,差異具有顯著性(高、中劑量組P<0.01,低劑量組P<0.05);各造模組IL-6表達8周較4周時顯著升高(P<0.01),12周較8周時顯著升高(模型組P<0.01,Fyc各組P<0.05),IL-6表達隨時間推移增加;各時段Fyc高、中、低劑量組IL-6表達差異具有顯著性(P<0.05);各組IL-6表達見表3。2.3.2比較顯著性分析4周,8周,12周時血清IL-6水平造模組較對照組顯著升高(P<0.01),Fyc各劑量組較模型組低,差異具有顯著性(P<0.01);各模組血清IL-6水平8周較4周時顯著升高(P<0.01),12周較8周時顯著升高(P<0.01),血清IL-6隨OA發(fā)展升高;各時段Fyc高、中、低劑量組血清IL-6水平差異具有顯著性(P<0.05)。各組血清IL-6水平見表4。2.4il-6評分①軟骨IL-6與Mankin’s評分:兩者相關(guān)系數(shù)r=0.98(P<0.01);②血清IL-6與Mankin’s評分:兩者相關(guān)系數(shù)r=0.96(P<0.01);③軟骨與血清IL-6:兩者相關(guān)系數(shù)r=0.98(P<0.01),均呈顯著正相關(guān)。3il-6在文化方面的應用及對大鼠阿志匹骨髓炎的治療應注意使用的藥物OA是在力學和生物學因素共同作用下,軟骨細胞、細胞外基質(zhì)及軟骨下骨三者間分解和合成代謝失衡的結(jié)果。炎癥及細胞因子通過促進軟骨細胞的凋亡及抑制增殖、降低機體抗氧化作用、促進蛋白水解酶產(chǎn)生降解軟骨基質(zhì)以及啟動炎癥級聯(lián)反應參與OA的發(fā)生發(fā)展。IL-6是一種重要的炎癥介質(zhì),參與介導軟骨細胞凋亡及基質(zhì)降解。血液中IL-6主要來源于活化的單核細胞,局部組織的IL-6主要由滑膜成纖維細胞或局部巨噬細胞產(chǎn)生。正常及OA軟骨中分離的軟骨細胞都能自發(fā)分泌IL-6,免疫組化證實其在關(guān)節(jié)軟骨細胞原位出現(xiàn)。IL-6可誘導破骨細胞形成,增加破骨細胞活性及破骨細胞內(nèi)MMP-3的表達,在破骨細胞骨基質(zhì)降解過程中發(fā)揮生物學效應。臨床研究發(fā)現(xiàn)IL-6的抑制劑可減輕滑膜炎癥,改善臨床癥狀。IL-6mRNA表達在骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨下骨中顯著升高,且隨軟骨病變加重,表達升高。IL-6在骨關(guān)節(jié)炎犬交叉韌帶、髕下脂體、滑膜組織及軟骨中表達顯著增加;FranchimontN等研究顯示,IL-6誘導MMP-13表達,促進軟骨基質(zhì)中二型膠原的降解。此外,IL-6參與誘導ADAMTS-5,而后者是降解軟骨基質(zhì)中蛋白聚糖的主要酶之一,可裂解蛋白聚糖大分子導致軟骨基質(zhì)破壞;IL-6還與IL-1β共同參與OA發(fā)展過程中的氧化損傷,二者通過失調(diào)軟骨的抗氧化酶防御作用導致H2O2在軟骨細胞線粒體中堆積,引起線粒體損傷,促進軟骨細胞的凋亡。這些結(jié)果提示在軟骨細胞增生和關(guān)節(jié)軟骨的新陳代謝中,IL-6是一種負向調(diào)節(jié)劑,增強炎癥過程,加重關(guān)節(jié)病變。骨關(guān)節(jié)炎屬于中醫(yī)“骨痹”“骨萎”“腰腿痛”范疇?！端貑枴け哉摗吩弧八^痹者,各以其時重感于風寒濕三氣也”,“故骨痹不已復感于邪,內(nèi)舍于腎”。本病因年老體衰、跌撲閃挫、過度勞損、肝腎虧虛、元陽不足,溫煦鼓動無力,致氣血瘀阻,筋脈凝滯,筋骨失養(yǎng),加之寒濕乘虛侵襲,留注關(guān)節(jié)導致經(jīng)脈淤滯而發(fā)病。正虛為本,是發(fā)病基礎(chǔ),寒濕邪侵是其誘因。該病一方面因虛致病:腎元虧虛,無以主骨生髓,筋骨失養(yǎng),風寒濕邪入侵而為痹;另一方面因病致虛:風寒濕留著于關(guān)節(jié),筋骨勞損,氣虛血瘀,久則腎元虧虛,氣血不調(diào),脈絡(luò)失和而為痹。腎元虧虛既是骨痹發(fā)生的內(nèi)在因素,又是骨痹發(fā)展的最終歸宿。楊清叟提出“腎實則骨有生氣”腎虛則骨病;王清任在《醫(yī)林改錯》中提出“痹有瘀血”,加之骨痹為一慢性進展性疾病,“久病多瘀”“久病多虛”,故骨痹的治療,應重在溫補腎元、活血化瘀。復元膠囊配伍淫羊藿、鹿角膠、黃芪、川芎、丹參、三七粉等中藥,以補腎益氣、活血化瘀立法,為臨床治療骨關(guān)節(jié)炎的有效復方。本研究中,Fyc各劑量組軟骨Mankin’s評分、軟骨及血清IL-6水平較模型組低,提示Fyc對大鼠OA有防治作用,其作用可能通過降低關(guān)節(jié)軟骨局部及血清IL-6水平,減輕免疫及炎癥反應而實現(xiàn)。Fyc高、中、低劑量組間,軟骨病變差異具有顯著性,Fyc高劑量組軟骨病變最輕,提示Fyc對大鼠OA作用呈劑量依賴性。各組軟骨及血清IL-6水平與Mankin’s評分指數(shù)、血清IL-6水平與軟骨IL-6表達呈顯著正相關(guān),提示軟骨及血清IL-6水平與OA病情發(fā)展及嚴重程度相關(guān),IL-6可作為OA病情監(jiān)測指標及藥物治療的作用靶點。軟骨及