淺談貝類的血細(xì)胞在免疫防御中的作用

淺談貝類的血細(xì)胞在免疫防御中的作用

由于它們是開放的系統(tǒng)，不存在特定的體免疫，因此它們的主要免疫防御包括以紅細(xì)胞為基礎(chǔ)的細(xì)胞和體液系統(tǒng)。血細(xì)胞能夠在體內(nèi)或體外吞噬各種有機(jī)和無機(jī)顆粒,清除病原生物和自身損傷或死亡細(xì)胞,而且血細(xì)胞能夠產(chǎn)生各種非特異性體液因子來參與宿主的免疫防御過程。所以貝類的血細(xì)胞在宿主免疫防御機(jī)制中起著重要作用。近年來,隨著貝類養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大,貝類病害日益嚴(yán)重,給中國的貝類養(yǎng)殖業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失。所以研究貝類免疫學(xué),特別是貝類血細(xì)胞的免疫防御功能和機(jī)制,以解決貝類養(yǎng)殖中發(fā)生的病害問題已成為研究的熱點(diǎn)。本文依據(jù)國內(nèi)外有關(guān)文獻(xiàn),就貝類血細(xì)胞的分類、結(jié)構(gòu)及免疫功能方面的研究作一綜述,為國內(nèi)外研究提供理論基礎(chǔ)及資料。1抗凝劑對牡蠣紅細(xì)胞分類及組織學(xué)檢測的影響貝類血細(xì)胞的分類一直分歧很大,有人將其分為三類:無顆粒細(xì)胞、小顆粒細(xì)胞、大顆粒細(xì)胞,也有人將其分為四類:大顆粒細(xì)胞、小顆粒細(xì)胞、透明細(xì)胞、漿細(xì)胞,還有人將其分為八類,甚至幾十類,至今無統(tǒng)一命名。關(guān)于血細(xì)胞的分類,Moore等根據(jù)血細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和對染色反應(yīng)的不同,將紫貽貝(Mytilusgalloprovincialis)血細(xì)胞分為兩大類,無顆粒的嗜堿性細(xì)胞和有顆粒的嗜酸性顆粒細(xì)胞,嗜堿性細(xì)胞可進(jìn)一步分為小淋巴細(xì)胞和大的吞噬性巨噬細(xì)胞。他們認(rèn)為巨噬細(xì)胞是主要參與清除外來異物的細(xì)胞類型,而小淋巴細(xì)胞可能是嗜堿性細(xì)胞系的干細(xì)胞,因?yàn)樵谛×馨图?xì)胞中發(fā)現(xiàn)有絲分裂現(xiàn)象。Bubel等和Bayne等分別在紫貽貝(Mytilusgalloprovincialis)和加洲貽貝(Mytiluscalifornianus)中也發(fā)現(xiàn)了3種血細(xì)胞,嗜酸性顆粒細(xì)胞、小嗜堿性透明細(xì)胞、大嗜堿性透明細(xì)胞,其中嗜堿性細(xì)胞包含有溶酶體酶,能吞噬膠體碳顆粒;而顆粒細(xì)胞體積較小,在血淋巴中占優(yōu)勢,是防御反應(yīng)中最早出現(xiàn)的細(xì)胞類型,無吞噬能力。Ruddell將長牡蠣(Crassostreagigas)血細(xì)胞分為3種類型,無顆粒的阿米巴狀細(xì)胞、嗜堿性顆粒細(xì)胞和嗜酸性顆粒細(xì)胞。Cheng等將美國東部牡蠣(Crassostreavirginica)和硬殼蛤(Mercenariamercenaria)的血細(xì)胞分為3類,顆粒細(xì)胞、透明細(xì)胞、纖維細(xì)胞。Wootton等利用光鏡和電鏡研究淺溝蛤(Scrobiculariaplana)的血細(xì)胞,也鑒定了3種類型:嗜酸性顆粒細(xì)胞,嗜堿性顆粒細(xì)胞、嗜堿性無顆粒細(xì)胞。嗜酸性顆粒細(xì)胞含有大量的顆粒和較多的空泡;嗜堿性顆粒細(xì)胞含有較小的顆粒和大量的糖原顆粒,嗜堿性無顆粒細(xì)胞較小,核大。在國內(nèi)也有部分研究者對貝類血細(xì)胞分類進(jìn)行了研究:李太武等的研究結(jié)果表明,皺紋盤鮑(Haliotisdiscushanai)血淋巴中的細(xì)胞可分為顆粒細(xì)胞和透明細(xì)胞兩大類,顆粒細(xì)胞又可細(xì)分為顆粒多和顆粒少兩種類型,顆粒細(xì)胞具有吞噬能力而透明細(xì)胞無吞噬能力。孫虎山等對櫛孔扇貝(Chlamyferreri)血細(xì)胞進(jìn)行分類,將其分為擬淋巴細(xì)胞、血栓細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和巨嗜細(xì)胞六類,并認(rèn)為中性粒細(xì)胞和巨嗜細(xì)胞為主要的吞噬細(xì)胞。張維翥等分別對海灣扇貝和櫛孔扇貝的血細(xì)胞分類進(jìn)行了研究,根據(jù)血細(xì)胞的大小、形態(tài)結(jié)構(gòu)可將海灣扇貝血細(xì)胞分為四種類型:小透明細(xì)胞、大透明細(xì)胞、小顆粒細(xì)胞和大顆粒細(xì)胞;櫛孔扇貝血細(xì)胞可分為五種類型,小透明細(xì)胞、大透明細(xì)胞、小顆粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和大顆粒細(xì)胞。實(shí)際上,上述分類就是將海灣扇貝和櫛孔扇貝血細(xì)胞分為透明細(xì)胞和顆粒細(xì)胞兩大類,兩類細(xì)胞再根據(jù)大小進(jìn)一步細(xì)分?；谝陨涎芯堪l(fā)現(xiàn),學(xué)者們主要依據(jù)血細(xì)胞中顆粒的有無及對染色的反應(yīng),運(yùn)用光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡對貝類血細(xì)胞進(jìn)行分類。隨著研究的深入,近年來不少研究者運(yùn)用新技術(shù),新方法對貝類血細(xì)胞的分類進(jìn)行研究,如密度梯度離心、單克隆抗體、植物凝集素、免疫磁力分離、酶細(xì)胞化學(xué)、流式細(xì)胞技術(shù)等方法。Ford應(yīng)用Couter計(jì)數(shù)器和流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器,測量的結(jié)果將牡蠣血細(xì)胞分為二種顆粒細(xì)胞和一種無顆粒細(xì)胞三個(gè)亞群。Russell-Pinto利用光鏡、電鏡及酶細(xì)胞化學(xué)法對雙殼貝類Cerastodermaedule進(jìn)行研究,根據(jù)其對綿羊紅血球反應(yīng)不同,將血細(xì)胞分為3個(gè)類型:大的吞噬型細(xì)胞、球形凝集細(xì)胞和圓形顆粒細(xì)胞。No?l等應(yīng)用單克隆抗體技術(shù),對貽貝血細(xì)胞的亞群從其抗原性特征進(jìn)行了研究,免疫染色鑒定了4種單抗,從免疫染色的結(jié)果來看,貽貝至少可以區(qū)分出3種不同類型的血細(xì)胞。Nakayama等通過形態(tài)觀察和細(xì)胞化學(xué)研究,認(rèn)為在番紅■磲(Tridacnacrocea)存在3類血細(xì)胞,命名為嗜酸性顆粒細(xì)胞、無顆粒細(xì)胞和桑葚樣細(xì)胞,并發(fā)現(xiàn)3類細(xì)胞在吞噬作用和血細(xì)胞凝集等過程中表現(xiàn)不同的功能。Lopez等發(fā)現(xiàn)針對長牡蠣血細(xì)胞的抗體對蛤仔(Ruditapesdecussatus)所有血細(xì)胞均有交叉反應(yīng),然而針對紫貽貝血細(xì)胞的抗體卻沒有表現(xiàn)出交叉反應(yīng),因此認(rèn)為單克隆抗體并不能區(qū)分血細(xì)胞亞功能群。Carballal等發(fā)現(xiàn)紫貽貝的血細(xì)胞在功能上有差異,顆粒細(xì)胞吞噬能力很強(qiáng),而透明細(xì)胞則不具備吞噬能力,而且嗜酸性顆粒細(xì)胞的吞噬能力比嗜堿性顆粒細(xì)胞強(qiáng)。Hine等認(rèn)為在貝類血淋巴中顆粒細(xì)胞是一個(gè)獨(dú)立的類群,而無顆粒細(xì)胞在表型和超微結(jié)構(gòu)上是不相同的,可分為3種細(xì)胞,胚樣(Blast-like)細(xì)胞、嗜堿性巨噬樣細(xì)胞、透明細(xì)胞;顆粒細(xì)胞和巨噬樣細(xì)胞的功能不同,血淋巴的組成在個(gè)體間變化很大,而且顆粒細(xì)胞在早期和發(fā)育過程中可能是透明的。胚樣細(xì)胞的區(qū)分表明造血過程可以發(fā)生在周圍相連的廣泛組織中,產(chǎn)生血細(xì)胞的方式與脊椎動(dòng)物相似。Xue等采用流式細(xì)胞儀測定歐洲扁牡蠣Dstreaedulis血細(xì)胞亞群,結(jié)果顯示血細(xì)胞可能由3個(gè)血細(xì)胞亞群組成,這三個(gè)亞群分別對應(yīng)于光鏡和電鏡分析鑒定的三個(gè)亞群,小透明細(xì)胞、大透明細(xì)胞、顆粒細(xì)胞。Soares-da-Silva等利用流式細(xì)胞儀技術(shù)和形態(tài)學(xué)觀察將淡水蟶(Anodontacygnea)的血細(xì)胞分為兩大類,一類較大,有顆粒,占血細(xì)胞總數(shù)的75%,另一類較小,無顆粒,約占血細(xì)胞總數(shù)的25%。由于貝類種間的差異性和研究方法的不同,造成了貝類血細(xì)胞分類上的復(fù)雜化,難以獲得統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。但血細(xì)胞一個(gè)重要的特征是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)顆粒的有無,因此,目前比較認(rèn)同的標(biāo)準(zhǔn)是將貝類血細(xì)胞分為顆粒細(xì)胞和透明細(xì)胞兩大類。但Nakayama等所報(bào)道的桑葚樣細(xì)胞不同于顆粒細(xì)胞和透明細(xì)胞,可能是一種新的細(xì)胞類型。這種情況可能是由于在有的貝類中確實(shí)存在不止兩類血細(xì)胞,但也有可能是用形態(tài)學(xué)手段不能區(qū)分的同一細(xì)胞系的不同發(fā)育階段和形式,因此采用多種手段和方法對貝類血細(xì)胞進(jìn)行分類是必要的。2紅細(xì)胞的免疫功能2.1紅細(xì)胞內(nèi)占和血淋巴相關(guān)的免疫活性研究貝類的主要防御手段是由血細(xì)胞完成的吞噬作用(Phagocytosis)。吞噬作用能夠清除入侵的病原體包括細(xì)菌、原蟲、大分子物質(zhì)及無機(jī)顆粒等。當(dāng)外界條件改變,尤其是動(dòng)物受到外界抗原物質(zhì)刺激時(shí),貝類的主要表現(xiàn)就是吞噬反應(yīng),而且其血細(xì)胞吞噬外來異物時(shí),清除的速率大小取決于細(xì)胞表面的特征。在大多數(shù)報(bào)道的貝類中,吞噬作用主要是由顆粒細(xì)胞完成的,顆粒細(xì)胞表現(xiàn)出很高的吞噬能力,而且其吞噬能力與年齡無關(guān),但易受外界環(huán)境因素的影響,如溫度、鹽度等,透明細(xì)胞也具有一定的吞噬能力,但不是主要的。從免疫防御的角度講,血細(xì)胞可以活躍地趨化到炎癥和損傷部位,進(jìn)行吞噬,是免疫防御的主要細(xì)胞類型。2.1.1吞噬和殺傷機(jī)制吞噬作用的過程大致可以分為趨化、黏附、內(nèi)吞以及殺傷消化四個(gè)階段。研究證明貝類血細(xì)胞可以向外源顆粒趨化靠近,貝類具有開放式循環(huán)系統(tǒng),器官浸浴在血淋巴中,血管也沒有完整的內(nèi)皮系統(tǒng),血細(xì)胞可以較自由地到達(dá)廣泛的器官和組織。與外來物質(zhì)的接觸較為充分,因此,趨化的選擇意義不像在高等動(dòng)物那樣重要。血細(xì)胞靠近異物后首先發(fā)生黏附,隨后,血細(xì)胞伸出偽足對異物進(jìn)行包裹,偽足相接觸后細(xì)胞質(zhì)膜融合,形成吞噬小體進(jìn)入細(xì)胞。Cajaraville和Pal對貽貝(Mytilusedulis)亞顯微結(jié)構(gòu)的電鏡研究表明,顆粒細(xì)胞和透明細(xì)胞都可以由局部細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)陷形成衣被小泡或無衣被的電子透明的內(nèi)吞小體,完成內(nèi)吞。LeGall等還證明內(nèi)吞過程有細(xì)胞骨架的活躍參與。血細(xì)胞對吞噬后的病原體的殺傷作用主要通過兩條途徑實(shí)現(xiàn),一是將外源顆粒內(nèi)化后形成吞噬小體,然后吞噬小體與含有水解酶類的胞質(zhì)顆粒融合,逐步將外源顆粒水解消化,顆粒細(xì)胞中的水解酶包括溶菌酶、磷酸酶、脂酶、蛋白酶、葡萄糖苷酶等。Mohandas等用掃描電鏡的方法證明,在受到細(xì)菌刺激時(shí),硬殼蛤的顆粒細(xì)胞在吞噬外來細(xì)菌的過程中,將溶菌酶釋放到血清中,可見血細(xì)胞不僅直接參與吞噬反應(yīng),還釋放水解酶類到血淋巴中參與體液免疫。Cushing等用一種革蘭氏陰性菌EMD-1作誘導(dǎo)源,對紅鮑、粉紅鮑、黑鮑進(jìn)行注射誘導(dǎo)研究他們的免疫反應(yīng),其結(jié)果表明,在體液中不僅發(fā)現(xiàn)溶菌酶,而且還發(fā)現(xiàn)了其他與免疫有關(guān)的酶和因子。Yoshino等對未經(jīng)細(xì)菌刺激和經(jīng)過細(xì)菌刺激的B.Glabrata血淋巴中胺肽酶活性進(jìn)行了研究并指出,在血清中胺肽酶活性最高,其功能可能與在吞噬前降解血清蛋白中外來蛋白有關(guān)。Cheng等對硬殼蛤和美國東部牡蠣血清和血細(xì)胞中β-葡萄糖苷酶的研究表明,這種酶可能通過作用于敏感的入侵細(xì)菌,在內(nèi)部防御中起作用。Carballal等用半定量光密度法測定了貽貝血細(xì)胞中與免疫防御功能相關(guān)的酶類,表明該貽貝血細(xì)胞含有磷酸酶、脂酶、蛋白酶、葡萄糖苷酶;這些酶類的活性水平在11月和19月齡貝中無顯著差異;研究同時(shí)表明,溶菌酶活性在血細(xì)胞中較高,在血清中較低。Xue等采用APIZYM試劑盒對歐洲扁牡蠣和太平洋牡蠣血淋巴的酶進(jìn)行測定研究,結(jié)果顯示在歐洲扁牡蠣可檢測出15種酶,而在太平洋牡蠣血淋巴中檢測到16種酶。Cronin等對歐洲扁牡蠣血淋巴中的溶菌酶活性水平進(jìn)行了測定研究,結(jié)果表明,血淋巴中的溶菌酶活性水平個(gè)體差異較大,但在健康貝和患病貝之間無顯著差異。Antonio等研究發(fā)現(xiàn)在成體太平洋牡蠣血細(xì)胞中的溶菌酶活性比血清中的溶菌酶高五倍,幼貝血細(xì)胞中的溶菌酶活性比血清高98倍。絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)信號(hào)通路是近年來發(fā)現(xiàn)廣泛存在于各種動(dòng)物細(xì)胞中的一條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,在低等無脊椎動(dòng)物貝類中也存在。最近研究發(fā)現(xiàn),宿主在清除體內(nèi)入侵病原體的時(shí)候,絲裂原活化蛋白激酶的激活也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。研究證明有纖毛的大腸桿菌和貽貝的血細(xì)胞作用后,在血淋巴液的環(huán)境中可誘導(dǎo)P38MAPK的持續(xù)磷酸化,如果沒有血淋巴液存在,僅靠血細(xì)胞不能引起P38MAPK的磷酸化,但P38MAPK特異性抑制劑SB302580可顯著降低血淋巴液的殺菌活性。這些結(jié)果說明P38MAPK在介導(dǎo)血細(xì)胞的殺菌過程中起著重要作用,而且血淋巴液中的其他細(xì)胞因子在血細(xì)胞殺菌過程中也起著重要作用。血細(xì)胞對吞噬后病原體的殺傷作用的另一條途徑是通過伴隨吞噬作用的呼吸爆發(fā)(Respiratoryburst)來激活位于質(zhì)膜上的NADPH氧化酶,從而產(chǎn)生多種活性氧中間體(Reactiveoxygenintermediates,ROIs)來殺傷病原微生物,此過程中產(chǎn)生的ROIs包括超氧化物自由基、過氧化氫、羥基自由基、單線態(tài)氧等。2.1.2包囊作用如果異物比血細(xì)胞大得多,例如寄生蟲、壞死組織、外源植入物等,則血細(xì)胞對該異物的吞噬動(dòng)員了全部的細(xì)胞膜表面積,表現(xiàn)為血細(xì)胞在異物表面上完全伸展,扁平化,由若干吞噬細(xì)胞共同將異物包裹起來,這稱為包裹作用。最初,血細(xì)胞對異物的包裹比較疏松,隨著越來越多的細(xì)胞聚集到異物處,與異物直接接觸的細(xì)胞變扁平,并充分伸展,形成包裹異物的連續(xù)的細(xì)胞層。在伸展和扁平化的過程中微管以及成束的微絲出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)周邊區(qū)域,說明這些結(jié)構(gòu)在細(xì)胞伸長的過程中起到了重要的作用。最后,包裹變得越來越堅(jiān)固,血細(xì)胞通過細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外消化將被包裹的異物消除。2.2調(diào)理素對紅細(xì)胞外源異構(gòu)作用的作用在吞噬作用中涉及到的一個(gè)重要的問題是,血細(xì)胞怎樣有效地識(shí)別異物,區(qū)分自我和非我,這是吞噬作用發(fā)揮防御功能的前提。2.2.1調(diào)理作用由于貝類沒有類似于高等動(dòng)物主要組織相容性復(fù)合體(MHC)和免疫球蛋白(Ig)那樣的基于可重排分子的識(shí)別系統(tǒng),貝類對異物的識(shí)別主要依賴于一些其他非特異的識(shí)別因子。研究發(fā)現(xiàn),貝類血細(xì)胞的趨化、黏附和吞噬過程都可被某些血清因子促進(jìn),這說明貝類血細(xì)胞對異物的識(shí)別,類似于高等生物,也依賴于血漿中某些因子的作用,這些因子統(tǒng)稱為調(diào)理素。Smlnia等證明,將酵母和綿羊紅細(xì)胞預(yù)先在靜水椎實(shí)螺(Lymnaeastagnalis)的無細(xì)胞血淋巴中進(jìn)行溫育,可以顯著提高其血細(xì)胞在體外對酵母和綿羊紅細(xì)胞的吞噬。Renwrantz和Mohr的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)從另一個(gè)角度說明了同樣的問題:他們將人A1和B型紅細(xì)胞預(yù)先與蓋罩大蝸牛(Helixpomatia)的血清在體外進(jìn)行溫育處理,然后注射入該動(dòng)物,發(fā)現(xiàn)可以顯著提高其對人紅細(xì)胞的清除速率。他們還發(fā)現(xiàn),如果在首次注射大劑量未經(jīng)處理的A1型人紅細(xì)胞后,經(jīng)過12—19h后再次注射同樣未經(jīng)處理的A1型人紅細(xì)胞時(shí),則清除速度與第一次注射相比極為緩慢,表現(xiàn)出一種抑制效應(yīng),而如果將第二次注射的紅細(xì)胞預(yù)先與該種動(dòng)物的血清進(jìn)行溫育,則其清除速度與第一次注射類似。這說明產(chǎn)生抑制效應(yīng)的原因是第一次注入大劑量的外源顆粒消耗掉了血漿中某種對識(shí)別起輔助作用的調(diào)理因子而不是飽和了動(dòng)物的吞噬能力,這同時(shí)說明調(diào)理素對血細(xì)胞識(shí)別異物有重要的促進(jìn)作用。貝類血淋巴中的內(nèi)源性凝集素已被證明對于識(shí)別和吞噬外源顆粒具有重要的輔助作用。Lackie研究結(jié)果證明,除了部分酶對異物有一定的識(shí)別作用外,凝集素在識(shí)別異物方面也起著重要作用。Olafsen證實(shí)有時(shí)細(xì)菌的感染可以誘導(dǎo)貝類凝集素的產(chǎn)生并促進(jìn)對細(xì)菌的抑制和破壞:Chintala等證實(shí)寄生蟲的感染可引起美洲牡蠣血清凝集素濃度的改變。Tunkijjanudij等從馬貽貝的血淋巴中得到一種能與LPS特異結(jié)合的凝集素,它不同于與唾液酸特異結(jié)合的凝集素,該凝集素經(jīng)純化后能對多種海洋細(xì)菌表現(xiàn)抗菌活性,而未經(jīng)處理的貽貝血淋巴對這些細(xì)菌的抗菌作用卻不明顯。凝集素是一類糖蛋白,具有糖結(jié)合專一性,可與細(xì)胞表面的不同糖組分結(jié)合,同時(shí)可以與吞噬細(xì)胞相結(jié)合,像橋梁一樣連接血細(xì)胞和異物,起到調(diào)理作用。凝集素在貝類中廣泛存在,有的存在于血清中,有的分布于血細(xì)胞表面。一些凝集素可使細(xì)菌凝劑便于血細(xì)胞對其進(jìn)行吞噬,一些作為血細(xì)胞和細(xì)菌表面的中介分子介導(dǎo)吞噬過程。Howland和Cheng等發(fā)現(xiàn)美國東部牡蠣的血細(xì)胞可與細(xì)菌表面的一種不含糖蛋白的蛋白質(zhì)結(jié)合,說明在貝類血液中還有別的因子參與異己識(shí)別過程。另外,Cheng和Dougherty認(rèn)為吞噬細(xì)胞的脫顆粒作用釋放出的酶可以修飾外來細(xì)胞的表面結(jié)構(gòu),從而使外源細(xì)胞被有效識(shí)別,因此溶酶體酶在此也起到了調(diào)理素的作用。但并不是所有的識(shí)別作用都依賴于血漿因子的調(diào)理作用,如Renwrantz等證明蓋罩大蝸牛對酵母的清除并不依賴于血漿成分的調(diào)理作用。2.2.2血細(xì)胞表面受體無論識(shí)別是否依賴調(diào)理作用,吞噬細(xì)胞表面特定的識(shí)別分子(受體)都是必需的。在需要調(diào)理素的情況下,調(diào)理素通過識(shí)別并結(jié)合于外來物質(zhì)或損傷組織的表面,為吞噬細(xì)胞表面受體提供了易于識(shí)別的標(biāo)記,受體識(shí)別外來顆粒表面的調(diào)理素分子。而在不依賴調(diào)理素的情況下,細(xì)胞表面受體直接識(shí)別異物,識(shí)別的完成最終取決于吞噬細(xì)胞膜上的受體。目前對貝類吞噬細(xì)胞的膜表面特征還知之甚少,一些工作揭示了吞噬細(xì)胞表面存在不同專一性受體。如Fryer等發(fā)現(xiàn)雙肺螺(Biomphlariaglabratad)血細(xì)胞對未被調(diào)理的酵母的識(shí)別可被β-1,3-葡聚糖封閉,因而推測雙肺螺血細(xì)胞具有β-1,3-葡聚糖專一性的表面受體。Stefano等的實(shí)驗(yàn)證明貽貝血液中血液阿片肽類物質(zhì)可引起免疫活性細(xì)胞的定向遷移,顯著加快血細(xì)胞的黏附過程。由于吶咯酮可大大抑制此黏附過程,表明貽貝體內(nèi)的阿片肽類物質(zhì)也和哺乳動(dòng)物體內(nèi)的阿片肽一樣,是通過細(xì)胞表面的受體介導(dǎo)而起作用的。Stefano進(jìn)一步研究了阿片神經(jīng)肽的生理作用,證明阿片肽通過免疫活性細(xì)胞表面一種δ受體的介導(dǎo)起作用。Harris-Young等證明美國東部牡蠣(C.virginica)的血細(xì)胞沒有其他體液因子的協(xié)同作用也能夠殺死創(chuàng)傷弧菌(V.vulnificus)。同樣條件下,紫貽貝的血細(xì)胞能夠吞噬并殺死霍亂弧菌(V.cholerae)和大腸桿菌(E.coli)。Wootton和Colleagues研究了紫貽貝(M.edulis)、滿月蛤(Cerastodermaedule)、Ensissiniqua的血細(xì)胞和外源凝集素的結(jié)合情況,結(jié)果表明紫貽貝血細(xì)胞與其他兩種貝的血細(xì)胞相比,和凝集素rHPA(Helixpomatiaagglutinin)及WGA(Wheatgermagglutinin)結(jié)合率較高,而和伴刀豆球蛋白(ConcanavalinA)結(jié)合率較低。這些試驗(yàn)說明,在貝類血細(xì)胞中存在和外源物質(zhì)結(jié)合的受體,并且這些受體依據(jù)外源物質(zhì)的不同有不同的結(jié)合率。由于凝集素具有與血細(xì)胞結(jié)合的特性,目前已被越來越多地用于對貝類血細(xì)胞的表面分子特征進(jìn)行研究。單克隆抗體以及多克隆抗體也被用來對貝類血細(xì)胞表面特征進(jìn)行研究,但主要集中在血細(xì)胞的分型。雖然目前這方面的工作還不多,但單克隆抗體和凝集素的運(yùn)用必將大大推動(dòng)對細(xì)胞膜表面結(jié)構(gòu)的了解,并將成為重要的研究手段。2.2.3識(shí)別機(jī)理貝類沒有像高等動(dòng)物那樣復(fù)雜的基于基因重排分子的識(shí)別系統(tǒng),它怎樣識(shí)別眾多入侵的病原體和異物呢?研究發(fā)現(xiàn),天然免疫識(shí)別分子可以識(shí)別一大組或幾大組病原體所共有的,保守的,不同于宿主自身成分的某類分子的結(jié)構(gòu)模式(稱為病原體相關(guān)分子模式,PAMP),如細(xì)菌細(xì)胞壁中的肽聚糖,革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的脂多糖,革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁的磷壁酸,細(xì)菌DNA中未甲基化的CPG二核苷酸,RNA病毒的雙鏈RNA等。與抗體對抗原物質(zhì)識(shí)別不同的是,天然免疫分子識(shí)別的不是高度專一性的空間結(jié)構(gòu)和化學(xué)結(jié)構(gòu)(抗原決定簇),而是某種結(jié)構(gòu)模式,因而是廣譜的。這些對PAMP進(jìn)行識(shí)別的免疫識(shí)別分子包括血漿中的調(diào)理因子以及血細(xì)胞表面的某些受體,它們的存在保證了貝類可以有效地對異物進(jìn)行識(shí)別進(jìn)而清除。對外源無機(jī)物顆粒的識(shí)別,可能也依賴了類似的機(jī)制,即無機(jī)顆粒與宿主細(xì)胞在疏水性和攜帶電荷方面的顯著不同構(gòu)成了另一種可識(shí)別的結(jié)構(gòu)模式,被相關(guān)的免疫識(shí)別分子識(shí)別。2.3rois產(chǎn)生的鑒定呼吸爆發(fā)雖然伴隨著吞噬作用而產(chǎn)生,但由于在這個(gè)過程中可產(chǎn)生大量的活性氧中間體來殺滅和消化病原微生物,所以在免疫防御中起著重要的作用,在此單獨(dú)進(jìn)行論述。適當(dāng)?shù)拇碳ず?吞噬細(xì)胞經(jīng)歷呼吸爆發(fā)并制造大量的細(xì)胞毒氧化劑,即胞毒活性氧,這一現(xiàn)象最初是在哺乳動(dòng)物的嗜中性白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中觀察到的?，F(xiàn)已證明呼吸爆發(fā)的第一個(gè)反應(yīng)是氧還原一個(gè)電子形成超氧陰離子(O-2),是由吞噬細(xì)胞膜上的NADPH氧化酶催化的,超氧陰離子(O-2)被胞質(zhì)酶超氧化物歧化酶(SOD)催化轉(zhuǎn)換成過氧化氫(H2O2)。過氧化氫活性很高,是有毒的RIOs之一,與髓過氧化物酶(MPO)及鹵素形成了強(qiáng)力殺菌系統(tǒng)的基礎(chǔ)。另外還可產(chǎn)生羥基自由基[OH]和單線態(tài)氧(1O2)等毒性RIOs,這些RIOs能夠參與細(xì)胞介導(dǎo)的殺滅細(xì)菌、真菌和原生動(dòng)物過程。吞噬細(xì)胞還具有解毒作用的酶用來防止自身氧化而被損傷,這些酶有SOD,谷光苷肽過氧化物酶,過氧化氫酶和某些維生素等,它們都是自由基清除劑。目前已知,很多貝類的血細(xì)胞都有典型的呼吸爆發(fā)現(xiàn)象,同時(shí)伴有ROIs的產(chǎn)生。最初的實(shí)驗(yàn)是測定血細(xì)胞吞噬外源顆粒時(shí)氧吸收的增加或MPO—鹵素—H2O2的系統(tǒng)活性,但沒有成功。Dikkeboom等刺激椎實(shí)螺血細(xì)胞后成功地測定了O-2的產(chǎn)生;同年,Nakamura等測定了扇貝血細(xì)胞在靜止和刺激狀態(tài)時(shí)產(chǎn)生的H2O2。此后,有關(guān)貝類血細(xì)胞產(chǎn)生RIOs的文章不斷增多,在這些文章中,O-2的測定采用NBT或細(xì)胞色素c還原法,H2O2測定采用比色(二氨基聯(lián)苯胺或酚紅還原)或熒光法。細(xì)胞化學(xué)發(fā)光(CL)也用作ROI產(chǎn)生的指示劑,CL法不能提供特殊ROI種類的定量信息,要區(qū)別O2或H2O2產(chǎn)生的CL信號(hào)要用適當(dāng)?shù)拿敢种苿?。目前認(rèn)為,吞噬細(xì)胞的CL反應(yīng)與呼吸爆發(fā)時(shí)的殺菌活性有關(guān),這種方法特別推薦用于貝類。Anderson和Adema等已經(jīng)將魯米諾CL方法用在了測定幾種雙殼類產(chǎn)生的ROIs,如太平洋長牡蠣、美國東部牡蠣、大扇貝(Pectenmaxmus)、歐洲扁牡蠣。同樣地,刺激腹足類血細(xì)胞后用CL測定也能顯示ROI的產(chǎn)生,如在椎實(shí)螺、Helixaspelis、Achtinaachtina。Pipe等研究了紫貽貝血細(xì)胞的NBT定量還原反應(yīng),用探針諾丹明-123活化可證明血細(xì)胞產(chǎn)生O-2。雖然常報(bào)道O-2的產(chǎn)生需要呼吸爆發(fā)氧化酶的活化,但Pipe證實(shí)紫貽貝血細(xì)胞可以在無吞噬或其他刺激下進(jìn)行NBT還原,同時(shí)證實(shí)酵母聚糖誘導(dǎo)的血細(xì)胞經(jīng)酚紅氧化產(chǎn)生H2O2,但未發(fā)現(xiàn)有自發(fā)的H2O2產(chǎn)生,除有直接細(xì)胞毒性,H2O2可能與抗菌HocI的產(chǎn)生有關(guān),因?yàn)橘O貝血細(xì)胞內(nèi)有MPO。Anderson等通過NBT還原實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),在靜止?fàn)顟B(tài)或吞噬過程中,超氧化物歧化酶都可以部分地抑制NBT還原反應(yīng)。在野外采集地和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的牡蠣血細(xì)胞全年NBT還原活性實(shí)驗(yàn)記錄表明:隨著周圍水溫的升高(2—29℃范圍內(nèi)),刺激后的血細(xì)胞NBT還原水平傾向于提高,但似乎在一定范圍內(nèi)與鹽度無關(guān)。2—13℃范圍內(nèi),溫度對牡蠣血細(xì)胞吞噬過程中NBT還原反應(yīng)的影響在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異不顯著;然而,21—29℃范圍內(nèi),溫度對牡蠣血細(xì)胞NBT還原活性有顯著的活化作用,這些結(jié)果表明,NBT還原反應(yīng)有依賴溫度或季節(jié)變化的現(xiàn)象,這一點(diǎn)在設(shè)計(jì)和解釋ROIs誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)研究時(shí)應(yīng)考慮進(jìn)去。在哺乳動(dòng)物中,一氧化氮(NO)存在于巨噬細(xì)胞中,在細(xì)胞因子如干擾素g(IFNg),腫瘤壞死因子a(TNFa),白介素(IL)或LPS刺激下由一氧化氮合成酶(NOS)產(chǎn)生,這種分子在生物機(jī)體免疫防御過程中起著關(guān)鍵的作用。近幾年,在貝類血細(xì)胞中也開始報(bào)道一氧化氮的產(chǎn)生,這說明貝類的免疫系統(tǒng)和脊椎動(dòng)物存在很大的相似性。在魯米諾、PMA或酵母聚糖的刺激下,學(xué)者們曾用化學(xué)發(fā)光技術(shù)、酶法、精氨酸標(biāo)記試驗(yàn)(精氨酸和瓜氨酸轉(zhuǎn)化試驗(yàn))直接或間接檢測到太平洋牡蠣、紫貽貝、蛤仔的血細(xì)胞產(chǎn)生NO。O-2的本身并沒有很強(qiáng)的殺菌作用,而是歧化產(chǎn)生過氧化氫來參與免疫作用或與NO結(jié)合產(chǎn)生ONNOO-。ONNOO-具有很強(qiáng)的氧化性,而且具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒作用來抵抗病原,細(xì)菌如EscherichiaCruzi,寄生蟲如克氏錐蟲Trypanosomacruzi或真菌如CandidaAlbicans。近幾年來,研究者們正在圍繞貝類血細(xì)胞內(nèi)NO產(chǎn)生的機(jī)理開展一些研究,Novas等報(bào)道,LPS刺激紫貽貝的血細(xì)胞不能誘導(dǎo)NO的產(chǎn)生,而人的IL-2和紫貽貝血細(xì)胞作用24h后能夠誘導(dǎo)NO的產(chǎn)生,而且在經(jīng)過刺激和沒有經(jīng)過刺激的血細(xì)胞中都有一個(gè)130kDa的蛋白能夠和鼠抗誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)抗體反應(yīng),而且試驗(yàn)還證明了依賴cAMP蛋白激酶(PKA)參與了NO的合成途徑。Arumugam等報(bào)道在魯米諾、PMA的刺激下或吞噬酵母聚糖的過程中,用化學(xué)發(fā)光技術(shù)可檢測到NO產(chǎn)生,實(shí)驗(yàn)證明一氧化氮合成酶和NADPH氧化酶參與了NO合成過程。2.4貽貝的免疫組化反應(yīng)貝類血細(xì)胞除了上述的免疫功能外,它們還可以在傷口修復(fù)、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)免疫反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。貝類血細(xì)胞參與這些免疫功能的基礎(chǔ)是血細(xì)胞的異己識(shí)別和吞噬功能。所以在此