農(nóng)桿菌電擊感受態(tài)的制備

農(nóng)桿菌電擊感受態(tài)的制備—轉(zhuǎn)化及驗(yàn)證農(nóng)桿菌電擊感受態(tài)的制備，轉(zhuǎn)化及驗(yàn)證制備農(nóng)桿菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)挑取根癌農(nóng)桿菌EHA105單菌落，接種于5mlLB〔含利福平(Rif)50mg/L,；鏈霉素100mg/L)液體培養(yǎng)基中，28'C,220rpm震蕩培養(yǎng)過夜。將2m1過夜培養(yǎng)的菌液加到50ml含同樣抗生素的LB培養(yǎng)基中，28'C,220rpm震蕩3-4小時，至OD600=左右。(3)5000rpm離心5分鐘，去上清。(4)加入40m110%甘油懸浮菌體，冰浴30min.(5)4'C,5000rpm離心5分鐘，去上清。(6加入30mL10%甘油重懸浮菌體，4'C,5000rpm離心5分鐘。(7)重復(fù)步驟6一次，去上清，加入2ml10%甘油懸浮，分裝于的離心管中(200p1/管)備用。2農(nóng)桿菌感受態(tài)的電轉(zhuǎn)化〔I)取2ul質(zhì)粒加到200uIEHA105感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30分鐘。把質(zhì)粒和感受態(tài)混合液吸入電極杯，電擊轉(zhuǎn)化。馬上加入】ml新鮮的LB液體培養(yǎng)基，28'C,150rpm輕搖4-6小時。⑷收集菌體涂布于含有鏈霉素100mg/L),利福平(50mg/L)及質(zhì)粒所含的抗性的LB固體培養(yǎng)基平板上。28°C培養(yǎng)2-3天。其實(shí)和大腸桿菌電轉(zhuǎn)化差不多，只不過培養(yǎng)溫度是28度，搖的時間長一些，還有就是鏈霉素和利福平兩種抗生素要加上，目的是防止根癌膿桿菌自帶質(zhì)粒的丟失，不過具體要加哪些抗生素還得看你是那種根癌膿桿菌非常感謝我用的不是電轉(zhuǎn)化是把莖和葉浸在農(nóng)桿菌液里30秒..想知道為什么不是把菌液直接滴在土里可以采用注射法導(dǎo)入農(nóng)桿菌還有就是把植株取出放入侵染液中用真空滲透法導(dǎo)入感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化方案二1、 農(nóng)桿菌選擇：LBA4404、EHA105、GV31012、 農(nóng)桿菌活化：將保存的農(nóng)桿菌在固體LB培養(yǎng)基上畫線，抗生素濃度為：50rg/ml。28C培養(yǎng)。3、農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備：1)挑取單菌落接種于3mlLB液體培養(yǎng)基中，220rpm28C振蕩培養(yǎng)至OD600=。2)吸取菌液于離心管中，冰浴10min；3)5000rpm離心30s，棄去上清液；4)沉淀用mlNaCl懸浮，冰浴20min；5)5000rpm離心30s，棄去上清液；6)每管用100H20mMCaCl2懸浮，用于轉(zhuǎn)化；制備好的感受態(tài)細(xì)胞可馬上使用，也可按每管200ul分裝于無菌離心管中，于4C保存48小時內(nèi)使用，長期貯存時必須在液氮中速凍后轉(zhuǎn)一70°C保存。使用時從一70°C取出，置冰上融化后使用。4、DNA直接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌：1）50H農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中加入質(zhì)粒DNA?捉g,之后冰浴30min；2）放入液氮中5min,然后立即放入37C水浴鍋中水浴5min；3）取出離心管，加入，28C、220rpm振蕩培養(yǎng)3?5hr；4）取出菌液于含相應(yīng)抗生素的LB平板上涂板，在培養(yǎng)箱中28C條件下倒置培養(yǎng)。2天左右菌落可見。中28C過夜活化。取2ml過夜菌液接種于50mlYEP培養(yǎng)基中28C生長至OD600約等于左右。5krpm離心5分鐘。在10mlNaCl中懸浮細(xì)胞。5krpm離心5分鐘，懸浮細(xì)胞于20ml冰預(yù)冷的CaCl2。如不是馬上使用，可以將之按200ul分裝儲存于-80C待用。加lugDNA于200ul感受態(tài)細(xì)胞中，冰上放置30分鐘。液氮中冷凍1分鐘。8.37C水浴溶化細(xì)胞。9.加1mlYEP培養(yǎng)基，28C搖床培養(yǎng)2-4hr。10.離心1分鐘，懸浮細(xì)胞在100ulYEP培養(yǎng)基中。11.涂板，28C培養(yǎng)2-3天。電轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備與轉(zhuǎn)化1?挑取單克隆接種于2mlYEP液體培養(yǎng)基，28°C,250rpm,振蕩培養(yǎng)過夜。將菌液按1:100轉(zhuǎn)移至200mlYEP培養(yǎng)液中，28C,250rpm，振蕩培養(yǎng)至OD=（約4~5h）。轉(zhuǎn)入50ml的無菌離心管，4C,4000rpm離心10min,棄上清。4.用20ml冰浴的HEPES（1mM，）重懸。5.4C，4000rpm離心10min，棄上清。6.重復(fù)4、5步驟2~3次。用2ml冰浴的10%甘油重懸。每管100nl分裝于無菌的Eppendorf管中，-70C保存。1mMHEPES的配制：稱取粉末，加水溶解，定容至500ml，用NaOH調(diào)pH至，滅菌后待用。注：HEPES需現(xiàn)用現(xiàn)配。電擊法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞取出農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞于冰上凍融。加2H質(zhì)粒DNA于100H感受態(tài)細(xì)胞中，用槍頭輕輕攪拌混勻。取出細(xì)胞與質(zhì)粒的混合物轉(zhuǎn)入電擊杯中（電擊杯-20C預(yù)冷），在2500V高壓下電擊。取出電擊杯，加入500口l預(yù)冷的YEP培養(yǎng)液（不含抗生素），輕輕吹打混勻，吸出菌液轉(zhuǎn)入離心管中，28C，200rpm振蕩培養(yǎng)5ho取30-40^l菌液涂在含相應(yīng)抗生素的YEP平板上，28°C倒置培養(yǎng)~2d。注:1.細(xì)胞與質(zhì)粒的混合物應(yīng)沿槽壁慢慢加入電擊杯中，避免產(chǎn)生氣泡。2.電擊前擦干電擊杯外側(cè)。涂板菌液量可根據(jù)菌液濃度作調(diào)整。11111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111桿菌轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證A.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定挑取轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌單菌落接種于含50口g/mlKanamycin的YM液體培養(yǎng)基中，28C,220rpm搖培16hr，直接用菌液做PCR。PCR反應(yīng)體系如下：反應(yīng)組分 體積終濃度母液濃度農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子菌液 2^lP1(35S)2口l200nM 2^MP2(GUS)2口l200nM2^M10XPCRBuffer2^lMg2+rl25mMdNTPnl150^MTaq酶nl1U5U/HH2OH20HPCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)置如下：94C預(yù)變性3min后開始以下循環(huán)反應(yīng)：94C變性