特殊生物顯微鏡的原理與使用

特殊生物顯微鏡的原理與運(yùn)用河北大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室主要內(nèi)容暗視野顯微鏡相差顯微鏡偏光顯微鏡微分干涉顯微鏡熒光顯微鏡激光共焦掃描顯微鏡1暗視野顯微鏡根據(jù)丁達(dá)爾效應(yīng)原理設(shè)計(jì)的一種在黑色背景條件下察看被檢物體的顯微鏡察看到明場(chǎng)看不到的極其微小的物體最高分辨率可達(dá)0.004微米1.1原理丁達(dá)爾景象：在日常生活中，室內(nèi)飛揚(yáng)的微?；覊m是不易被看見的，但在暗的房間中假設(shè)有一束光線從門縫斜射進(jìn)來，灰塵便粒粒可見了，這就是微粒發(fā)光。暗視野顯微鏡就是利用微粒發(fā)光原理設(shè)計(jì)的。1.2構(gòu)造特點(diǎn)運(yùn)用中央遮光板或暗視野聚光器〔常用的是拋物面聚光器〕，使光源的中央光束被阻撓。不能由下而上地經(jīng)過標(biāo)本進(jìn)入物鏡。從而使光線改動(dòng)途徑，傾斜地照射在察看的標(biāo)本上，標(biāo)本遇光發(fā)生反射或散射，散射的光線投入物鏡內(nèi)，因此整個(gè)視野是黑暗的。暗場(chǎng)顯微鏡原理1.3成像特點(diǎn)及優(yōu)缺陷在暗視野中所察看到的是被檢物體的衍射光圖像，并非物體本身，所以只能看到物體的存在和運(yùn)動(dòng)，不能辨清物體的細(xì)微構(gòu)造。但被檢物體為非均質(zhì)時(shí)，并大于1／2波長，那么各級(jí)衍射光線同時(shí)進(jìn)入物鏡，在某種程度上可察看物體的構(gòu)造。普通暗視野顯微鏡雖看不清物體的細(xì)微構(gòu)造，但卻可分辨0.004um以上的微粒的存在和運(yùn)動(dòng)，這是普通顯微鏡(最大的分辨力為0.2um)所不具有的特性，可用以察看活細(xì)胞的構(gòu)造和細(xì)胞內(nèi)微粒的運(yùn)動(dòng)等。1.4運(yùn)用：微小粒子、細(xì)菌形狀、細(xì)菌記數(shù)，透明標(biāo)本察看等。1.5暗場(chǎng)顯微鏡的要求要求載玻片和蓋玻片必需無疵痕和灰塵物鏡前透鏡必需清潔無塵載玻片和蓋玻片厚度必需絕對(duì)符合要求1.6暗場(chǎng)察看方式調(diào)理(1)換上暗場(chǎng)聚光鏡〔枯燥系或油浸系〕并在聚光鏡透鏡上外表滴上鏡頭油。向上緩慢調(diào)升聚光鏡，使鏡頭油與載玻片底面相接觸后。(2)將視場(chǎng)光闌適當(dāng)減少，用10X物鏡找到被檢物體，同時(shí)在視場(chǎng)中看到視場(chǎng)光圈的輪廓象。上下緩慢調(diào)整聚光鏡，使視場(chǎng)光圈像明晰可見。(3)視場(chǎng)光圈如不在視野中央，可利用聚光鏡外側(cè)兩個(gè)調(diào)理螺絲進(jìn)展調(diào)整，再將其開大到相應(yīng)位置。2相差顯微鏡2.1原理光波有振幅〔亮度〕、波長〔顏色〕及相位(指在某一時(shí)間上光的動(dòng)搖所能到達(dá)的位置)的不同。當(dāng)光經(jīng)過物體時(shí)，如波長和振幅發(fā)生變化，人們的眼睛才干察看到，這就是普通顯微鏡下可以察看到染色標(biāo)本的道理。而活細(xì)胞和未經(jīng)染色的生物標(biāo)本，因細(xì)胞各部微細(xì)構(gòu)造的折射率和厚度略有不同，光波經(jīng)過時(shí)，波長和振幅并不發(fā)生變化，僅相位有變化(相應(yīng)發(fā)生的差別即相位差)，而這種微小的變化，人眼是無法加以鑒別的，故在普通顯微鏡下難以察看到。相差顯微鏡可以改動(dòng)直射光或衍射光的相位，并且利用光的衍射和干涉景象，把相位差變成振幅差(明暗差)，同時(shí)它還吸收部分直射光線，以增大其明暗的反差。因此可用以察看活細(xì)胞或未染色標(biāo)本。2.2構(gòu)造特點(diǎn)相差顯微鏡與普通顯微鏡的主要不同之處是：用環(huán)狀光闌替代可變光闌，用帶相位板的物鏡(通常標(biāo)有PH的標(biāo)志)替代普通物鏡，并帶有一個(gè)合軸調(diào)理用的望遠(yuǎn)鏡。環(huán)狀光闌是由大小不同的環(huán)狀孔構(gòu)成的光闌，它們的直徑和孔寬是與不同的物鏡相匹配的。相位板安裝在物鏡的后焦面處，相板裝有吸收光線的吸收膜和推遲相位的相位膜。它除能推遲直射光線或衍射光的相位以外，還有吸收光使亮度發(fā)生變化的作用。調(diào)軸望遠(yuǎn)鏡是用來進(jìn)展合鈾調(diào)理的。相差顯微鏡在運(yùn)用時(shí)，聚光鏡下面環(huán)狀光闌的中心與物鏡光軸要完全在不斷線上，必需調(diào)理光闌的亮環(huán)和相板的環(huán)狀圈重合〔共軛重合〕，才干發(fā)揚(yáng)相差顯微鏡的效能。否那么直射光或衍射光的光路紊亂，應(yīng)被吸收的光不能吸收，該推遲相位的光波不能推遲，就失去了相差顯微鏡的作用。2.3運(yùn)用方法〔1〕相差安裝的互換安裝卸下普通顯微鏡運(yùn)用的聚光器，將環(huán)狀光闌裝在聚光器支架上，把綠色濾光片放在上面，它可吸收紅色和藍(lán)色光，使波長范圍小的單色光線進(jìn)展照明，并有吸熱作用，能使相差察看獲得良好的效果。再從轉(zhuǎn)換器上旋下普通物鏡，換上相差物鏡?！?〕調(diào)焦翻開光源，旋轉(zhuǎn)集光器轉(zhuǎn)盤，將“0〞對(duì)準(zhǔn)標(biāo)示孔，使普通聚光器部分進(jìn)入光路。先運(yùn)用低倍相差物鏡，按普通顯微鏡操作方法進(jìn)展對(duì)光和調(diào)焦。旋轉(zhuǎn)環(huán)狀光闌，使光闌的直徑和孔寬與所運(yùn)用的相差物鏡相順應(yīng)，如相差物鏡為40X時(shí)運(yùn)用40X標(biāo)示孔的光闌?！?〕合鈾調(diào)整拔出目鏡，插入合鈾望遠(yuǎn)鏡，一邊從望遠(yuǎn)鏡向內(nèi)察看，并用左手固定其外筒；一邊用右手轉(zhuǎn)動(dòng)望遠(yuǎn)鏡內(nèi)筒使其上升，當(dāng)對(duì)準(zhǔn)焦點(diǎn)就能看到環(huán)狀光闌的亮環(huán)和相板的暗環(huán)，此時(shí)可將望遠(yuǎn)鏡固定住。再升降集光器并調(diào)理其下的螺旋使亮環(huán)的大小與暗環(huán)一致，然后左右前后調(diào)理環(huán)狀光闌聚光器上的調(diào)理鈕，使兩環(huán)完全重合?！?〕察看換回目鏡，按常規(guī)要領(lǐng)進(jìn)展察看。在改換不同倍率的相差物鏡時(shí)，每一次都要運(yùn)用相匹配的環(huán)狀光闌。2.4用途用于察看組織培育中活細(xì)胞形狀構(gòu)造?；罴?xì)胞無色透明，普通光鏡下不易分辨細(xì)胞輪廓及其構(gòu)造，組織培育研討常用的是倒置相差顯微鏡。偏光顯微鏡根據(jù)動(dòng)搖光學(xué)原理察看和精細(xì)測(cè)定標(biāo)本細(xì)節(jié),或透明物體改動(dòng)光束的物理參數(shù),以此判別物質(zhì)構(gòu)造的一種顯微鏡分辨率可達(dá)0.04微米將普通光改動(dòng)為偏振光進(jìn)展鏡檢,以鑒別某一物質(zhì)具有單折射性(各向同性)或雙折射性(各向異性)一、偏振光與自然光1.橫波的偏振性光矢量的振動(dòng)方向總與光的傳播方向垂直，在垂直于光傳播方向的平面內(nèi),可有不同的振動(dòng)方向。v0HE只需橫波才有偏振景象2.線偏振光--光矢量只在某一固定的方向上振動(dòng)。E播傳方向振動(dòng)面3.自然光—普通光源發(fā)出的光,在垂直于傳播方向的平面上,一切能夠方向的光矢量E的振幅都相等。二、起偏和檢偏起偏：使自然光〔或非線偏振光〕變成線偏振光的過程。檢偏：檢查入射光的偏振性的過程。雙折射景象：一束光射入各向異性晶體后有兩束折射光的景象。尼科耳棱鏡。在生物樣品中，肌肉纖維、骨骼和牙齒等具有各向異性，淀粉粒、染色體和紡錘體等具有雙折射性，因此被用于組織細(xì)胞的化學(xué)研討。尋常光線(o光):遵守折射定律。對(duì)于晶體一切方向都具有一樣的折射率，且在入射面內(nèi)傳播。非常光線(e光):不遵守折射定律。它的折射率隨方向而變化，并且不一定在入射面內(nèi)傳播。o光和e光都是線偏振光,且振動(dòng)方向相互垂直二向色性：某些晶體〔電氣石、硫酸金雞鈉堿晶體等〕對(duì)光振動(dòng)有劇烈的選擇性吸收才干，這種性質(zhì)稱為二向色性。如電氣石晶體對(duì)自然光的某一振動(dòng)方向上的光振動(dòng)幾乎完全吸收，而垂直于該方向的光振動(dòng)只略微減弱后經(jīng)過。旋光景象：線偏振光經(jīng)過某些透明介質(zhì)后，它的光振動(dòng)方向?qū)⒗@著光的傳播方向旋轉(zhuǎn)某一角度的景象，稱為旋光景象。這種介質(zhì)稱為旋光物質(zhì)。如石英、糖、酒石酸鉀鈉等。偏振光經(jīng)過旋轉(zhuǎn)的檢偏器后光強(qiáng)發(fā)生變化.起偏器檢偏器自然光線偏振光....偏振光經(jīng)過旋轉(zhuǎn)的檢偏器后光強(qiáng)發(fā)生變化.起偏器檢偏器自然光線偏振光....偏振光經(jīng)過旋轉(zhuǎn)的檢偏器后光強(qiáng)發(fā)生變化.起偏器檢偏器自然光線偏振光....偏振光經(jīng)過旋轉(zhuǎn)的檢偏器后光強(qiáng)發(fā)生變化.起偏器檢偏器自然光線偏振光....尼科爾棱鏡用途用于研討組織晶體物質(zhì)及纖維等的光學(xué)性質(zhì)微分干涉顯微鏡無色透明活體標(biāo)本的細(xì)微構(gòu)造圖象呈浮雕狀的立體感察看效果更加逼真1原理經(jīng)過特制的棱鏡將偏振光分解相互垂直，強(qiáng)度相等的光束，光束載極近的兩點(diǎn)〔小于顯微鏡的分辨率〕上經(jīng)過被檢物體，從而在相位上略有差別，使圖象呈現(xiàn)出立體三維覺得。2特點(diǎn)可以使被檢物體產(chǎn)生三維立體覺得察看效果更直觀無須特殊物鏡，與熒光察看配合更好可以調(diào)理背景和物體的顏色變化而到達(dá)理想的效果。三、熒光顯微鏡一、原理熒光顯微鏡是利用一個(gè)高發(fā)光效率的點(diǎn)光源，經(jīng)過濾色系統(tǒng)發(fā)出一定波長的光(如紫外光3650入或紫藍(lán)光4200入)作為激發(fā)光、激發(fā)標(biāo)本內(nèi)的熒光物質(zhì)發(fā)射出各種不同顏色的熒光后，再經(jīng)過物鏡和目鏡的放大進(jìn)展察看。這樣在劇烈的對(duì)襯背景下，即使熒光很微弱也易識(shí)別，敏感性高，主要用于細(xì)胞構(gòu)造和功能以及化學(xué)成分等的研討。熒光顯微鏡的根本構(gòu)造是由普通光學(xué)顯微鏡加上一些附件(如熒光光源、激發(fā)濾片、雙色束分別器和阻斷濾片等)的根底上組成的。什么是熒光：物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能形狀轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣苄螤?，再回到低能形狀時(shí)釋放出的光，是非溫度輻射光——冷光。即：物質(zhì)吸收短波光，發(fā)射出的長波光。顯微鏡熒光利用光源激發(fā)——光化熒光熒光的種類：自發(fā)熒光〔固有熒光〕二次熒光熒光的性質(zhì)：吸收光，必需有激發(fā)光源熒光波長＞激發(fā)波長〔損失熱能〕熒光強(qiáng)度極小于激發(fā)光的強(qiáng)度有不同程度的衰減熒光強(qiáng)度取決于激發(fā)光強(qiáng)度、被檢物濃度、熒光效率二、熒光顯微鏡的種類：透射式落射式三、熒光顯微鏡主要部件透射式汞燈光源激發(fā)濾色鏡吸收濾色鏡暗場(chǎng)聚光鏡落射式汞燈光源激發(fā)濾色鏡分色鏡吸收濾色鏡熒光顯微鏡內(nèi)部構(gòu)造落射熒光顯微鏡光路圖透射熒光顯微鏡光路圖WUWIBDUALBANDWIBAWIGWIBDAPI+FITCFITC+PI雙重染色標(biāo)本的單色和雙色察看熒光光源普通采用超高壓汞燈(50一200W)，它可發(fā)出各種波長的光，但每種熒光物質(zhì)都有一個(gè)產(chǎn)生最強(qiáng)熒光的激發(fā)光波長，所以需加用激發(fā)濾片〔普通有紫外、紫色、藍(lán)色和綠色激發(fā)濾片〕，僅使一定波長的激發(fā)光透過照射到標(biāo)本上，而將其他光都吸收掉。每種物質(zhì)被激發(fā)光照射后，在極短時(shí)間內(nèi)發(fā)射出較照射波長更長的可見熒光。熒光具有專注性，普通都比激發(fā)光弱，為能察看到專注的熒光，在物鏡后面需加阻斷濾光片。它的作用有二：一是吸收和阻撓激發(fā)光進(jìn)入目鏡、以免干擾熒光和損傷眼睛。二是選擇并讓特異的熒光透過，表現(xiàn)出專注的熒光顏色。兩種濾光片必需選擇配合運(yùn)用。四、運(yùn)用方法．1．翻開燈源，超高壓汞燈要預(yù)熱幾分鐘才干到達(dá)最亮點(diǎn)。2．透射式熒光顯微鏡需在燈源與聚光器之間裝上所要求的激發(fā)濾片，在物鏡的后面裝上相應(yīng)的阻斷濾片。落射式熒光顯微鏡需在光路的插槽中插入所要求的激發(fā)濾片／雙色束分別器／阻斷濾片的插塊。3．放置標(biāo)本片，調(diào)焦后即可察看。運(yùn)用中應(yīng)留意：末裝濾光片不要用眼直接察看，以免引起眼的損傷；4．高壓汞燈封鎖后不能立刻重新翻開，需經(jīng)5分鐘后才干再啟動(dòng)，否那么會(huì)不穩(wěn)定，影響汞燈壽命。五、用途1察看標(biāo)本中的自發(fā)熒光物質(zhì)或以熒光素染色或標(biāo)志的細(xì)胞和構(gòu)造2標(biāo)本中的熒光物質(zhì)在紫外線激發(fā)下產(chǎn)生各種顏色的熒光，借以研討該熒光物質(zhì)在細(xì)胞和組織內(nèi)的分布。組織中的自發(fā)性熒光物質(zhì)如神經(jīng)細(xì)胞和心肌細(xì)胞等內(nèi)的脂褐素呈棕黃色熒光，肝貯脂細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞內(nèi)的維生素A呈綠色熒光，某些神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞和神經(jīng)纖維內(nèi)的單胺類物質(zhì)〔兒茶酚胺、5－羥色胺、組胺等〕在甲醛作用下呈不同顏色的熒光，組織內(nèi)含有的奎寧、四環(huán)素等藥物也呈現(xiàn)一定的熒光。3細(xì)胞內(nèi)的某些成分可與熒光素結(jié)合而顯熒光，如溴化乙錠與吖啶橙可與DNA綜合，進(jìn)展細(xì)胞內(nèi)DNA含量測(cè)定。4熒光顯微鏡更廣泛用于免疫細(xì)胞化學(xué)研討，即以異硫氰酸或羅丹明等熒光素標(biāo)志抗體〔一抗或二抗〕，用該標(biāo)志抗體直接或間接地與細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原結(jié)合，以檢測(cè)該抗原的存在與分布。激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)任務(wù)原理：激光掃描顯微鏡是建立在光學(xué)顯微鏡及各種掃描顯微鏡根底上的一種新型的掃描成象系統(tǒng)。利用聚焦的激光束在樣品外表掃描，同時(shí)利用光電檢測(cè)器件接納樣品反射光〔或透射光〕，樣品構(gòu)造的變化使反射光〔或透射光〕強(qiáng)度改動(dòng)，因此使光電檢測(cè)器的輸出電流改動(dòng)，經(jīng)信號(hào)處置，同步顯示在計(jì)算機(jī)屏幕上。共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別1.抑制圖像的模糊，獲得明晰的圖像2.具有更高的軸向分辨率，并可獲取延續(xù)光學(xué)切片3.添加側(cè)