成纖維細(xì)胞分離方法

胰酶消化法1一、 取得小鼠胚胎性成熟母小鼠與種公鼠按1公（3）：2母（早）比例合籠。每天早上觀察母小鼠陰道口。有乳白色或蛋黃色凍膠狀物（陰道栓）即確定為懷孕。見栓當(dāng)天上午定為懷孕的0.5d。取懷孕12.5?14.5d母鼠，斷頸處死，無菌條件下暴露子宮用鑷子提起近子宮頸端，分離子宮系膜，剪斷子宮角。取出整個(gè)子宮，置于有PBS的平皿內(nèi)。用PBS洗滌三次，棄除表面殘余血跡。沿子宮系膜側(cè)剪開子宮，取出帶有胎膜的胚胎，置于另一盛有PBS的平皿內(nèi)，充分洗滌，棄除表面紅細(xì)胞。用小鑷子撕破胎膜，取出胎鼠，棄除胎膜，用PBS洗滌三次。去除胚胎頭部、內(nèi)臟和四肢，將軀干部置于另一盛有PBS的平皿內(nèi)，用PBS至少洗滌三次，充分棄除紅細(xì)胞。二、 取得小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）用無菌眼科小剪刀或刮胡刀片將鼠胚軀干剪（切）成1mm3以下的碎塊，吸置于離心管內(nèi)。加適量胰酶，將離心管置于培養(yǎng)箱中10-20分鐘取出離心管，反復(fù)吹打，加足量培養(yǎng)液終止消化。離心1000轉(zhuǎn)，5分鐘。棄掉上清，加適量培養(yǎng)液，反復(fù)吹打20次。分裝到T75中，一般每2個(gè)胚胎可以制成一個(gè)T75的原代細(xì)胞。置37°C、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞長3-7天細(xì)胞互相重疊爬滿整個(gè)培養(yǎng)瓶底時(shí)即可1：3-1：6傳代。吸棄培養(yǎng)液上清。PBS（不含鈣鎂）沖洗兩次。加0.125%胰酶-0.02EDT消化。在顯微鏡下觀察，當(dāng)少量細(xì)胞漂浮，貼壁的細(xì)胞層出現(xiàn)裂隙時(shí)，用移液管吹打沖洗瓶底5-6次。即刻加MEF培養(yǎng)液終止消化。1000轉(zhuǎn)，5分鐘離心。吸棄上清。加足培養(yǎng)液，吹打制成單細(xì)胞懸液，分裝到各T75中。完成傳代。原代細(xì)胞中還有少量組織塊未被充分消化，在以后的每次傳代過程中要盡量制成單細(xì)胞懸液，組織塊會逐漸消失。原代細(xì)胞中混有一些雜細(xì)胞，一般傳到第3代時(shí)，雜細(xì)胞逐漸減少。小鼠胚胎成纖維細(xì)胞為梭狀；但連成片時(shí)，細(xì)胞互相交聯(lián)，形態(tài)不典型。最多不超過六代。三、 MEF的凍存當(dāng)細(xì)胞90%-100%融合時(shí)，尤其細(xì)胞少量堆聚可冷凍。處理方法同二的9-14，每75cm2的細(xì)胞加3ml凍存液重懸細(xì)胞。每個(gè)凍存管編號加1ml細(xì)胞懸液。置入程序降溫盒-80C過夜，放入液氮長期保存。四、滅活MEF制備飼養(yǎng)層細(xì)胞取新的培養(yǎng)瓶，加0.1%Gelatin溶液覆蓋預(yù)處理30分鐘，用前吸掉Gelatin溶液。取需要處理的MEF細(xì)胞，以10ug/ml濃度加絲裂霉素(MitomycinC)混勻。置培養(yǎng)箱中3小時(shí)。吸棄廢液。用DPBS洗5遍。處理方法同二11-14。處理過的MEF加適量培養(yǎng)液重懸計(jì)數(shù)，以3.0x104/cm2(MEF)鋪在Gelatin處理過的培養(yǎng)瓶上置培養(yǎng)箱中靜置過夜，使其貼壁。鋪好的飼養(yǎng)層在1-7天內(nèi)有效，都可以支持mES生長并維持其全能性胰酶消化法2一、 實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備動物孕期14至16天的孕鼠(小鼠)。最佳時(shí)間為E13.5d.(細(xì)胞增值能力比較快)試劑無Ca2+和Mg2+的PBS(D-PBS)、0.125%胰酶、0.53mmol/LEDTA溶液、MEF生長培養(yǎng)基(高糖DMEM加15%FBS)器械眼科直剪3把、眼科直鑷3把、眼科彎鑷2把、玻璃平皿3套、200目尼龍濾網(wǎng)、50ml和15ml離心管和手術(shù)刀片。以上物品均需要高壓滅菌消毒處理。二、 具體操作處死孕鼠，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超凈臺中用剪刀和鑷子將孕鼠皮膚剪開，用另外一組剪刀、鑷子剪開腹部肌層，露出子宮，最后用第三組剪刀和鑷子將子宮小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中，沖洗去血。用兩把彎鑷子將胚胎外的胞膜小心去除，然后夾掉頭和內(nèi)臟，將其余胚胎轉(zhuǎn)移到一個(gè)裝有30mlD-PBS的50ml離心管中，輕輕顛倒兩次，倒掉D-PBS，再重復(fù)此步驟一次，注意要留少許D-PBS，然后將胚胎轉(zhuǎn)移到另一裝有D-PBS的平皿中，并用手術(shù)刀片將其細(xì)細(xì)切碎。用200〃的移液槍反復(fù)、快速地吹打平皿中的液體，轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，于4°C1500rpm離心5分鐘，倒掉上清，以10ml胰酶重懸沉淀，放在37°C水浴中消化30分鐘，且每隔五分鐘輕輕晃動，使之充分消化。將上層細(xì)胞懸液倒入一個(gè)裝有10mlMEF生長培養(yǎng)基的50ml離心管中，用200目的尼龍網(wǎng)過濾后，以1500rpm離心5分鐘收集細(xì)胞，再用30mlMEF生長培養(yǎng)基洗滌兩次。細(xì)胞沉淀用15mlMEF生長培養(yǎng)基重懸后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)（一般8只14天的胎鼠可獲得2-3x107細(xì)胞）。3x106細(xì)胞懸浮于15mlMEF生長培養(yǎng)基中，接種到200ml培養(yǎng)瓶中。24小時(shí)后更換新鮮的MEF生長培養(yǎng)基。細(xì)胞長滿后，先用D-PBS沖洗，倒掉后加胰酶消化（此步時(shí)間不宜過長，作者一般不超過五分鐘），按1:5傳代。細(xì)胞再次長到覆蓋率80-9