宏基因組學中的酶資源挖掘及其催化性能改良策略

/北京化工大學課程論文題目宏基因組學中的酶資源挖掘及其催化性能改良策略姓名王澳克班級生研1505日期:2015年12月10日論文正文課程心得附錄1：中文PPT附錄2：英文PPT宏基因組學中的酶資源挖掘及其催化性能改良策略摘要：酶催化在食品、醫(yī)藥、化工、能源等領域發(fā)揮重要作用。開發(fā)新型微生物酶資源，對酶進行修飾改良，是酶催化領域的重要研發(fā)內容。極端微生物和不可培養(yǎng)微生物酶的發(fā)掘是獲取新型工業(yè)催化劑的熱點；體外定向進化、雜合酶、表面展示等蛋白質工程等分子生物學技術手段為開發(fā)特定性質“新酶”提供了有力工具；生物印跡、pH記憶、定向固定化、交聯(lián)酶晶體、脂質體包埋等高效物理化學修飾方法拓寬了酶原有的催化性質。微生物酶資源挖掘及其改良將推動酶的生物催化產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展。關鍵詞：酶；宏基因組；定向進化；生物印跡微生物蘊藏著大量具有工業(yè)應用潛力的生物催化劑。然而，傳統(tǒng)培養(yǎng)方法只能從環(huán)境中獲得不到1%的微生物。作為生物催化劑的微生物酶，由于其高度的化學底物選擇性、區(qū)域選擇性、對映體選擇性1]，能高效完成天然和非天然底物的專一性催化反應；在得到高品質產(chǎn)品的同時，對環(huán)境友好，有著傳統(tǒng)化學催化劑不可比擬的優(yōu)勢，因而是“綠色化學”倡導的優(yōu)良工業(yè)催化劑。以高附加值手性化合物為代表的生物催化已成為各大生物技術公司和化學公司競相研發(fā)的熱點[2]。開發(fā)高活性、高選擇性和高穩(wěn)定性的酶，是實現(xiàn)綠色化工，合成重要化工和醫(yī)藥產(chǎn)品的重要保障。自然界中尚未充分發(fā)掘的微生物資源為新型酶的獲得提供了寶貴的酶源，發(fā)掘潛在的微生物及其基因資源是當前的重要方向，是生物催化的重要基礎；運用生物學、物理化學方法對現(xiàn)有酶進行修飾改造，獲得優(yōu)異性能的工業(yè)催化用酶，是生物催化的關鍵。宏基因組學是通過提取某一特定環(huán)境中的所有微生物基因組DNA、構建基因組文庫并對文庫進行篩選，尋找和發(fā)現(xiàn)新的功能基因的一種方法。它繞過了微生物分離培養(yǎng)過程，成為研究環(huán)境樣品中不可培養(yǎng)微生物的有力手段。1宏基因組學宏基因組學起源于上世紀70年代土壤微生物基因組DNA的研究，近年來研究者們已利用宏基因組文庫技術從不同環(huán)境樣品中篩選到了脂肪酶/酯酶、淀粉酶、木聚糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶等多種具有工業(yè)應用潛力的生物催化劑。隨著宏基因組學在挖掘新型生物催化劑中的廣泛使用，我們進入了宏基因組學挖掘生物催化劑的時代[3]。1.1宏基因組文庫的樣品來源目前，宏基因組學研究的樣品主要來源于土壤環(huán)境和海洋環(huán)境。這是因為土壤具有微生物進行生長繁殖和生命活動所需的各種條件，是微生物生活的最適宜環(huán)境。據(jù)估計，每克土壤中含有高達10000種不同的微生物[4]，這表明土壤微生物宏基因組是一個巨大的基因資源庫，對它們的挖掘能夠獲得大量的生物酶制劑；而海洋環(huán)境在壓力、鹽分、溫度和營養(yǎng)成分上的極端變化賦予了海洋微生物在物種資源、基因功能和生態(tài)功能上無與倫比的生物多樣性。為了獲得性能更加多樣的生物催化劑，研究者們需要廣泛地采集環(huán)境樣品，特別是一些極端環(huán)境中的樣品。1.2宏基因組DNA的提取宏基因組DNA的提取是構建宏基因組文庫的關鍵步驟，因為環(huán)境樣品總DNA的濃度、純度、片段大小和偏好性等因素將直接影響宏基因組文庫的質量和代表性。DNA提取方法大體可分為兩類：直接提取法和間接提取法。直接提取法，又稱原位裂解法，這類方法是通過物理法、化學法或酶解法直接裂解環(huán)境樣品中微生物的細胞壁來提取DNA并加以純化。目前常用的裂解方法中，物理法有反復凍融法、超聲法、玻璃珠擊打法、液氮碾磨法等；化學法所采用的化學試劑有表面活性劑（如SDS）、鹽類、有機溶劑等；酶解法則主要采用溶菌酶和蛋白酶。不同裂解法的差別在于細胞破壁的方式不同。直接提取法無需對環(huán)境樣品中的微生物進行復蘇處理，操作簡便，且樣品中的微生物能夠被裂解得比較完全，故DNA提取得率高，所獲得的基因組DNA能較好地反映樣品中微生物種群的多樣性。但由于操作過程中機械剪切力大，導致所獲得的DNA片段較?。?~50kb），且多為平端；此外，由于提取的基因組DNA中混有金屬離子、腐殖酸、多糖、多酚化合物等雜質，純度較低，往往還需要經(jīng)過純化處理才能滿足后續(xù)分子生物學操作（如DNA酶切、PCR擴增）的需要。該法提取的DNA主要適用于以質?；颚耸删w為載體的小片段文庫的構建。間接提取法，又稱異位裂解法，是利用梯度離心或者差速離心等方法先把微生物從環(huán)境樣品中分離出來，然后再用比較溫和的方法提取基因組DNA。該方法受土壤中雜質的污染較小，提取條件比較溫和，所獲得的DNA純度較高，片段大（20~500kb），適合于構建以柯斯粘粒（Cosmid）和細菌人工染色體（Bacterialartificialchromosome，BAC）為載體的大片段文庫；但該方法操作繁瑣，前分離過程會造成部分微生物細胞的丟失，加上溫和條件下細胞壁較厚的微生物不易被裂解，因此所獲得的DNA中基因組信息的廣泛性不及原位裂解法，得率只有原位裂解法的1％~10％。隨著宏基因組學的發(fā)展，許多新的DNA提取技術不斷被提出，使得人們可以從各種各樣的環(huán)境樣品中獲得高質量的總DNA。然而，并沒有一種標準的或通用的環(huán)境DNA提取方法。任何DNA提取方法都存在一定的偏好性，導致選擇性地富集某些微生物的DNA，同時選擇性地遺漏某些微生物的DNA，從而影響所提取的DNA的種群覆蓋率。在實際應用中，應根據(jù)所研究生境的特性和研究目的進行選擇和優(yōu)化。1.3宏基因組文庫的構建1.3.1載體的選擇載體在宏基因組技術中具有重要地位，常用載體有質粒（Plasmid）、細菌人工染色體（BAC）、柯斯粘粒（Cosmid）、福斯黏粒（Fosmid）等。載體的選擇應考慮以下因素：研究目的、所提取的環(huán)境總DNA的質量、欲插入目的片段的最大長度、所需要的載體拷貝數(shù)、欲采用的宿主以及篩選策略[5][6]。1.3.2宿主的選擇宿主的選擇應考慮以下因素：所選擇的載體類型，宿主的轉化效率、重組載體在宿主細胞中的穩(wěn)定性、宿主能否為相關功能基因提供必需的轉錄表達體系、對異源表達基因產(chǎn)物是否有較強的相容性、以及目標性狀（如抗菌性）缺陷型等。目前，構建用于篩選新酶的宏基因組文庫時，最常用的宿主為大腸桿菌E.coli。1.4目標克隆的篩選由于環(huán)境樣品中微生物種類眾多，文庫容量龐大，如何有效得到目標克隆，是研究者們必須解決的一個難題。目前，從宏基因組文庫中篩選新型生物催化劑的策略可分為3種：基于活性的篩選，基于序列的篩選和底物誘導的篩選。2酶資源挖掘2.1極端微生物酶極端微生物及其產(chǎn)生的酶類不僅為生物科學提供基礎研究素材[5]，而且對苛刻條件下的工業(yè)生物催化過程有積極的實踐意義。由于極端微生物培養(yǎng)條件苛刻，可以采用重組DNA技術在常規(guī)宿主中表達極端酶，從而避開極端菌的直接培養(yǎng)。嗜熱耐堿的酶T1在以pGEX為載體，以EscherichiacoliBL21(De3)為宿主的原核表達系統(tǒng)中得以可溶性表達[6]。通過酶GST標簽的親和層析純化得到純酶。其最適溫度70℃，最適pH9.0。在65℃以下很穩(wěn)定，在pH9.0時半衰期為5.25h。該酶可應用到食品工業(yè)中脂肪酸的生產(chǎn)，因為棕櫚油和牛脂等在常溫下為固態(tài)，只有在較高的溫度下才能呈液態(tài)，發(fā)生反應；而常規(guī)微生物酶在較高的溫度下易失活。2.2不可培養(yǎng)微生物酶特定生境中只有一小部分微生物可用實驗方法分離培養(yǎng)，占絕大多數(shù)的不可培養(yǎng)微生物(unculturedmicroorganism)是地球上尚未開發(fā)的巨大資源[7]。宏基因組(metagenome)技術繞過純培養(yǎng)步驟，直接從生境樣品中獲取遺傳信息，提供更加全面的基因資源，從而有效地提高了新酶的篩選效率。采用宏基因組技術篩選酶有兩種途徑-功能篩選和序列篩選。功能篩選途徑即把來源于不可培養(yǎng)微生物的DNA克隆到大腸桿菌質粒中，構建宏基因組文庫，然后基于酶活性篩選獲得微生物酶基因。序列篩選途徑以酶三聯(lián)體活性中心(Ser-Asp-His)和氧陰離子洞(oxyanionhole)區(qū)的保守序列設計引物，以環(huán)境基因組DNA為模板，擴增酶基因片段，然后用基因組步查(genomic-walking)的方法克隆出全長酶基因。3酶催化性能改良策略3.1定向進化酶對酶分子的改造，一是基于序列的合理化設計方案(sequentialrationdesign)，如化學修飾、定點突變(site-directedmutagenesis)等；二是利用基因的可操作性，模擬自然界進化過程的非合理設計方案(irrationaldesign)，如定向進化(directedevolution)、雜合進化(hybriddevolution)等[8]。酶分子的定向進化無需了解酶的結構功能和催化機制等方面的信息，人為地創(chuàng)造特殊的進化條件，模擬自然進化機制（隨機突變、基因重組和自然選擇），在體外改造酶基因，并定向篩選出所需性質的突變酶。酶的定向進化即是通過基因突變、基因表達和高通量篩選技術獲得預期性質的突變酶，如提高酶活力、提高穩(wěn)定性、提高底物專一性和提高對映體選擇性等。酶的定向進化尤以提高對映體選擇性研究得最多。3.2雜合酶雜合酶是指把來自不同酶分子中的結構單元或使整個分子進行組合和交換，產(chǎn)生酶雜合體，以改進或創(chuàng)造酶的某種功能[9]。雜合酶的構建也為酶的結構與功能之間的關系研究提供了模型。通過定向組合，將白地霉酶ⅠN末端序列和白地霉酶ⅡC末端序列在不同的位點融合，構建一系列雜合酶。以三油酸甘油酯和三辛酸甘油酯作為模式底物，對雜合酶的底物特異性酶活力進行測定，確定酶分子上影響底物結合和催化的序列。研究結果表明決定白地霉酶Ⅰ對油酸甘油酯特異性的序列位為349~406的58個氨基酸。該區(qū)段氨基酸的置換顯著地改變了對短鏈脂肪酸底物（三辛酸甘油酯）的活力。同時，最終優(yōu)化的雜合酶選擇性水解外消旋癸酸甲酯的對映選擇率比天然的酶Ⅰ和Ⅱ都要高。利用進化手段較容易構建出高度多樣性的突變基因庫，酶的有利功能突變體常被埋沒在眾多的中性突變和不利突變群中，因此建立高效的、有針對性的高通量篩選體系是定向（雜合）進化最具挑戰(zhàn)性的內容。3.3表面展示酶表面展示技術借助錨定載體，將外源蛋白以融合蛋白的形式展示在噬菌體、細菌或酵母的表面，使其保持相對獨立的空間構象和原有的生物活性[10]。不同酶的底物特異性不一樣。利用共展示技術，在同一宿主上同時展示兩種酶，可以擴大其催化的底物譜，更好地發(fā)揮其生物催化作用。Kobayashi等[11]以CWB(cellwall-bindingdomain)為錨定蛋白，在B.subtdis宿主上同時展示了B.subtdis酶B。以INP蛋白(ice-nucleationprotein)為錨定蛋白，通過INP–TliA融合蛋白的方式在大腸桿菌表面成功展示了嗜熱酶(TliA)。該展示的新型“固定化”酶，可高效催化非水相體系中橄欖油的水解反應。表面（共）展示技術開辟了表面催化劑的新領地，是未來重點發(fā)展的催化劑，其瓶頸在于高效、兼容性好的錨定載體的篩選。高效載體的開發(fā)必將推動表面催化工程快速發(fā)展。3.4生物印跡酶根據(jù)酶在有機溶劑中具有“剛性”結構的特點，利用酶與印跡分子的相互作用，誘導、改變酶的構象，制備具有結合該印跡分子及其類似物能力的“新酶”，是修飾改造酶的一種方法。水溶性酶在通常狀況下，活性位點被“蓋子”結構覆蓋，呈非活性狀態(tài)。當?shù)孜锛捌漕愃莆锝閷У挠退缑娈a(chǎn)生時，蓋子打開，呈活性狀態(tài)。為了獲得高效非水相酶，選擇適當兩親性的表面活性劑或底物類似物作為印跡分子，待印跡分子與酶充分印跡接觸后，將印跡分子-酶復合物冷凍干燥，用非水溶劑洗脫印跡分子，形成了活性中心開啟的印跡酶，并且這種狀態(tài)在有機溶劑的剛性環(huán)境里仍能維持。選擇不同結構的印跡分子誘導，會產(chǎn)生結合部位構象不同的印跡酶，適應不同的底物，從而催化活力比非印跡酶顯著提高。印跡酶的催化活力依賴于酶類別、有機溶劑和印跡分子本身。3.5pH記憶酶有機溶劑中酶分子表面的必需水只有在特定的pH和離子強度下，才能使酶分子活性中心周圍的基團處于最佳的離子化狀態(tài)，從而有利于酶活性的表現(xiàn)。所以有機溶劑中的酶活力與酶冷凍干燥或有機溶劑沉淀前所在的緩沖掖的pH和離子強度密切相關，其最適pH與水相中酶的最適pH是一致的。當酶分子從水溶液轉移到有機溶劑中時，它保持了原有的離子化狀態(tài)。利用酶的pH記憶特性可以提高有機相中酶催化活力。對于生物印跡、pH記憶修飾型酶，不夠透徹的“印跡”和“記憶”分子機理及其僅能在有機溶劑中起催化作用制約了其進一步的發(fā)展與應用。因此闡明酶分子構象誘導的細微變化與酶催化活性的關系，研究不同印跡分子對酶活性的影響，開發(fā)以水不溶性底物為代表的新型印跡分子，突破印跡酶、記憶酶僅在有機介質中起催化活性作用的局限，進而開發(fā)水相印跡酶、記憶酶，是大勢所趨。3.6脂質體包埋酶酶粉雖然在非水介質中能夠催化反應，但是其催化效率比水溶液中的酶低幾個數(shù)量級，其中原因之一是酶一般難溶于有機溶劑。雖然有些酶能直接溶解在少數(shù)有機溶劑中．但是酶催化效率常常很低。雙親分子共價或非共價修飾酶分子表面，可以增加酶表面的疏水性，使酶均一地溶于有機溶劑，提高酶的催化效率。增加水溶性酶在疏水性有機介質中的溶解性可顯著提高酶的催化效率。通過混合酶和脂溶液，收集并冷凍干燥所得沉淀即得脂質體包埋酶。脂質體包埋酶不溶于水溶液但能很好地溶解于有機溶劑，如苯、乙酸乙酯、異辛烷、異丙醚、二甲基亞砜（DMSO）和乙醇等。脂分子親水頭與酶分子親水表面相互作用集結在一起，而脂分子的疏水烴基端延伸到疏水有機溶劑中，增加了酶的溶解性。一個酶分子約可以吸附100~200個脂分子，酶蛋白含量約占8％~10%。經(jīng)脂質體修飾的Pseudomonasfragi酶催化(R,S)-苯乙醇與月桂酸的酯化反應，在2h內能催化R-苯乙醇全部轉化成酯，而S-苯乙醇幾乎不反應。脂質體包埋技術面臨的主要問題是包埋材料的附著穩(wěn)定性[14]。3.7交聯(lián)酶晶體交聯(lián)酶晶體(cross-linkedenzymecrystal,CLES)是固定化酶的延續(xù)和發(fā)展，是一種有發(fā)展?jié)摿Φ墓潭ɑ椒╗15]。酶結晶本身就是一個分離純化和固定化的過程，雙功能交聯(lián)劑戊二醛對酶微晶進行交聯(lián)，酶蛋白既是催化劑又是載體，它提供非常高的酶濃度，不存在傳質阻礙。通常固定化酶中酶含量僅占5%左右，相同質量的交聯(lián)酶晶體的催化活性比一般固定化酶要高很多。高純度的酶晶體催化劑具有超強穩(wěn)定性，可在有機溶劑、氣相、超臨界流體等非常規(guī)介質中表現(xiàn)出高度立體選擇性。3.8定向固定化酶酶的定向固定化技術可以將酶分子表面特定區(qū)域的氨基酸直接或間接(通過某些化學試劑、空間手臂)與載體偶聯(lián)，實現(xiàn)酶分子活性中心背向載體，從而有效地消除對大分子底物結合的空間障礙，提高催化效率[16]。在大多數(shù)情況下，影響酶活性中心的氨基酸殘基在固定化載體上的無序附著導致酶固定化后催化活性部分喪失。定向固定化可使酶蛋白以有序的方式附著于載體表面，減小無序態(tài)造成的酶蛋白結構變形，使酶活力損失降低。定向固定化的核心技術是特異性載體的開發(fā)，篩選與酶活性中心基團親和力低的載體或對載體基團進行定向修飾是該項技術的發(fā)展方向。4結語和展望生物催化劑作為生物催化和轉化的核心，尤其是酶正受到越來越廣泛和深入的研究開發(fā)。一方面，發(fā)掘潛在的微生物及其基因資源，利用基因重組表達和發(fā)酵技術大量制備酶；另一方面，利用蛋白質工程手段、物理和化學方法對現(xiàn)有酶進行修飾改造，以滿足生物催化的要求。嗜極微生物和不可培養(yǎng)微生物的酶，將會在工業(yè)生產(chǎn)中部分替代現(xiàn)有的酶或作為新行業(yè)的催化劑。隨著基因工程、結構生物學和生物信息學的迅猛發(fā)展，利用分子進化等手段獲得最適特性的酶已經(jīng)越來越被重視。作為分子進化的一個分支，酶的定向進化（雜合酶）不僅能使酶進化出單一優(yōu)良的非天然特性，還能使酶的兩個或多個特性疊加，產(chǎn)生具有多項優(yōu)良性能“集成”的新酶，極大地發(fā)展和豐富了生物催化劑來源。新型酶催化劑的獲得應立足于明確的設計思路。參考文獻：[1]WhangsukW,SungkeereeP,ThiengmagS,etal.GenecloningandcharacterizationofanovelhighlyorganicsolventtolerantlipasefromProteussp.SW1anditsapplicationforbiodieselproduction.[J].MolecularBiotechnology,2013,53(1):55-62.[2]JianLK,CasseBDF,HeusslerSP,etal.Industrialapplicationsofmicro/nanofabricationatSingaporeSynchrotronLightSource[C]JournalofPhysics:ConferenceSeries.IOPPublishing,2006:891-896.[3]ZhangR,RenJ,WangY,etal.IsolationandcharacterizationofanovelRhodococcusstrainwithswitchablecarbonylreductaseandpara-acetylphenolhydroxylaseactivities[J].JournalofIndustrialMicrobiology&Biotechnology,2013,40(1):11-20[4]NataliaI,TringeSG,KonstantinosL,etal.Acallforstandardizedclassificationofmetagenomeprojects.[J].EnvironmentalMicrobiology,2010,12(7):1803-1805(3).[5]王輝,李亞莉,蘇丹,等.宏基因組學在普洱茶微生物研究中的應用[J].食品安全質量檢測學報,2015,06期(06):2195-2200.[6]任春光,龍云川,劉曼,等.宏基因組學在微生物學研究中的應用[J].現(xiàn)代園藝,2015,(19).[7]SiddiquiKS,CavicchioliR.Improvedthermalstabilityandactivityinthecold-adaptedlipaseBfromCandidaantarcticafollowingchemicalmodificationwithoxidizedpolysaccharides[J].Extremophiles,2014,9(6):471-476.[8]WahabRA,BasriM,SallehAB,etal.Enzymaticproductionofasolvent-freementhylbutyrateviaresponsesurfacemethodologycatalyzedbyanovelthermostablelipasefromGeobacilluszalihae[J].Biotechnology&BiotechnologicalEquipment,2014,28(6):1065-1072.[9]FelczykowskaA,DydeckaA,BohdanowiczM,etal.Theuseoffosmidmetagenomiclibrariesinpreliminaryscreeningforvariousbiologicalactivities[J].MicrobialCellFactories,2014,13(1):1-7.[10]黃慶慶,吉文匯,杜斌,等.高效廣譜豬鏈球菌7型前噬菌體裂解酶的挖掘及活性研究[J].微生物學通報,2015,42(6).[11]RubinghDN.Proteinengineeringfromabioindustrialpointofview[J].CurrentOpinioninBiotechnology,1997,8(4):417–422.[12]郁惠蕾,馬寶娣,許建和.假單胞菌酯酶的挖掘改造及催化拆分手性羥基酸的研究[C]2015年中國化工學會年會論文集.2015.[13]沈艷.谷氨酸棒桿菌L-天冬氨酸α-脫羧酶催化性能的定點突變分子改造[D].江南大學,2014.[14]LessardMH,VielC,BoyleB,etal.MetatranscriptomeanalysisoffungalstrainsPenicilliumcamembertiandGeotrichumcandidumrevealcheesematrixbreakdownandpotentialdevelopmentofsensorypropertiesof