化妝品毒理學(xué)試驗(yàn)方法樣品前處理通則、急性吸入毒性試驗(yàn)方法、急性吸入毒性試驗(yàn) 急性毒性分類法

附件2化妝品毒理學(xué)試驗(yàn)方法樣品前處理通則GeneralRuleforPretreatmentofCosmeticinToxicologicalExperiments1范圍本規(guī)范規(guī)定了化妝品毒理學(xué)試驗(yàn)樣品前處理的基本原則、要求和方法。本規(guī)范適用于化妝品原料和產(chǎn)品的毒理學(xué)試驗(yàn)檢測。2試驗(yàn)?zāi)康脑诙纠韺W(xué)試驗(yàn)開始之前，首先應(yīng)對樣品進(jìn)行前處理操作，通過樣品前處理可以增加受試物與試驗(yàn)體系（包括實(shí)驗(yàn)動物、細(xì)胞、細(xì)菌等）的接觸，增加樣品吸收率，使樣品性狀更利于試驗(yàn)操作，保證毒理學(xué)試驗(yàn)的科學(xué)性和嚴(yán)謹(jǐn)性。3定義3.1前處理指在毒理學(xué)試驗(yàn)開始前，對受試樣品進(jìn)行溶解、研磨、混勻、賦形、劑量分組、合理保存等一系列的準(zhǔn)備性操作。4前處理的基本原則化妝品原料和產(chǎn)品的前處理方式需要綜合考慮樣品的理化性質(zhì)和毒理學(xué)試驗(yàn)方案。對于化妝品原料而言，應(yīng)根據(jù)受試物的理化特性和染毒方式確定前處理方法。對于化妝品產(chǎn)品而言，則主要考慮化妝品產(chǎn)品的物理性狀和實(shí)際應(yīng)用中的使用方法。化妝品原料和產(chǎn)品的樣品前處理均需遵守現(xiàn)用現(xiàn)配原則。5前處理方法根據(jù)毒理學(xué)試驗(yàn)的要求，需要對樣品進(jìn)行前處理的準(zhǔn)備工作。受試物的處理不能改變其原有的毒理學(xué)性質(zhì)。受試物進(jìn)行不同試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)結(jié)合毒理學(xué)試驗(yàn)項(xiàng)目的染毒方式和受試物的理化性質(zhì)進(jìn)行相應(yīng)的前處理工作。5.1溶劑的選擇化妝品前處理應(yīng)不改變樣品的毒理學(xué)性質(zhì)。當(dāng)樣品需要溶解時(shí)，應(yīng)注意溶劑的選擇，以保證樣品充分溶解或混懸。樣品的前處理稀釋倍數(shù)應(yīng)保證最終供試品濃度不低于實(shí)際使用濃度。溶劑的選擇應(yīng)充分了解其毒理特性。溶劑應(yīng)無特殊刺激性或氣味，本身應(yīng)不產(chǎn)生毒性作用，與受試物各成分之間不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，且保持其穩(wěn)定性，如使用其他溶劑應(yīng)說明理由。體外遺傳毒性試驗(yàn)中，所選溶劑必須是非致突變物，且不能影響細(xì)胞或細(xì)菌存活以及S9的活性。細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)常用溶劑首選無菌蒸餾水，其次DMSO、四氫呋喃、丙酮等。細(xì)胞試驗(yàn)常用溶劑首選培養(yǎng)液（不含血清）或無菌蒸餾水，其次DMSO、丙酮、甘油等；使用有機(jī)溶劑時(shí)，終濃度應(yīng)符合具體試驗(yàn)項(xiàng)目的要求，一般而言，DMSO使用終濃度不應(yīng)大于0.5%，丙酮和甘油使用終濃度不應(yīng)大于1%。5.2化妝品原料化妝品原料的前處理方法主要取決于樣品的物理形態(tài)和染毒方式，具體如下：5.2.1液態(tài)（1）準(zhǔn)備器材：一次性注射器（2mL-5mL），無菌離心管（15mL/50mL），移液槍（0.1μL-5mL），量筒（10mL），燒杯，旋渦混勻儀，水相/有機(jī)相濾器（0.22μm/0.45μm），溶劑等。（2）取樣：根據(jù)毒理學(xué)試驗(yàn)項(xiàng)目、染毒方式以及樣品原液性質(zhì)計(jì)算各劑量組稀釋倍數(shù)，然后用一次性注射器或移液槍量取相應(yīng)體積的樣品原液，加入適宜溶劑中，并充分混勻。也可應(yīng)用等比例稀釋法。若樣品原液為多介質(zhì)分層液體，應(yīng)上下?lián)u晃，使其充分混勻后，再做稀釋分組。若毒理學(xué)試驗(yàn)項(xiàng)目未明確要求劑量分組時(shí)，可使用一次性注射器或移液槍直接量取樣品原液。（3）儲存：將配置好的供試液密封，防止雜質(zhì)污染，根據(jù)樣品原液的儲存方式選擇室溫或冷藏暫放或避光。樣品配制應(yīng)適量，遵守現(xiàn)用現(xiàn)配的原則，防止樣品在儲存過程中發(fā)生變質(zhì)或變性。5.2.2固態(tài)（1）準(zhǔn)備器材：研缽，電子天平，稱量紙，稱量勺，量筒（10mL），燒杯，無菌離心管（15mL/50mL），旋渦混勻儀，水相/有機(jī)相濾器（0.22μm/0.45μm），移液槍（0.1μL-5mL），溶劑等。（2）取樣：首先根據(jù)樣品物理性狀，考慮是否需要研磨，若樣品原樣為細(xì)粉狀，則無需研磨；否則，應(yīng)先使用研缽，將塊狀、膏狀等固體性狀，充分研磨成細(xì)粉狀或糊狀。然后根據(jù)毒理學(xué)試驗(yàn)項(xiàng)目、染毒方式以及樣品原樣性質(zhì)計(jì)算各劑量組濃度，用電子天平稱量相應(yīng)重量的樣品，加入適宜溶劑中，并充分混勻。若毒理學(xué)試驗(yàn)項(xiàng)目未明確要求分劑量組時(shí)，可直接用電子天平稱量相應(yīng)重量的樣品；如果試驗(yàn)項(xiàng)目為經(jīng)皮染毒時(shí)，可考慮用最小體積的溶劑將樣品濕化成無散落粉末且無多余溶劑的狀態(tài)，或在正式試驗(yàn)時(shí)，先濕化皮膚。（3）儲存：將配置好的供試液密封，防止雜質(zhì)污染，根據(jù)樣品原樣的儲存方式選擇干燥通風(fēng)的環(huán)境，室溫或冷藏暫放或避光。樣品配制應(yīng)適量，遵守現(xiàn)用現(xiàn)配的原則，防止樣品在儲存過程中發(fā)生潮化或變質(zhì)。5.2.3難溶樣品難以溶解于無機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑的難溶樣品，常見處理方法有（1）使用樣品浸提液。根據(jù)樣品理化性質(zhì)選擇適宜浸提介質(zhì)、浸提比例、浸提溫度、浸提時(shí)間和浸提方法，并提供相應(yīng)說明。樣品浸提液應(yīng)對皮膚無毒副作用。（2）加入懸浮劑或賦形劑，使樣品懸浮其中，形成分布均勻的懸浮混合物。懸浮劑或賦形劑應(yīng)對皮膚無毒副作用、無色無味，且穩(wěn)定性高。常見的懸浮劑及賦形劑有：玉米油、淀粉、明膠等。5.3化妝品產(chǎn)品化妝品產(chǎn)品進(jìn)行毒理學(xué)試驗(yàn)的前處理工作時(shí)，主要根據(jù)化妝品產(chǎn)品劑型分類處理，此外，還需要考慮化妝品的實(shí)際使用方法等因素。5.3.1液體劑型化妝品產(chǎn)品化妝品中的液體劑型（露、液、水、油、油水分離等），除膏、霜、蜜、脂以外的膏霜乳劑型（乳、乳液、奶、奶液等）、凝膠劑型（啫喱、膠等）等流動性的化妝品產(chǎn)品均可參照5.2.1處理。乳化類的液體產(chǎn)品稀釋時(shí)，需根據(jù)產(chǎn)品特征選擇脂溶性或水溶性溶劑。5.3.2固體劑型化妝品產(chǎn)品化妝品中膏霜乳類中的膏體、霜類、蜜、脂，以及粉劑劑型（散粉、顆粒等），塊狀劑型（塊狀粉、大塊固體等），泥狀劑型（泥狀固體等），蠟基劑型（以蠟為主要基料的產(chǎn)品）等固體化妝品產(chǎn)品的前處理方式可參照5.2.2處理。5.3.3敷貼類化妝品產(chǎn)品化妝品中貼、膜、含基材劑型（貼、膜、含配合化妝品使用的基材類）的化妝品產(chǎn)品前處理方法如下：（1）準(zhǔn)備器材：取剪刀，一次性注射器（2mL-5mL），移液槍（0.1μL-5mL），量筒（10mL），溶劑等。（2）取樣：根據(jù)毒理學(xué)試驗(yàn)項(xiàng)目和產(chǎn)品的使用方式，如若經(jīng)皮接觸，先用剪刀將樣品裁剪成適宜的形狀（如2.5×2.5cm的方塊），比如含基質(zhì)材料的面膜類；當(dāng)原產(chǎn)品形狀不足尺寸時(shí)，可疊加多個(gè)直到滿足形狀要求，比如痘痘貼類；如若經(jīng)眼睛接觸，可將樣品液從產(chǎn)品袋中擠出，然后按照5.2.1處理。（3）儲存：將配置好的供試液密封，防止雜質(zhì)污染，根據(jù)樣品的儲存方式選擇室溫或冷藏暫放或避光。5.3.4按配比使用的化妝品產(chǎn)品染發(fā)劑等按比例配制使用的化妝品，其前處理工作應(yīng)與產(chǎn)品實(shí)際使用方法保持一致，具體如下：（1）準(zhǔn)備器材：一次性注射器（2mL-5mL），移液槍（0.1μL-5mL），量筒（10mL），電子天平，旋渦混勻儀等。（2）取樣：根據(jù)化妝品產(chǎn)品的使用說明，用電子天平或一次性注射器或移液槍定量取相應(yīng)質(zhì)量的各組分樣品，然后充分均勻。（3）儲存：將配置好的供試液密封，防止雜質(zhì)污染，根據(jù)樣品的儲存方式選擇室溫或冷藏暫放或避光。此類化妝品產(chǎn)品應(yīng)嚴(yán)格遵守現(xiàn)用現(xiàn)配原則。5.3.5氣霧劑劑型及噴霧劑劑型化妝品產(chǎn)品化妝品中氣霧劑劑型（含推進(jìn)劑）及噴霧劑劑型的化妝品前處理如下：（1）準(zhǔn)備器材：燒杯，一次性注射器（2mL-5mL），移液槍（0.1μL-5mL）等。（2）取樣：一般情況下，首先將樣品噴至燒杯容器中，收集其液體，再按照5.2.1處理。若樣品因?yàn)檎舭l(fā)而無法收集時(shí)，可模擬產(chǎn)品的實(shí)際使用方法，直接將產(chǎn)品在受試動物正前方10cm處噴射，此距離可根據(jù)噴霧壓力及內(nèi)容物做出適度調(diào)整。（3）儲存：將配置好的供試液密封，防止雜質(zhì)污染或揮發(fā)，根據(jù)樣品原液的儲存方式選擇室溫或冷藏暫放或避光。5.3.6具有特殊使用方法的化妝品產(chǎn)品若產(chǎn)品備注有特殊使用方法，如需要加熱、溶解等操作，如凍干粉、浴鹽等，應(yīng)在前處理時(shí)，按照樣品的實(shí)際使用方法，盡可能保持受試物在實(shí)際使用中的形態(tài)。此類化妝品產(chǎn)品的配制應(yīng)注意現(xiàn)用現(xiàn)配的原則。5.4其他化妝品原料和產(chǎn)品為其他特殊性狀時(shí)，應(yīng)綜合考慮受試物理化特性和人群接觸特征，選擇不影響受試物毒理學(xué)特性的前處理方式。6注意事項(xiàng)經(jīng)皮染毒時(shí)，溶劑應(yīng)另外注意不影響受試物穿透皮膚，保證受試物與皮膚有良好接觸，常用的介質(zhì)有蒸餾水、羊毛脂、凡士林。經(jīng)口染毒時(shí)，受試物均應(yīng)溶解于適宜的溶劑中，在選擇溶劑時(shí)應(yīng)不高于經(jīng)口染毒液體的最大容量，嚙齒類動物所給液體容量一般為1mL/100g，水溶液可至2mL/100g。通過調(diào)整受試物溶液濃度使各劑量組經(jīng)口染毒的容量一致。吸入染毒時(shí)，受試物須在空氣中保持一定濃度，必要時(shí)可加入適當(dāng)?shù)馁x形劑。賦形劑本身應(yīng)無毒性，不與受試物反應(yīng)且不影響受試物的吸收。在體外試驗(yàn)中，需要注意無菌條件，化妝品原料和產(chǎn)品的酸堿度不能影響細(xì)胞或細(xì)菌的正常生長，若化妝品原料和產(chǎn)品為強(qiáng)酸強(qiáng)堿（pH≤2或pH≥11.5），可不再做皮膚刺激性/腐蝕性試驗(yàn)和急性眼刺激性/腐蝕性試驗(yàn)。附件3急性吸入毒性試驗(yàn)方法AcuteInhalationToxicityStudy1范圍本規(guī)范規(guī)定了動物急性吸入毒性試驗(yàn)的基本原則、要求和方法。本規(guī)范適用于化妝品單一成分的原料安全性毒理學(xué)檢測。2試驗(yàn)?zāi)康募毙晕攵拘栽囼?yàn)可評價(jià)化妝品原料能否被直接吸入或者通過其他途徑進(jìn)入呼吸道所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)，可對受試物進(jìn)行毒性分級，為亞急性毒性和其他毒理學(xué)研究中染毒濃度選擇提供依據(jù)。3定義3.1急性吸入毒性acuteinhalationtoxicity實(shí)驗(yàn)動物短時(shí)間（24h內(nèi)）持續(xù)吸入一種可吸入性受試物后，在短期內(nèi)出現(xiàn)的健康損害效應(yīng)。3.2半數(shù)致死濃度（LC50）medianlethalconcentration在一定時(shí)間內(nèi)經(jīng)呼吸道吸入受試物后，引起實(shí)驗(yàn)動物總體中半數(shù)死亡的毒物的統(tǒng)計(jì)學(xué)劑量，以單位體積空氣中受試物的質(zhì)量（mg/m3）來表示。3.3空氣動力學(xué)直徑aerodynamicequivalentdiameter(AD)氣溶膠顆粒與不同直徑標(biāo)準(zhǔn)單位密度（1.0g/cm3）球形顆粒中某一顆粒的終端沉降速度相同時(shí)，該標(biāo)準(zhǔn)球形顆粒的直徑即為空氣動力學(xué)直徑。其計(jì)量單位為μm。3.4質(zhì)量中值空氣動力學(xué)直徑massmedianaerodynamicdiameter(MMAD)氣溶膠中小于和等于某一空氣動力學(xué)直徑的顆?？傎|(zhì)量，占全部顆粒物質(zhì)量50%時(shí)，該直徑即為空氣動力學(xué)質(zhì)量中位數(shù)直徑。3.5幾何標(biāo)準(zhǔn)差geometricstandarddeviation(GSD)用以描述氣溶膠顆粒大小的分布狀態(tài)。以撞擊器各級累積百分比為Y軸、粒徑為X軸擬合對數(shù)概率曲線，以累積百分比84.1%對應(yīng)的粒徑除以累積百分比50%的粒徑，即為幾何標(biāo)準(zhǔn)差。4試驗(yàn)的基本原則受試物通過吸入暴露裝置制備成不同濃度的樣品，各試驗(yàn)組動物在一定時(shí)間內(nèi)吸入不同濃度的受試物，暴露濃度的選擇可通過預(yù)試驗(yàn)確定，吸入暴露后觀察動物的毒性反應(yīng)和死亡情況，試驗(yàn)期間死亡的動物要進(jìn)行尸檢，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)存活的動物要處死進(jìn)行大體解剖。5試驗(yàn)方法5.1受試物試驗(yàn)前受試物的有用信息包括：受試物的特性（如純度），化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)；任何體外或者體內(nèi)性試驗(yàn)結(jié)果：預(yù)期用途和人體暴露的可能性；得到的結(jié)構(gòu)類似物的構(gòu)效關(guān)系數(shù)據(jù)和毒理數(shù)據(jù)，在研究中，盡可能使用一組受試物，而且其樣本應(yīng)該在能保持其純度、穩(wěn)定性的條件下保存。受試物的準(zhǔn)備：可對受試物進(jìn)行適當(dāng)處理，使其達(dá)到適當(dāng)濃度和粒徑。如果是顆粒材料可經(jīng)過機(jī)械加工，以達(dá)到所需的粒度分布，但不要分解或者改變供試品，如果在機(jī)械過程中已經(jīng)被認(rèn)為改變了物品組分時(shí)，應(yīng)對受試物成分進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證如果不產(chǎn)生可吸入顆粒，則不需要進(jìn)行吸入毒性試驗(yàn)，否則應(yīng)進(jìn)行吸入毒性試驗(yàn)。5.2實(shí)驗(yàn)動物和飼養(yǎng)環(huán)境常規(guī)選擇嚙齒類動物，首選大鼠，一般選用8~12周齡的大鼠，使用雌性動物應(yīng)是未孕和未曾產(chǎn)仔的。如需使用其他品系需說明理由。試驗(yàn)開始時(shí)動物體重的差異應(yīng)不超過平均體重的±20%。試驗(yàn)前動物要在實(shí)驗(yàn)動物房環(huán)境中至少適應(yīng)3~5d時(shí)間。染毒前，動物應(yīng)提前適應(yīng)口鼻暴露時(shí)所用的固定器，以減少進(jìn)入新環(huán)境引起的不適。實(shí)驗(yàn)動物及實(shí)驗(yàn)動物房應(yīng)符合國家相應(yīng)規(guī)定。選用標(biāo)準(zhǔn)配合飼料，飲水不限制。5.3染毒濃度在試驗(yàn)開始前，通常要進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，為主試驗(yàn)的濃度選擇提供幫助，受試物已知或預(yù)期有毒則進(jìn)行限度試驗(yàn)。用全球化學(xué)品統(tǒng)一分類和標(biāo)簽系統(tǒng)（GHS）的分類系統(tǒng)，氣體、蒸氣、溶膠的限定濃度分別為20000ppm、20mg/L和5mg/L。傳統(tǒng)LC50試驗(yàn)至少設(shè)置3個(gè)不同濃度的染毒組，每組動物一般為10只，雌雄各半。各劑量組間距大小以兼顧產(chǎn)生毒性大小和死亡為宜，通常以較大組距和較少量動物進(jìn)行預(yù)試，以便能在各濃度組的試驗(yàn)動物中發(fā)生一定程度毒效應(yīng)和死亡。所得資料應(yīng)足以繪制出濃度－死亡曲線，并在可能情況下求出LC50值。5.4暴露方式根據(jù)受試物的性質(zhì)和試驗(yàn)?zāi)康膩磉x擇吸入染毒方式，首選的暴露方式為口鼻式暴露，特別是在研究液體或固體氣溶膠或者可凝結(jié)成為氣溶膠的蒸氣時(shí)。對于特殊的研究目的，也可采用全身暴露染毒裝置以更好地滿足研究需求，但應(yīng)在試驗(yàn)報(bào)告中予以闡釋說明。采用全身暴露染毒時(shí)應(yīng)保證染毒柜中氣流的穩(wěn)定性，試驗(yàn)動物的總體積不能超過染毒柜容積的5%。5.5暴露條件口鼻式暴露時(shí)間推薦為4h，暴露期間應(yīng)禁食，在全身暴露時(shí)可以提供水。如果需更長時(shí)間的研究，應(yīng)提供理由。5.6方法5.6.1傳統(tǒng)的LC50法在傳統(tǒng)法中，暴露時(shí)間為4h。動物暴露在一個(gè)限定濃度（限度試驗(yàn)），或在至少3個(gè)不同的濃度下（主試驗(yàn)）。除已知受試物信息外，在開展主試驗(yàn)前，需要進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。預(yù)試驗(yàn)：預(yù)試驗(yàn)可用來估計(jì)受試物的毒性效應(yīng)，確定易感性的性別差異，并為限度試驗(yàn)或主試驗(yàn)的濃度選擇提供幫助。在選擇預(yù)試驗(yàn)的濃度水平時(shí)，應(yīng)該充分使用所有可得的信息，比如現(xiàn)有的定量－構(gòu)效關(guān)系（Q）SAR數(shù)據(jù)和類似化學(xué)品的數(shù)據(jù)。試驗(yàn)中，每個(gè)濃度水平的每種性別的試驗(yàn)動物不超過3只，通常只有一個(gè)濃度水平。已經(jīng)進(jìn)行過的急性吸入毒性試驗(yàn)－急性毒性分類法研究可以用來替代預(yù)試驗(yàn)。限度試驗(yàn)：當(dāng)受試物已知或預(yù)期基本無毒時(shí)，可采用限度試驗(yàn)。受試物的毒性作用信息，可以來源于已測試過的類似化合物或混合物或產(chǎn)品的特性和具有毒理意義的組成成分。在限度試驗(yàn)中，雌雄各3只動物暴露在限定濃度中。如果在限定濃度發(fā)現(xiàn)動物死亡或?yàn)l死，則限度試驗(yàn)的結(jié)果可作為其他濃度試驗(yàn)（如主試驗(yàn)）的預(yù)試驗(yàn)。如果受試物的理化性質(zhì)決定其不可能達(dá)到限定濃度，則需測試其最大可及濃度。如果最大可及濃度的死亡率小于50%，則不需進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)。主試驗(yàn)：進(jìn)行主試驗(yàn)時(shí)，一般每個(gè)濃度組有10只動物，雌雄各半（或5只易感性別的動物），且至少有3個(gè)濃度水平。必須有足夠多的濃度水平足以繪制出濃度死亡曲線，并在可能情況下求出LC50各暴露組之間的時(shí)間間隔取決于中毒體征的出現(xiàn)、持續(xù)時(shí)間與嚴(yán)重程度。是否需要對下濃度水平進(jìn)行試驗(yàn)，取決于先前的試驗(yàn)動物是否能夠成活。5.6.2濃度－時(shí)間法濃度－時(shí)間法是傳統(tǒng)LC50法的另一種替代方法。這種方法使試驗(yàn)動物暴露在不同濃度的受試物水平，而且暴露時(shí)間也不同。所有的試驗(yàn)都采用口鼻部吸入的方法。與傳統(tǒng)法相比，濃度－時(shí)間法得到的LC01與LC100的值更加穩(wěn)定。當(dāng)在4個(gè)濃度水平和5種暴露持續(xù)時(shí)間的主試驗(yàn)采用濃度－時(shí)間法時(shí)，每個(gè)濃度－時(shí)間間隔只需使用2只動物（雌雄各半或易受影響的單一性別）。在某些情況下，在每濃度－時(shí)間間隔，可以選擇兩種性別的動物各2只，這能減少參數(shù)估計(jì)的誤差和變異性，增加成功率，提高置信區(qū)間的覆蓋范圍。當(dāng)用來參數(shù)估計(jì)的數(shù)據(jù)擬合不好時(shí)，可能需要第5個(gè)濃度水平。預(yù)試驗(yàn)：預(yù)試驗(yàn)一般用各性別、各濃度3只動物，它可以為主試驗(yàn)選擇1個(gè)合適的初始濃度和最大化減少動物使用。暴露時(shí)間為4h。如果能從急性吸入毒性試驗(yàn)－急性毒性分類法中得到死亡數(shù)據(jù)，那么可以不進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。在選擇研究中的初始目標(biāo)濃度時(shí)，應(yīng)該考慮在急性吸入毒性試驗(yàn)－急性毒性分類法中觀察到的各性別和各個(gè)濃度的死亡率。主試驗(yàn)：初始濃度（第一步暴露）可能是限定濃度，也可根據(jù)預(yù)試驗(yàn)選擇濃度。每組雌雄各1只動物暴露于此濃度下，持續(xù)時(shí)間不同（如15、30、60、120、240min），總共用到10只動物。限定濃度可根據(jù)監(jiān)管要求選擇，氣體、蒸氣、氣溶膠的限定濃度分別為20000ppm、20mg/L、5mg/L（或?yàn)樽畲罂杉皾舛龋?，如果在第一步暴露中發(fā)現(xiàn)死亡，則引起死亡的最小暴露濃度將為下一步試驗(yàn)的濃度建立提供指導(dǎo)，每一個(gè)后續(xù)的試驗(yàn)都將取決于先前的試驗(yàn)結(jié)果。當(dāng)供試品物理或化學(xué)性質(zhì)無法達(dá)到極限濃度時(shí)，應(yīng)測試可達(dá)到的最大濃度。如果在可達(dá)到的最大濃度下，致死率低于50%，則不需要進(jìn)行下一步的測試，如果不能達(dá)到極限濃度，研究報(bào)告應(yīng)提供說明和數(shù)據(jù)支持，如果可達(dá)到的最大蒸汽濃度不會引起毒性，則可能需要將供試品作為液體氣溶膠產(chǎn)生。對于很多受試物，如果暴露時(shí)間間隔適當(dāng)，在初始濃度得到的結(jié)果與在其他3個(gè)濃度組得到的結(jié)果，就能足以繪制濃度－時(shí)間－死亡曲線。5.7暴露條件的監(jiān)測5.7.1濃度監(jiān)測試驗(yàn)期間為保證實(shí)際濃度的穩(wěn)定性，可以使用實(shí)時(shí)監(jiān)測設(shè)備（如氣溶膠光度計(jì)），或定期通過特異性的方法（如采用撞擊器吸附或化學(xué)反應(yīng)的原理直接采樣，然后進(jìn)行化學(xué)分析），或非特異性的方法如濾膜采樣法來測定呼吸區(qū)或染毒柜內(nèi)氣溶膠濃度，以保證暴露條件的穩(wěn)定性。對于氣體和蒸汽，單個(gè)腔室濃度樣品的平均濃度不得超過±10%，對于液體或固體氣溶膠，平均濃度不應(yīng)超過±20%，應(yīng)計(jì)算和記錄腔室的平衡時(shí)間（t95）。5.7.2粒徑監(jiān)測在發(fā)生系統(tǒng)中，應(yīng)進(jìn)行粒度分析，以確保氣溶膠濃度的穩(wěn)定性。推薦可吸入質(zhì)量中值空氣動力學(xué)直徑（MMAD）應(yīng)該在1~4μm，幾何標(biāo)準(zhǔn)差（σ）在1.5~3.0。在染毒期間，需經(jīng)常進(jìn)行粒度分析，以測定粒度分布的一致性。如達(dá)不到要求，應(yīng)說明理由。氣溶膠粒徑的測定需在染毒4小時(shí)內(nèi)至少采樣2次，可采用級聯(lián)撞擊采樣器或其他設(shè)備如氣體動力學(xué)粒徑儀等，粒徑分析所得質(zhì)量濃度應(yīng)處于由濾膜分析法所得質(zhì)量濃度的合理的限度范圍內(nèi)。5.7.3暴露系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境監(jiān)測染毒裝置內(nèi)氣流：染毒裝置應(yīng)配備動態(tài)氣流，口鼻吸入染毒過程中應(yīng)使裝置內(nèi)保持輕度負(fù)壓，全身暴露裝置染毒柜內(nèi)應(yīng)密閉，以防止受試物泄露到外部環(huán)境中。暴露期間盡可能連續(xù)監(jiān)測并每小時(shí)記錄1次，在暴露系統(tǒng)中，氧氣濃度應(yīng)至少為19%，二氧化碳濃度不得超過1%，如果達(dá)不到要求，應(yīng)定期監(jiān)測氧氣和二氧化碳濃度。染毒裝置內(nèi)溫度保持在22±3℃，口鼻暴露和全身暴露都需監(jiān)測記錄動物呼吸區(qū)的相對濕度，試驗(yàn)期間應(yīng)至少監(jiān)測和記錄三次，較短時(shí)間內(nèi)每半小時(shí)測一次。理想的相對濕度一般在30%～70%，但在某些情況下，可能無法達(dá)到（例如在測試水溶液型受試物時(shí)），應(yīng)在試驗(yàn)報(bào)告中予以闡釋說明。5.8臨床觀察在暴露剛開始當(dāng)天至少進(jìn)行兩次臨床觀察，或者根據(jù)動物反應(yīng)，進(jìn)行更頻繁觀察。觀察期限最少為14d，以后每天至少進(jìn)行一次觀察。中毒體征出現(xiàn)和消失的時(shí)間都十分重要，特別是在有中毒體征延遲趨勢時(shí)。動物瀕死、疼痛劇烈與嚴(yán)重且持久的痛苦皆應(yīng)予以安樂死。當(dāng)動物被安樂死，或者發(fā)現(xiàn)死亡時(shí)，應(yīng)該盡可能準(zhǔn)確記錄死亡時(shí)間。所有的觀察應(yīng)該被系統(tǒng)地記錄，每個(gè)動物應(yīng)該保持單獨(dú)記錄。觀察內(nèi)容應(yīng)該包括皮毛，眼睛和黏膜，呼吸，循環(huán)，自主和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，肢體活動和行為的改變。應(yīng)該記錄可能的局部和全身反應(yīng)的差別。要注意有無震顫、驚厥、流涎、腹瀉、昏睡、睡眠和昏迷癥狀。測試直腸溫度可為出現(xiàn)反射性呼吸遲緩、C-纖維刺激反射或與給藥方式或封閉相關(guān)的低溫/高熱情況提供佐證。每只動物體重應(yīng)該在暴露前一天到暴露（day0），并且至少在第1天、第3天和第7天（以及此后每周），以及在第1天后的死亡或安樂死時(shí)進(jìn)行記錄。若動物體重出現(xiàn)≥20%的持續(xù)遞減，應(yīng)該進(jìn)行密切監(jiān)測。在暴露結(jié)束后，應(yīng)測量存活動物的體重，并實(shí)施安樂死。5.9病理檢查所有實(shí)驗(yàn)的動物，包括在實(shí)驗(yàn)中死亡的，或者出于動物福利原因被安樂死以及從試驗(yàn)中撤離的，應(yīng)該進(jìn)行大體解剖。如果動物被發(fā)現(xiàn)死亡后，應(yīng)盡可能快地進(jìn)行尸體解剖，通常在1~2d內(nèi)，如不能被立即進(jìn)行尸體解剖，動物應(yīng)該被冷藏，以盡量減少自溶。記錄每個(gè)動物的大體病理變化，并特別注意呼吸道改變。其他附加檢查可為研究提供更為深入的解釋價(jià)值，例如測量存活大鼠肺的重量，和/或提供呼吸道刺激性的顯微鏡檢查證據(jù)，對死亡和存活24h及24h以上的動物中存在大體病理改變的器官進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。如受試物對水有反應(yīng)（如酸和吸濕性受試物），可開展整個(gè)呼吸道的顯微鏡檢查。5.10LC50的計(jì)算一般可采用多種方法測定LC50，建議采用一次最大限度試驗(yàn)法、霍恩氏法、概率單位－對數(shù)圖解法和寇氏法等。5.11試驗(yàn)結(jié)果評價(jià)5.11.1結(jié)果處理應(yīng)該提供每只動物的體重和尸檢發(fā)現(xiàn)的數(shù)據(jù)。臨床觀察數(shù)據(jù)應(yīng)該以表格的形式呈現(xiàn)，統(tǒng)計(jì)出各實(shí)驗(yàn)組使用的動物的數(shù)量，出現(xiàn)特殊中毒特征的動物數(shù)量，實(shí)驗(yàn)中死亡或者人道處死的動物數(shù)量，動物個(gè)體的死亡時(shí)間，毒副作用的描述和時(shí)間進(jìn)程，可逆體征以及尸檢發(fā)現(xiàn)。5.11.2結(jié)果評價(jià)評價(jià)試驗(yàn)結(jié)果時(shí)，應(yīng)將LC50與觀察到的毒性效應(yīng)和尸檢結(jié)果相結(jié)合考慮，LC50值是受試物急性毒性分級及判定受試物經(jīng)呼吸道吸入后引起動物死亡可能性大小的依據(jù)，引用LC50值時(shí)一定要注明所用實(shí)驗(yàn)動物的種屬、性別、暴露方式及時(shí)間長短、觀察期限等。評價(jià)應(yīng)包括受試物吸入暴露劑量與動物異常表現(xiàn)（包括行為和臨床改變、大體損傷、體重變化、致死效應(yīng)及其他毒性作用）的發(fā)生率和嚴(yán)重程度之間的關(guān)系。毒性分級見表1。表1吸入毒性分級分級氣體（ppm）蒸氣（mg/L，4h）粉塵和霧（mg/L，4h）第1類LC50≤100LC50≤0.5LC50≤0.05第2類100＜LC50≤5000.5＜LC50≤2.00.05＜LC50≤0.5第3類500＜LC50≤25002.0＜LC50≤100.5＜LC50≤1.0第4類2500＜LC50≤2000010＜LC50≤201.0＜LC50≤5第5類＞20000＞20＞5注：分類標(biāo)準(zhǔn)引用《全球化學(xué)品統(tǒng)一分類和標(biāo)簽制度》(GHS)。第5類的標(biāo)準(zhǔn)旨在識別急毒性危險(xiǎn)相對較低，但在某些環(huán)境下可能對易受害人群造成危險(xiǎn)的物質(zhì)，這些物質(zhì)的LC50范圍預(yù)計(jì)值分別為：氣體大于20000ppm，蒸氣大于20mg/L，粉塵和霧大于5mg/L，如果現(xiàn)有的可靠證據(jù)表明LC50在第5類的數(shù)值范圍內(nèi)，或者其他動物研究或人類毒性效應(yīng)表明對人類健康有急性影響，那么物質(zhì)劃入此類別。為保護(hù)動物，不應(yīng)在第5類范圍內(nèi)對動物進(jìn)行試驗(yàn)，只有在這樣的試驗(yàn)結(jié)果與保護(hù)人類健康直接相關(guān)的可能性非常大時(shí)，才應(yīng)考慮進(jìn)行這樣的試驗(yàn)。6試驗(yàn)結(jié)果的解釋急性吸入毒性試驗(yàn)研究和LC50的測定，可評價(jià)受試物的急性吸入毒性及其毒性等級，其結(jié)果外推到人類的有效性很有限。附件4急性吸入毒性試驗(yàn)急性毒性分類法AcuteInhalationToxicity-AcuteToxicClassMethod1范圍本試驗(yàn)方法規(guī)定了急性吸入毒性試驗(yàn)急性毒性分類法的試驗(yàn)原則、試驗(yàn)方法、數(shù)據(jù)和報(bào)告。本試驗(yàn)方法適用于化妝品原料急性吸入毒性的急性毒性分類。本試驗(yàn)方法適用于單一成分的化妝品原料，非單一成分的原料若使用本方法進(jìn)行評價(jià)，需要提供更多的科學(xué)依據(jù)說明其可行性。本試驗(yàn)方法不適用于測試某些特殊的材料，如難溶的等軸狀（isometric）或纖維狀（fibrous）材料、或人造納米材料（manufacturednanomaterials）。2試驗(yàn)?zāi)康谋驹囼?yàn)方法的目的是通過測試獲得受試物的健康危害信息等資料，從而可參考聯(lián)合國全球化學(xué)品分類和標(biāo)簽管理協(xié)調(diào)制度（theUnitedNations（UN）GloballyHarmonizedSystem（GHS）ofClassificationandLabellingofChemicals）的化學(xué)品急性毒性分類標(biāo)準(zhǔn)對其急性毒性進(jìn)行分類。3定義3.1急性吸入毒性分類法按照一定的連續(xù)試驗(yàn)步驟和相應(yīng)的濃度進(jìn)行測試，從而獲得受試物的毒性分類和半數(shù)致死濃度（LC50,LethalConcentration50%）估測范圍的試驗(yàn)方法。3.2計(jì)算濃度nominalconcentration使用受試物的量除以通過染毒系統(tǒng)空氣的總體積所得到的濃度。3.3實(shí)際濃度actualconcentration在吸入式染毒柜中動物呼吸道中的受試物濃度，可通過特異性（如直接采樣、吸附或化學(xué)反應(yīng)等方法進(jìn)行采樣、分析）或非特異性（如濾膜增重法）等方法進(jìn)行測試分析。4試驗(yàn)原則本試驗(yàn)采用分步試驗(yàn)的方法，觀察試驗(yàn)動物暴露4h的反應(yīng)，從而得到滿足對受試物急性吸入毒性等級進(jìn)行分類的信息。為了特殊的監(jiān)管目的也可采用其他暴露時(shí)限（不是4h）的試驗(yàn)。每步試驗(yàn)使用每種性別3只動物，在確定的濃度下進(jìn)行吸入暴露試驗(yàn)。根據(jù)動物死亡和/或?yàn)l死狀態(tài)，有時(shí)只進(jìn)行2步試驗(yàn)操作就可以對受試物的急性吸入毒性類別做出判斷。如果有證據(jù)表明某種性別的動物比另外一種動物的敏感性要高時(shí)，可以只使用敏感性別動物進(jìn)行試驗(yàn)。前面一步操作的試驗(yàn)結(jié)果決定著下一步試驗(yàn)操作：a）無需進(jìn)行下一步試驗(yàn)；b）每性別3只動物；或c）只使用6只敏感性別的動物。方法是每個(gè)試驗(yàn)濃度組使用6只敏感性別的動物，性別不限，以估測的毒性類別界限范圍數(shù)值中較低的濃度來進(jìn)行試驗(yàn)。對瀕臨死亡的、處于難以忍受疼痛的或嚴(yán)重持久痛苦的動物，應(yīng)人道地處死。人道處死的試驗(yàn)動物，在結(jié)果統(tǒng)計(jì)時(shí)應(yīng)與試驗(yàn)中死亡的動物一并對待。5試驗(yàn)方法5.1方法描述5.1.1動物種屬的選擇應(yīng)使用健康年輕、實(shí)驗(yàn)室中常用的種屬動物進(jìn)行試驗(yàn)。首選大鼠，如使用其他動物應(yīng)進(jìn)行論證，說明理由和依據(jù)。5.1.2動物的準(zhǔn)備雌性動物應(yīng)是未經(jīng)產(chǎn)的、未妊娠。要保證每步試驗(yàn)暴露時(shí)的鼠齡在8W~12W；試驗(yàn)開始時(shí)動物體重的差異應(yīng)不超過平均體重的±20%。采用隨機(jī)選擇原則，并對每只動物做出標(biāo)記。在進(jìn)行試驗(yàn)之前至少要在籠內(nèi)飼養(yǎng)5d以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)條件。試驗(yàn)前還需在試驗(yàn)設(shè)備中進(jìn)行短期的適應(yīng)訓(xùn)練，以減少因?yàn)檫M(jìn)入新的設(shè)備環(huán)境造成的應(yīng)激反應(yīng)。5.1.3飼養(yǎng)條件實(shí)驗(yàn)動物及實(shí)驗(yàn)動物房應(yīng)符合國家相應(yīng)規(guī)定。選用標(biāo)準(zhǔn)配合飼料，飲水不限制。實(shí)驗(yàn)動物暴露前后按性別、濃度分籠飼養(yǎng)，但是每籠動物的數(shù)量不能妨礙對每只實(shí)驗(yàn)動物的觀察，并應(yīng)減少由于同種相殘和相互撕咬而造成實(shí)驗(yàn)動物信息的丟失。以口鼻式裝置暴露時(shí)，需將動物放入固定管內(nèi)使其適應(yīng)固定管的環(huán)境。固定管不能過度的增加動物體力、熱量和活動的負(fù)荷。動物的限制固定可能影響動物的體溫（過熱）和/或每分鐘動物呼吸量。如果有資料表明這些改變沒有達(dá)到可感覺到的程度，就不一定需要預(yù)先在固定管內(nèi)進(jìn)行適應(yīng)操作。全身暴露氣溶膠的動物在暴露期間需各自相隔互不接觸，防止柜體內(nèi)動物的相互趴臥造成被毛對氣溶膠的過濾作用。除暴露期間外（暴露期間禁食），給予實(shí)驗(yàn)動物常規(guī)檢驗(yàn)合格的飼料，自由飲水。采用人工照明，每12h明暗交替。5.1.4吸入染毒裝置要根據(jù)受試物的性質(zhì)和試驗(yàn)?zāi)康膩磉x擇吸入染毒方式。首選的染毒方式是口鼻式（nose-only）暴露（其中包括僅頭部暴露、鼻部暴露或口鼻部暴露三種染毒模式）。當(dāng)受試物是液體、固態(tài)氣溶膠和能產(chǎn)生氣溶膠的蒸氣時(shí)，首選口鼻式暴露方式。對于特殊的研究目的，也可采用全身暴露（whole-body）的染毒方式以更好地滿足研究需求，但應(yīng)在試驗(yàn)報(bào)告中予以闡釋說明。為了保證全身染毒時(shí)柜體內(nèi)空氣中受試物的穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)動物的總體積不應(yīng)超過染毒柜總?cè)莘e的5%。5.2暴露條件5.2.1染毒濃度5.2.1.1推薦暴露吸入時(shí)間為4h，但需除去達(dá)到濃度穩(wěn)定平衡所需時(shí)間。根據(jù)特殊試驗(yàn)需要也可采用其他的暴露時(shí)限，但是需在試驗(yàn)報(bào)告中給予說明。全身暴露時(shí)動物應(yīng)各自隔離互不接觸，防止染毒柜內(nèi)其他動物的理毛行為造成經(jīng)口攝入受試物。吸入暴露期間需要禁食。全身暴露時(shí)可提供飲水。5.2.1.2動物吸入暴露的受試物是氣體、蒸氣、氣溶膠或是它們的混合物。試驗(yàn)時(shí)將受試物制備成何種物態(tài)，取決于受試物的理化性質(zhì)、設(shè)定的濃度，和/或在實(shí)際加工應(yīng)用中最有可能使用的物理狀態(tài)等。具有吸濕性的和會發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的受試物在試驗(yàn)中需保證吸入的空氣是干燥的。需注意避免使用發(fā)生爆炸的濃度進(jìn)行試驗(yàn)。5.2.2顆粒粒徑的分布對所有的氣溶膠和可能形成氣溶膠的蒸氣都需測定顆粒粒徑的大小。為了使整個(gè)呼吸道都能暴露受試物，推薦的氣溶膠顆粒的質(zhì)量中值空氣動力學(xué)直徑（MassMedianAerodynamicDiameter，MMAD）為1μm~4μm，其幾何標(biāo)準(zhǔn)差為1.5~3.0。需盡可能達(dá)到此標(biāo)準(zhǔn)，如技術(shù)上無法滿足要求時(shí)需由專家做出評判。例如，金屬煙塵比本標(biāo)準(zhǔn)的粒徑要小，但是帶電的粒子、纖維和吸濕性受試物（在呼吸道潮濕環(huán)境下其粒徑增加）可超過這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。5.2.3溶媒選擇與受試物的配制為了制備具有合適濃度和粒徑大小的受試物，需要使用載體溶媒，作為一條規(guī)定，水是首選的載體溶媒。顆粒物需要機(jī)械加工達(dá)到要求的粒徑大小，但要注意加工中是否引起受試物的分解和變性。如機(jī)械加工改變了受試物的組成成分（如由于過度研磨、摩擦產(chǎn)生高溫），受試物的組成要經(jīng)過檢測分析進(jìn)行確認(rèn)。需注意不要污染受試物。對不能形成可吸入性的、不易成為粉末的顆粒材料不需要進(jìn)行試驗(yàn)。磨損試驗(yàn)是用來證明加工這些材料時(shí)會不會產(chǎn)生呼吸性顆粒物。如果經(jīng)磨損試驗(yàn)證實(shí)可產(chǎn)生呼吸性顆粒物，則該材料應(yīng)當(dāng)進(jìn)行吸入毒性試驗(yàn)。5.2.4對照組不需要設(shè)立平行陰性（空氣）對照。即使制備試驗(yàn)氣體的載體溶媒不是水，也只有在沒有載體溶媒歷史數(shù)據(jù)的情況下才設(shè)立溶媒對照組。如果所用溶媒制備的受試物沒有引起毒性，至少說明在該受試物濃度的條件下，溶媒是沒有毒性的，所以不需要設(shè)立溶媒對照組。5.3暴露條件的監(jiān)測5.3.1染毒裝置內(nèi)氣流通過染毒柜（裝置）的氣流速率需嚴(yán)格控制，可連續(xù)在線監(jiān)測記錄或每次暴露期間至少每小時(shí)監(jiān)測記錄一次。試驗(yàn)所用空氣中受試物濃度（或其穩(wěn)定性）的監(jiān)測數(shù)據(jù)是對染毒系統(tǒng)中各個(gè)動力學(xué)參數(shù)作用的綜合結(jié)果，因此這些數(shù)據(jù)可提供控制制備動態(tài)空氣設(shè)備相關(guān)參數(shù)的間接方法。在口鼻式染毒時(shí)通過染毒系統(tǒng)的試驗(yàn)氣體的氣流動力不足時(shí)，需注意動物的在染毒裝置內(nèi)發(fā)生重復(fù)吸入。已有確定在所選定的操作條件下不會發(fā)生重復(fù)吸入的方法。氧氣的濃度至少為19%；二氧化碳的濃度不超過1%。如果證實(shí)確實(shí)不能達(dá)到這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，需要測定并記錄試驗(yàn)空氣中氧氣和二氧化碳的濃度。5.3.2染毒裝置柜內(nèi)溫度和相對濕度染毒柜內(nèi)溫度維持在22℃±3℃?？诒鞘奖┞逗腿肀┞抖夹璞O(jiān)測記錄動物呼吸帶的相對濕度，在吸入染毒的4h之內(nèi)至少3次；吸入染毒暴露期限較短的試驗(yàn)可以每小時(shí)監(jiān)測記錄1次。理想的相對濕度需維持在30%~70%；但是有時(shí)很難達(dá)到（如受試物以水配制），或者受試物與測定方法發(fā)生干擾而難以測定。5.3.3受試物5.3.3.1計(jì)算濃度無論何時(shí)都應(yīng)盡量記錄并計(jì)算染毒柜空氣中受試物的計(jì)算濃度。計(jì)算濃度是指制備產(chǎn)生的受試物的量除以通過染毒系統(tǒng)的空氣總體積得到的參數(shù)。雖然計(jì)算濃度不是用來描述動物暴露特征，但是可通過計(jì)算濃度與實(shí)際濃度進(jìn)行比較可以得到試驗(yàn)系統(tǒng)制備效率的指征，從而可發(fā)現(xiàn)制備染毒空氣過程中存在的問題。5.3.3.2實(shí)際濃度5.3.3.2.1實(shí)際濃度是吸入染毒柜內(nèi)動物呼吸道中的受試物的濃度，可以通過特異性的方法（如采用吸附或化學(xué)反應(yīng)的原理直接采樣，然后進(jìn)行分析）；或是通過非特異性的方法（如濾膜增重法）來獲得。單一成分的粉末、低揮發(fā)性液體的氣溶膠才能使用增重法，同時(shí)還需要專門預(yù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的支持。對多成分的粉末氣溶膠也可以用增重分析法測量，但是這需要證實(shí)所制備的空氣與最初受試物的組成成分相似。如果沒有此類數(shù)據(jù)資料，則需在試驗(yàn)期間按照規(guī)定的時(shí)間間隔對制備產(chǎn)生的空氣進(jìn)行再分析（理想的是染毒柜中的空氣）。對可揮發(fā)的或易升華的氣溶膠，需證實(shí)所用方法能收集到所有物相的受試物。需在試驗(yàn)報(bào)告中報(bào)告靶濃度（目標(biāo)濃度）、計(jì)算濃度和實(shí)際濃度，但只有實(shí)際濃度可用來計(jì)算致死濃度值。5.3.3.2.2應(yīng)使用同一批試驗(yàn)受試物。技術(shù)可行時(shí)盡可能將試驗(yàn)樣品保存在能維持純度、均勻性和穩(wěn)定性的條件下。開始試驗(yàn)前對受試物的特征有充分的了解和描述，如純度、鑒別特征和鑒定出來的污染物和雜質(zhì)。這可用以下參數(shù)來證實(shí)，如保留時(shí)間、相對峰面積和通過質(zhì)譜、氣相色譜或其他的檢測方法得到的分子量，包括且不限于以上內(nèi)容。雖然受試物樣品的特征鑒別不是實(shí)驗(yàn)室的責(zé)任，實(shí)驗(yàn)室還是需要對委托方提供的受試物進(jìn)行必要的簡單有限的描述（如顏色、物理狀態(tài)等）。5.3.3.2.3需盡可能的保持染毒空氣成分穩(wěn)定，可采用適當(dāng)?shù)姆治龇椒ㄟB續(xù)或間隔采樣監(jiān)測。間隔采樣時(shí)，吸入染毒4h的試驗(yàn)至少采樣2次。如果由于系統(tǒng)內(nèi)染毒空氣流量過低所限，或染毒濃度太低需采集較多的空氣樣本時(shí)而不能完全滿足連續(xù)或間隔采樣量的要求，可在整個(gè)暴露期內(nèi)只采集一個(gè)樣本。如果樣本與樣本之間出現(xiàn)明顯波動，進(jìn)行下一個(gè)濃度試驗(yàn)時(shí)需在暴露期間采集4個(gè)樣本進(jìn)行分析。染毒空氣各個(gè)樣本之間的濃度波動范圍應(yīng)符合規(guī)定，氣體和揮發(fā)性受試物濃度范圍不得超過平均濃度±10%，液體或固體氣溶膠濃度范圍不得超過平均值±20%。并需要計(jì)算柜內(nèi)空氣受試物達(dá)到平衡時(shí)的時(shí)間（T95）。一個(gè)暴露周期內(nèi)需要考慮到制備受試物空氣的時(shí)間和達(dá)到T95的時(shí)間。對組成非常復(fù)雜混合物的蒸氣/氣體、氣溶膠（如推動終端裝置設(shè)備產(chǎn)生的燃燒空氣和試驗(yàn)物形成的）在染毒柜內(nèi)空氣中每一相成分物相各不相同，至少要選擇一個(gè)標(biāo)志性物質(zhì)來進(jìn)行分析，通常是受試制備物中處在某一物相（蒸氣/氣體或氣溶膠）的主要的活性物質(zhì)。如果試驗(yàn)物質(zhì)是制劑（商品形式的產(chǎn)品）分析報(bào)告的濃度應(yīng)是制劑的總濃度，不是活性成分的或某成分的濃度。5.3.3.3顆粒物粒徑的分布?xì)馊苣z的粒徑大小需在染毒的4h期間至少測定2次，方法是使用級聯(lián)撞擊采樣器或其他替代的設(shè)備如空氣動力學(xué)粒徑儀等。如果級聯(lián)撞擊時(shí)采樣器與替代的測定方法所得到的結(jié)果相同，在整個(gè)試驗(yàn)期間的就可以使用替代的方法進(jìn)行監(jiān)測。如采用濾膜增重或塵埃測定器/氣體發(fā)泡收集管等第二種設(shè)備檢測，則需要與基礎(chǔ)檢測設(shè)備進(jìn)行平行試驗(yàn)，以驗(yàn)證基礎(chǔ)檢測設(shè)備的收集效率。粒徑大小分析得到的質(zhì)量濃度應(yīng)與采用濾膜分析法得到的質(zhì)量濃度在一個(gè)合理的限度之內(nèi)。如果在試驗(yàn)開始階段就證明兩種試驗(yàn)方法的質(zhì)量濃度相同，就可以免去驗(yàn)證性試驗(yàn)。從動物福利方面考慮，需采取措施減少無確定結(jié)果的數(shù)據(jù)資料，因?yàn)檫@會要求重復(fù)進(jìn)行暴露試驗(yàn)。如果空氣中的蒸氣受試物能發(fā)生凝結(jié)而形成氣溶膠，或者染毒蒸氣空氣中測定到顆粒物也就是暴露空氣存在潛在的混合相，則需對這種受試物進(jìn)行粒徑的測定。5.4操作步驟5.4.1正式試驗(yàn)（maintest）5.4.1.1每一步使用雌雄各3只動物，或6只敏感性別的動物。如果采用口鼻式暴露方式時(shí)使用的嚙齒類動物不是大鼠，則需要調(diào)整最長的暴露時(shí)間以減少動物種屬之間的負(fù)荷的差異?？蓮?個(gè)固定的起始濃度水平染毒，這個(gè)濃度應(yīng)能引起染毒動物中的某些動物出現(xiàn)毒性作用。氣體、蒸氣和氣溶膠的試驗(yàn)步驟圖（見7試驗(yàn)步驟流程圖）的濃度水平是GHS第1類~4類的分類標(biāo)準(zhǔn)的界限值：氣體為（100ppm/4h、500ppm/4h、2500ppm/4h、20000ppm/4h）（見圖1）；蒸氣為（0.5mg/L/4h、2mg/L/4h、10mg/L/4h、20mg/L/4h）（見圖2）；氣溶膠為（0.05mg/L/4h、0.5mg/L/4h、1mg/L/4h、5mg/L/4h）（見圖3）。高于各相應(yīng)物態(tài)類別的上限濃度就歸為第5類。按照各自的試驗(yàn)圖表來確定起始濃度。根據(jù)人道處死和動物試驗(yàn)死亡的數(shù)量，按照圖中的指示的箭頭來決定下一步的試驗(yàn)，直到能對受試物作出毒性分類時(shí)結(jié)束試驗(yàn)。5.4.1.2進(jìn)行下一個(gè)暴露濃度組試驗(yàn)的時(shí)間間隔長短要根據(jù)毒性體征的發(fā)作時(shí)間、持續(xù)時(shí)間和嚴(yán)重程度來決定。決定進(jìn)行暴露下一個(gè)濃度水平需要直到前一個(gè)濃度水平的動物存活狀態(tài)完全確定下來后再進(jìn)行。建議的每個(gè)濃度水平之間的時(shí)間間隔為3d至4d，這可以觀察到可能存在的遲發(fā)毒性。如出現(xiàn)的反應(yīng)不能確定，可適當(dāng)調(diào)整時(shí)間間隔的長短。5.4.2限度試驗(yàn)（limittest）5.4.2.1如已知或預(yù)期受試物幾乎無毒時(shí)可進(jìn)行限度試驗(yàn)，如在超過規(guī)定的極限濃度值以上時(shí)才引起毒性反應(yīng)的受試物。受試物的毒性的信息可從已經(jīng)檢測的類似化合物、混合物或產(chǎn)物結(jié)果得到，此時(shí)要考慮到已知的具有毒理學(xué)意義的受試物的特性、混合物構(gòu)成的百分比等。在沒有或毒性信息很少的情況下，或者是估計(jì)受試物是具有毒性，需進(jìn)行正式試驗(yàn)。5.4.2.2正常的操作程序下，使用每種性別動物3只，或使用6只敏感性別的動物，暴露水平分別是：氣體20000ppm；蒸氣20mg/L；粉塵/霧5mg/L（如果技術(shù)可達(dá)到）。受試物制備成氣溶膠時(shí)，粒徑的大小需達(dá)到可呼吸性粒子的大?。ㄈ鏜MAD為1μm~4μm）。絕大部分的受試物都能在2mg/L的濃度水平進(jìn)行試驗(yàn)。如進(jìn)行高于2mg/L濃度水平的氣溶膠試驗(yàn)，受試物應(yīng)能夠制備成可呼吸性粒子大小。從動物福利方面考慮，GHS不主張超過限度濃度的試驗(yàn)。5.4.2.3只在有可能直接涉及到人類健康需要的情況下才進(jìn)行GHS中第5類物質(zhì)濃度水平的試驗(yàn)，并需在試驗(yàn)報(bào)告中論述理由。對潛在爆炸性受試物試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)要認(rèn)真研究避免引起發(fā)生爆炸的條件出現(xiàn)。為了避免不必要的使用動物，開始限度試驗(yàn)前，需在染毒系統(tǒng)不放置動物的條件下進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，以確認(rèn)染毒條件是否能達(dá)到限度試驗(yàn)的水平。5.4.3觀察5.4.3.1暴露期間要對實(shí)驗(yàn)動物經(jīng)常進(jìn)行臨床觀察。暴露染毒結(jié)束后的當(dāng)日至少要觀察2次，還可根據(jù)動物對染毒的反應(yīng)增加觀察次數(shù)；此后的14d內(nèi)至少每日觀察1次。觀察期期限的長短不是固定不變的，需要根據(jù)臨床癥狀出現(xiàn)的性質(zhì)、時(shí)間以及體征消失的長短來決定。毒性體征出現(xiàn)和消失的時(shí)間是十分重要的，應(yīng)特別注意是否存在毒性體征延遲出現(xiàn)的傾向，對每只動物的所有的觀察都要分別作系統(tǒng)的記錄。5.4.3.2對處于瀕死的動物和表現(xiàn)出嚴(yán)重的疼痛和/或持續(xù)的嚴(yán)重痛苦的動物從動物福利考慮要人道的處死。對最初出現(xiàn)的微弱的毒性體征和由于暴露操作引起的短暫的呼吸道的異常改變等臨床體征要認(rèn)真分析區(qū)別，不要錯誤認(rèn)為這些都是染毒處理引起的毒性作用。要按照列在人道觀察終點(diǎn)的指南文件中“人道終點(diǎn)”的原則和標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作。對人道處死的或發(fā)現(xiàn)已經(jīng)死亡的動物處死和死亡時(shí)間要盡可能的準(zhǔn)確的記錄?；\外觀察包括動物皮膚和被毛、眼和粘膜、呼吸、循環(huán)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的改變，以及身體活動和行為方式等變化。盡可能的注意局部作用與系統(tǒng)作用之間的任何差別。關(guān)注點(diǎn)主要為顫動、抽搐、流涎、腹瀉、嗜睡、睡眠和昏迷。測定直腸溫度或許可為是否存在對實(shí)驗(yàn)動物的處理或在固定管內(nèi)過度的限制造成反射性呼吸過緩、體溫過低或過高等提供證據(jù)。5.4.4體重進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)環(huán)境期間每只動物至少要稱重一次；染毒當(dāng)日，在開始試驗(yàn)前（第0d）、染毒后的1d、3d、7d（此后每周記錄一次）、死亡時(shí)和染毒后超過1d以后人道處死的動物都要稱量每只動物的體重。體重變化是判定毒性作用的指標(biāo)，并且對于體重持續(xù)低于染毒前體重的20%要給予密切觀察。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)存活動物稱量體重后并人道地處死。5.4.5病理學(xué)所有實(shí)驗(yàn)動物，包括試驗(yàn)期間死亡的、人道處死的動物和動物福利考慮從試驗(yàn)隊(duì)列中退出的，都需進(jìn)行大體解剖檢查。如果動物死亡后不能立即進(jìn)行解剖檢查，應(yīng)將死亡動物放入冰箱的冷藏箱內(nèi)低溫存放，以減少動物尸體的自溶分解。大體尸檢應(yīng)在死亡后1d~2d進(jìn)行。每只動物大體解剖所見的病理學(xué)改變都記錄，特別注意呼吸道出現(xiàn)的任何變化。其他輔助的檢查，包括可能對試驗(yàn)結(jié)果做出解釋的檢查指標(biāo)，如測定存活大鼠的肺臟重量或者對呼吸道進(jìn)行顯微檢查以提供受試物刺激性的證據(jù)等。檢查的器官涉及到染毒后存活24h以上的動物出現(xiàn)大體解剖學(xué)改變的器官、或者已知或預(yù)期可能受到影響的器官。全呼吸道的顯微組織學(xué)檢查或許可為鑒定受試物是否與水發(fā)生反應(yīng)提供非常有價(jià)值的信息，如酸類和吸濕性的受試物。6數(shù)據(jù)和試驗(yàn)報(bào)告6.1數(shù)據(jù)需提供每只動物的體重、大體解剖檢查所見的全部資料。臨床觀察的數(shù)據(jù)需要總結(jié)成表格的形式，包括能表現(xiàn)出每個(gè)試驗(yàn)組使用的動物數(shù)、出現(xiàn)特異性毒性體征的動物數(shù)、試驗(yàn)期間死亡或人道處死的動物數(shù)、每只動物的死亡時(shí)間、詳細(xì)描述毒性作用的發(fā)生、發(fā)展的時(shí)間進(jìn)程和體征的可逆性；大體解剖所見。6.2試驗(yàn)報(bào)告試驗(yàn)報(bào)告需包括以下信息：實(shí)驗(yàn)動物和飼養(yǎng)條件：—飼養(yǎng)籠具的描述：每籠動物的數(shù)量（或動物變化的數(shù)量）、墊料、環(huán)境溫度、相對濕度、光照周期、飼料合格認(rèn)證資料；—使用的動物種屬和品系，不使用大鼠進(jìn)行試驗(yàn)的論證依據(jù)；—動物的數(shù)量、周齡和性別；—隨機(jī)選擇分組的方法；—動物食物、飲水的質(zhì)量（包括飼料的類型/來源和供水的來源）；—試驗(yàn)前的所有的包括飼料、檢疫、疾病的處理等描述。受試物：—物理性狀、純度、相關(guān)的理化性質(zhì)（包括同分異構(gòu)體）；—受試物特征性數(shù)據(jù)和化學(xué)文摘（CAS）注冊號（如果已知）。溶媒:—如果不是用水作為載體溶媒，所用的溶媒是什么，對采用這種溶媒的理由作出論述；—可證明所使用的溶媒不會干擾研究結(jié)果的既往歷史數(shù)據(jù)或平行對照數(shù)據(jù)。吸入染毒裝置：—吸入染毒裝置的描述包括大小尺度和體積；—除了描述制備染毒空氣操作外，還需動物暴露所用設(shè)備及其來源進(jìn)行描述；—測定氣溫、濕度、粒徑大小和實(shí)際濃度的儀器設(shè)備；—空氣的來源、空氣供給/解壓處理、調(diào)節(jié)供給條件所使用的系統(tǒng)；—確保試驗(yàn)空氣均勻所使用的調(diào)節(jié)設(shè)備和方法；—壓差（正壓或負(fù)壓）；—每個(gè)吸入裝置動物暴露孔的數(shù)量（口鼻式染毒裝置）；每個(gè)染毒裝置容納動物的格位數(shù)量（全身染毒裝置）；—試驗(yàn)時(shí)空氣中受試物的均勻性、穩(wěn)定性；—溫度和濕度感受器、采樣孔所在的部位；—空氣流速，包括口鼻式固定孔處的空氣流速、全身染毒柜內(nèi)放置動物處的空氣流速；—如果測定了空氣中氧氣和二氧化