第二十六章 基因工程藥物課件

第二十六章

基因工程藥物

張馳副教授第二十六章基因工程藥物new第一節(jié)概述第二十六章基因工程藥物new基因工程是通過對目的基因的摻入，拼接和重組而實現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，再借助質(zhì)粒，病毒或其他載體將目的基因轉移到新的宿主細胞系統(tǒng)內(nèi)進行復制和表達的新技術。基因工程是現(xiàn)代生物技術的主體及核心。又稱DNA重組，基因克隆等。定義基因工程技術最成功的應用就是用于生物治療的新型生物藥物的研制。1982年人胰島素在美國的問世，帶來了巨大的經(jīng)濟和社會效益。生物技術用于疾病的預防和疑難雜癥的治療已經(jīng)成為了現(xiàn)實。第二十六章基因工程藥物new主要的人和事第二十六章基因工程藥物new第二十六章基因工程藥物new第二十六章基因工程藥物new第二十六章基因工程藥物new第二十六章基因工程藥物new第二十六章基因工程藥物new第二十六章基因工程藥物new第二十六章基因工程藥物new第二十六章基因工程藥物new第二十六章基因工程藥物new第二十六章基因工程藥物new發(fā)展現(xiàn)狀美國作為最早開展基因及基因工程研究的國家，自基因工程誕生以來處于世界領先地位。擁有生物技術公司2000余家，其中300余家上市公司。歐洲約有1000余家生物技術公司。亞洲的日本，韓國和印度也獲得了極大的發(fā)展。我國生物技術起步較晚，但是受到了國家的高度重視，發(fā)展速度也是十分驚人。1997年我國自主生產(chǎn)了第一個基因工程藥物重組干擾素。目前世界上排名前十位的重要基因工程藥物我國都能自主生產(chǎn)。我國已批準上市的基因工程藥物和疫苗表26-1第二十六章基因工程藥物new基因工程藥物的特點穩(wěn)定性差，易腐敗。使用用量低，藥理活性高。具有細胞和組織特異性。給藥方式有特定要求。第二十六章基因工程藥物new主要的基因工程藥物第二十六章基因工程藥物new基因工程技術的優(yōu)點可以大量生產(chǎn)過去難以獲得的生理活性蛋白和多肽（如胰島素、干擾素、細胞因子等），為臨床使用提供有效的保障?？梢蕴峁┳銐驍?shù)量的生理活性物質(zhì)，以便對其生理、生化和結構進行深入的研究，從而擴大這些物質(zhì)的應用范圍。利用基因工程技術可以發(fā)現(xiàn)、挖掘更多的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)。利用基因工程技術改良藥物，獲得新型化合物，擴大藥物篩選來源。

第二十六章基因工程藥物new基因工程菌的制備目的基因的獲取載體的制備目的基因與載體的連接轉化轉化子的鑒定和鑒別第二十六章基因工程藥物new目的基因的獲取反轉錄法以富含目的基因的實驗材料提取RNA，在逆轉錄酶的作用下獲得cDNA，以此為模板進行PCR擴增，最終合成編碼多肽的雙鏈DNA序列，這是制取真核生物目的基因常用的方法。人工合成法化學合成法：利用特殊的化學試劑將相鄰的兩個核苷酸以3’,5’-磷酸二酯鍵

相連，逐漸延長獲得目的基因序列。聚合酶鏈式反應：根據(jù)已經(jīng)基因的核苷酸序列，設計引物，利用PCR技術分

段和成基因片段最終獲得全長基因。第二十六章基因工程藥物new載體的制備外源基因必須導入適合的細胞內(nèi)才能實現(xiàn)克隆，表達。這一過程依賴于載體的轉運，外源基因片段與載體連接是DNA重組技術的關機步驟之一。根據(jù)受體細胞的不同，載體的選擇也是不同的，主要包括以下載體：質(zhì)粒載體λ噬菌體柯斯質(zhì)粒單M13噬菌體動植物病毒的衍生物第二十六章基因工程藥物new質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體是存在于細菌（酵母）細胞質(zhì)中的一種獨立于染色并能自主復制的一類遺傳物質(zhì)。大多數(shù)質(zhì)粒成環(huán)狀。通常是游離于染色體之外單獨復制，也可在特殊狀況下整合入基因組DNA中共同復制。提取大量完整的質(zhì)粒是制備重組質(zhì)粒的前提基礎。（天然：pSC，RDF；改進：pUC，pBR，pET）第二十六章基因工程藥物newλ噬菌體載體

λ噬菌體基因組長度48.5kb，基因組中處的一連串基因并非噬菌體形成所必需的，若用外源DNA片段取代這個區(qū)域，不會影響噬菌體的形成，這也是λ噬菌體能夠作為質(zhì)粒載體的的前提條件。通過人工改造得到的λ噬菌體載體可以分為插入型和替換型。插入型：可用于組建cDNA文庫，可容納10kb以下的片段。（組織細胞特異性）替換型：可用于組建基因組文庫，容納20kb左右的片段。第二十六章基因工程藥物new柯斯質(zhì)粒載體

柯斯質(zhì)粒是一類人工構建的特殊質(zhì)粒載體。含有λDNA的cos序列，質(zhì)粒復制子，抗藥性標記，一種或幾種限制性內(nèi)切酶單一位點。具有λ噬菌體和質(zhì)粒的優(yōu)越性，又具有高容量的克隆能力，容納外源DNA的長度可達45kb。腺病毒載體

腺病毒可以攜帶外源基因通過受體介導的內(nèi)吞作用進入細胞核內(nèi)，但不整合入基因組中，實現(xiàn)高效轉染，復制。轉染效率達100%。脂質(zhì)體載體

是一種人工膜，可以和細胞膜融合從而實現(xiàn)外源基因的轉染，可以做到緩釋，毒性低。第二十六章基因工程藥物new方法一：加同聚尾連接。

用3‘末端脫氧核苷酸轉移酶催化，使載體與cDNA的3’末端帶上互補的同型多聚體序列，如載體加上polyC（或A）的尾巴，則cDNA加上polyG（或T）的尾巴，這兩種粘性末端只能使載體與cDNA連接而不能自我環(huán)化，借助同型多聚體的退火作用形成重組分子，最后用T4DNA連接酶封口。優(yōu)點：不易自身環(huán)化。因為載體和外源片段的末端是互補的粘性末端，所以連接效率較高。用任何一種方法制備的DNA都可以用這種方法進行連接,通用性好。目的基因與載體的連接第二十六章基因工程藥物new第二十六章基因工程藥物new方法二：加人工接頭連接用T4DNA連接酶在平末端接上人工接頭可以使DNA發(fā)生連接。所謂人工接頭是指人工合成的、連接在目的基因兩端的含有某些限制酶切位點的寡核苷酸片段。cDNA連上人工接頭后，用該種限制酶酶切就可得到粘性末端，從而能夠與載體連接；cDNA中也可能也帶有同樣的限制酶切點，為了保護cDNA不受限制酶破壞，可在加接頭前用甲基化酶修飾這些限制酶切位點。目的基因與載體的連接T4DNA連接酶既可以“縫合”雙鏈DNA片段互補的黏性末端，又可以“縫合”雙鏈DNA片段的平末端，但連接平末端之間的效率比較低。第二十六章基因工程藥物newCCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-第二十六章基因工程藥物new宿主細胞轉化含目的基因的表達載體構建完成后，需要導入宿主菌種進行擴增或表達，通常采用轉化法。所謂轉化就是指在特殊狀態(tài)下即感受態(tài)狀態(tài)時，可攝取外源遺傳物質(zhì)，攝入的外源物質(zhì)可以單獨復制也可以整合到宿主細胞染色體一同復制，是宿主菌具有新的形狀。宿主細胞感受態(tài)的制備有多種方法包括：冷氯化鈣，氯化鋁，電轉法等。重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒野生型E.coli感受態(tài)細胞CaCl2低溫短暫熱刺激或電擊第二十六章基因工程藥物new熱激法：大腸桿菌在0℃CaCl2低滲溶液中，細菌細胞膨脹成球形，轉化混合物中的DNA形成抗DNase的羥基－鈣磷酸復合物粘附于細胞表面，經(jīng)42℃短時間熱沖擊處理，促進細胞吸收DNA復合物，在豐富培養(yǎng)基上生長數(shù)小時后，球狀細胞復原并分裂增殖。在被轉化的細胞中，重組子基因得到表達，在選擇性培養(yǎng)基平板上可挑選所需的轉化子。

電擊法：使用瞬時高壓電處理細胞懸液，微生物細胞膜在高壓電的作用下發(fā)生去極化，產(chǎn)生微孔，懸液中溶解的核酸即可通過細胞膜上的孔洞進入細胞內(nèi)部。這種方法很直接，轉化效率很高。做酵母等真核生物轉化時一般都是電擊。轉化方法第二十六章基因工程藥物new轉化子的篩選和鑒定重組質(zhì)粒轉化的細胞在全部受體細胞中只占極少數(shù)，需要從大量細胞中篩選出海鷗重組子的菌株，主要的方法有抗藥性篩選，單菌落快速電泳，序列測定，Southern印跡雜交等?？剐耘囵B(yǎng)基篩選第二十六章基因工程藥物new單菌落快速電泳單菌落不需培養(yǎng)擴增，快速裂解單菌落，使內(nèi)部的質(zhì)粒釋放出來，直接上電泳檢測，判斷是否還有重組質(zhì)粒，也可以配合以PCR檢測是否能擴增出目的基因。第二十六章基因工程藥物new序列測定Sanger雙脫氧鏈終止法是FrederickSanger于1975年發(fā)明的。測序過程需要先做一個PCR。過程中，雙脫氧核糖核苷酸（ddNTP）可能隨機的被加入到正在合成中的DNA片段里。由于雙脫氧核糖核苷酸多脫了一個氧原子，一旦它被加入到DNA鏈上，這個DNA鏈就不能繼續(xù)增加長度。最終的結果是獲得所有可能獲得的、不同長度的DNA片段。目前最普遍最先進的方法，是將雙脫氧核糖核苷酸進行不同熒光標記。將PCR反應獲得的總DNA通過毛細管電泳分離，跑到最末端的DNA就可以在激光的作用下發(fā)出熒光。由于ddATP,ddGTP,ddCTP,ddTTP（4種雙脫氧核糖核苷酸）熒光標記不同，計算機可以自動根據(jù)顏色判斷該位置上堿基究竟是A，T，G，C中的哪一個。第二十六章基因工程藥物newSouthern印跡雜交一是將待測定核酸分子通過一定的方法轉移并結合到一定的固相支持物（硝酸纖維素膜或尼龍膜）上，即印跡（blotting）；二是固定于膜上的核酸與同位素標記的探針在一定的溫度和離子強度下退火，即分子雜交過程。第二十六章基因工程藥物new基因表達基因表達是指結構基因在生物體中轉錄，翻譯以及后加工過程。以下是主要的表達系統(tǒng)：大腸桿菌表達系統(tǒng)酵母表達系統(tǒng)植物細胞表達系統(tǒng)昆蟲細胞表達系統(tǒng)動物細胞表達系統(tǒng)第二十六章基因工程藥物new1.宿主菌的選擇容易獲得較高濃度的細胞；能利用易得廉價原料；不致病、不產(chǎn)生內(nèi)毒素；發(fā)熱量低，需氧低，適當?shù)陌l(fā)酵溫度和細胞形態(tài)；容易進行代謝調(diào)控；容易進行DNA重組技術操作；產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)率高，產(chǎn)物容易提取純化影響基因表達的因素大腸桿菌枯草桿菌原核酵母，真菌，昆蟲，動物細胞真核第二十六章基因工程藥物new原核細胞大腸桿菌其為不需要修飾蛋白的首選表達宿主細胞。結構功能了解透徹，技術成熟。另外大腸桿菌可以進行高密度培養(yǎng)，培養(yǎng)介質(zhì)簡單，價格低廉，容易操作，優(yōu)化手段豐富。大腸桿菌原核第二十六章基因工程藥物new大腸桿菌中的表達的缺點：不存在信號肽，產(chǎn)品多為胞內(nèi)產(chǎn)物；分泌能力不足，常形成不溶性的包含體，產(chǎn)物須在下游處理過程中經(jīng)過變性和復性處理才能恢復其生物活性；不存在翻譯后修飾作用；翻譯通常從甲硫氨酸的AUG密碼子開始，故目的蛋白質(zhì)的N端常多余一個甲硫氨酸殘基，容易引起免疫反應；產(chǎn)生的內(nèi)毒素難以除去；產(chǎn)生的蛋白質(zhì)酶會破壞蛋白質(zhì)。原核第二十六章基因工程藥物new枯草芽孢桿菌

分泌能力強，可以將蛋白質(zhì)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中，不形成包含體。該菌也不能使蛋白質(zhì)產(chǎn)物糖基化，另外由于它有很強的胞外蛋白酶，會對產(chǎn)物進行不同程度的降解，因此在外源基因克隆表達的應用中受到影響枯草芽孢桿菌原核第二十六章基因工程藥物new鏈霉菌其是重要的工業(yè)微生物，近年來作為外源基因表達體系正日益受到人們的重視。其主要特點是：不致病、使用安全，分泌能力強，可將表達產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中，具有糖基化能力，變鉛青鏈霉菌限制修飾能力弱，可以作為理想的受體菌?，F(xiàn)已構建了一系列有效的載體，下游培養(yǎng)工藝也已經(jīng)成熟。鏈霉菌原核第二十六章基因工程藥物new酵母研究基因表達調(diào)控的最有效的單細胞真核生物。特點：①真核生物細胞，故有后翻譯過程；②基因組小，僅為大腸桿菌的4倍；③世代時間短，有單倍體和雙倍體兩種形式；④基因操作與原核生物相似；⑤可以建立有分泌功能的表達系統(tǒng)，將產(chǎn)物分

泌出胞外，分離純化工藝相對簡單。釀酒酵母真核真核細胞第二十六章基因工程藥物new絲狀真菌特點：有很強的蛋白分泌能力；能正確進行翻譯后加工，包括肽剪切和糖基化等，而且其糖基化方式與高等真核生物相似；絲狀真菌（如曲霉等）等又確認是安全菌株，有成熟的發(fā)酵和后處理工藝哺乳動物細胞哺乳動物細胞由于外源基因的表達產(chǎn)物可由重組轉化的細胞分泌到培養(yǎng)液中，細胞培養(yǎng)成分完全由人控制，從而使產(chǎn)物純化變得容易。哺乳動物細胞分泌的基因產(chǎn)物是糖基化的，接近或類似于天然產(chǎn)物。但動物細胞生產(chǎn)慢，產(chǎn)率低，且培養(yǎng)條件苛刻，費用高，培養(yǎng)液濃度較稀。第二十六章基因工程藥物new表達體系綜述雖然各種微生物從理論上來說都可以用于基因表達，但由于克隆載體、DNA導入方法以及遺傳背景等方面的限制，目前使用最廣泛的宿主菌還是大腸桿菌

和酵母。一方面它們的遺傳背景研究得比較清楚，建立了許多適合它們的克隆載體和DNA導入方法，另一方面許多外源基因在這兩種宿主菌中表達成功，積累了許多實際操作經(jīng)驗。當然，現(xiàn)在我們不僅要繼續(xù)利用大腸桿菌和酵母，研究清除影響基因表達的各種因素之間的關系，提出更有效的解決方法，而且還要尋找更好的適合于不同外源基因表達的微生物宿主菌。第二十六章基因工程藥物new大腸桿菌表達體系的優(yōu)點：積累了充足經(jīng)驗，有多種載體可供應用；操作安全，致病能力低；技術操作簡便，培養(yǎng)條件簡單，成本相對低得多，大規(guī)模發(fā)酵經(jīng)濟；真核生物的基因先在原核體系上構建克隆，稱為亞克隆（sub-clone），然后采用其它方式轉移至真核細胞上表達。2.大腸桿菌體系中的基因表達第二十六章基因工程藥物new2.1載體表達載體必須具備的條件載體能獨立地進行復制：載體本身就是一個復制子，具有復制起點，分為嚴緊型和松弛型，前者伴隨染色體的復制而復制，在宿主細胞中拷貝數(shù)僅1~3個，后者的復制不依賴于宿主細胞，在宿主細胞中拷貝數(shù)可高達3000個應具有靈活的克隆位點和方便的篩選標記，以利于外源基因的克隆、鑒定和篩選，且克隆位點位于啟動子序列后，以便外源基因表達應具有很強的啟動子，能為大腸桿菌的RNA聚合酶所識別。第二十六章基因工程藥物new2.1載體表達載體必須具備的條件應具有阻遏子，使啟動子受到控制，只有當誘導時才進行轉錄。應具有很強的終止子，以便使RNA聚合酶集中力量轉錄克隆的外源基因，而不轉錄其他無關的基因，同時，很強的終止子所產(chǎn)生的mRNA較為穩(wěn)定。所產(chǎn)生的mRNA必須具有翻譯的起始信號，即起始密碼AUG和SD序列，以便轉錄后能順利翻譯。第二十六章基因工程藥物new第二十六章基因工程藥物newpBV220系統(tǒng)（質(zhì)粒載體系統(tǒng)）特點：質(zhì)粒拷貝數(shù)較多，小量簡便快速抽提可滿足需求。溫度誘導，外源基因的表達量可達到細胞總蛋白的20%-30%.正常情況下，產(chǎn)物以包含體的形式存在與細胞內(nèi)，表達產(chǎn)物不易被降解，均一性好。pBV220系統(tǒng)大腸桿菌常用載體第二十六章基因工程藥物new特點：克隆宿主與表達宿主分離?？芍苯硬迦?。表達量可達總蛋白的50%。有NedI，NcoI酶切位點，切開后直接出現(xiàn)ATG用于表達。帶有組氨酸標簽，可用于純化。

pET系統(tǒng)pET系統(tǒng)第二十六章基因工程藥物new2.2提高目的基因在大腸桿菌中的表達提高翻譯水平：增加mRNA的穩(wěn)定性；調(diào)整SD序列與ATG之間的距離；

選擇偏好性密碼子。生長與表達過程分離：減少宿主菌的代謝負荷，讓宿主菌專一性的復制

重組合質(zhì)粒達到一定數(shù)量后再誘導表達。提高表達產(chǎn)物穩(wěn)定性：組建融合蛋白；定點突變，改變二硫鍵位置；選

用突變菌種；采用表達分泌蛋白的載體（信號肽，

從胞質(zhì)到間質(zhì)）。第二十六章基因工程藥物new2.3真核基因在大腸桿菌中的表達形式融合蛋白的形式短的原核多肽與真核蛋白結合，氨基端為原核序列，羧基端為真核系列。不易被降解，操作簡單，穩(wěn)定，高表達，只能做抗原。非融合蛋白形式不存在細菌肽，完全是外源蛋白形式，容易被降解，有甲硫氨酸，易發(fā)生免疫發(fā)應。分泌型蛋白不含起始密碼子編碼的甲硫氨酸，直接能分泌到胞外。但產(chǎn)量不高，信號肽不易被切除。第二十六章基因工程藥物new3.酵母體系中的基因表達酵母具有原核生物和真核生物的雙重特點，與大腸桿菌不同的是酵母可以對異源蛋白進行簡單地翻譯后加工。與哺乳動物不同的是酵母可以在簡單培養(yǎng)基上生長，在各種酵母工程菌中釀酒酵母應用最為廣泛。與其它表達系統(tǒng)一樣，酵母表達體系也包括載體、啟動子等控制序列和宿主細胞3個部分。第二十六章基因工程藥物new3.1載體附加體質(zhì)粒（YEP）復制型質(zhì)粒（YRP）著絲粒質(zhì)粒（YCP）整合型質(zhì)粒（YIP）第二十六章基因工程藥物new3.1載體①YEp類（yeastepisomalplasmid，酵母附加體質(zhì)粒）最為常用。這類載體的復制序列為酵母2質(zhì)粒成分。2質(zhì)粒:是多數(shù)釀酒酵母中天然存在的質(zhì)粒，可獨立復制。將2質(zhì)粒中復制起點區(qū)及REp3基因區(qū)的序列引入載體，就足以維持在大多數(shù)酵母株系中的復制能力。以2質(zhì)粒為基礎的載體，因具有較高的拷貝數(shù)、轉化頻率和穩(wěn)定性而被廣泛使用第二十六章基因工程藥物new②YRp類（yeastreplicationplasmid，酵母復制型質(zhì)粒）復制序列是非2來源的自主復制序列，可來自酵母染色體，也可來自其他生物。此類載體穩(wěn)定性差，拷貝數(shù)也少。③YCp類（yeastcentromericplasmid，酵母著絲粒質(zhì)粒）:可以部分整合到染色體中，在子代細胞中精確地分配，因此有很好的穩(wěn)定性。但它們的拷貝數(shù)只有1個。④YIp類（yeastinteegrativeplasmid，酵母整合型質(zhì)粒）

此類載體含有可與酵母染色體重組的序列，可以完全整合到染色體中一同復制，穩(wěn)定性好，拷貝數(shù)只有一個。第二十六章基因工程藥物new3.2啟動子啟動子是外源基因表達的關鍵構件。酵母表達系統(tǒng)應用的啟動子種類很多主要包括：

組成型誘導型分泌型復合型第二十六章基因工程藥物new4.桿狀病毒表達體系桿狀病毒可在真核細胞中大量表達外源蛋白，應用廣泛，主要特點有：為真核表達系統(tǒng)，可對蛋白進行修飾，加工，轉運，近似天然蛋白。利用多角體強啟動子構建表達體系，高效表達外源蛋白。病毒基因組較大，可以插入較大的DNA片段。在同一個感染的昆蟲細胞內(nèi)表達多個外源蛋白。不感染脊椎動物，安全性高。第二十六章基因工程藥物new5.哺乳動物表達體系由于哺乳動物細胞內(nèi)部存在質(zhì)粒結構，所以只能利用可以感染哺乳動物細胞的病毒作為載體，攜帶外源基因進入進行復制表達。表達體系主要的組成部件包括：原核DNA序列啟動子增強子拼接信號終止信號篩選信號報告基因第二十六章基因工程藥物new

主要基因工程表達體系比較表達體系產(chǎn)物產(chǎn)生部位培養(yǎng)方式提純產(chǎn)物活性潛在危性大腸桿菌多肽蛋白質(zhì)菌體內(nèi)容易一般對原核好不大融合蛋白質(zhì)部分高產(chǎn)對真核差酵母多肽蛋白質(zhì)菌體內(nèi)容易菌體內(nèi)真核的接近不大糖基化蛋白外分泌可高產(chǎn)稍復雜天然產(chǎn)物哺乳動物完整外分泌較難成本高簡單可達天然需注意糖基化蛋白可高產(chǎn)產(chǎn)物致癌第二十六章基因工程藥物new基因工程下游技術主要包括工程細胞的大規(guī)模培養(yǎng)，目的蛋白的分離純化兩個方面。主要步驟和階段：

1.培養(yǎng)液的培養(yǎng)與預處理2.初步純化（粗提）3.高度純化（純化）4.最后純化（精制）工程菌的培養(yǎng)和預處理下游操作的一般流程第二十六章基因工程藥物new工程菌的培養(yǎng)培養(yǎng)的設備機械攪拌罐：常規(guī)發(fā)酵罐，用于好氧菌培養(yǎng)，放大技術成熟，攪拌

易傷害發(fā)酵細胞。氣體提升式發(fā)酵罐：利用氣體的升力帶動流體在整個發(fā)酵罐內(nèi)循環(huán)，

能避免機械攪動造成的細胞損傷。固定床反應器：發(fā)酵時氣泡的表面張力會破壞細胞，為防止兩者接

觸常采用固定板床反應器，將細胞固定在載體上，

并通過微孔氣體分布器將空氣很細的分布在培養(yǎng)液

中不產(chǎn)生氣泡。第二十六章基因工程藥物new培養(yǎng)方式補料分批培養(yǎng)：是指將種子接入發(fā)酵罐中培養(yǎng)一段時間后，間歇的補加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進一步生長的培養(yǎng)方法。避免一次性高濃度基質(zhì)加入對菌體造成的抑制作用。使細胞生長或產(chǎn)物形成處于最佳狀態(tài)。連續(xù)培養(yǎng)：

在連續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基的同時連續(xù)放出發(fā)酵液。使菌體所處的生長，發(fā)酵環(huán)境相對穩(wěn)定，能促使細胞不斷生長合產(chǎn)物不斷形成，連續(xù)收獲產(chǎn)物，對分泌性和非分泌型蛋白都適用。工程菌的培養(yǎng)第二十六章基因工程藥物new培養(yǎng)方式透析培養(yǎng)：利用半透膜原理使代謝產(chǎn)物和培養(yǎng)基分離通過去除培養(yǎng)液中的代謝產(chǎn)物來解除其對菌體的不利影響。固定化培養(yǎng)：將菌體固定在特定載體上能有效提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性，便于進行連續(xù)培養(yǎng)。在連續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基的同時連續(xù)放出發(fā)酵液。使菌體所處的生長，發(fā)酵環(huán)境相對穩(wěn)定，能促使細胞不斷生長合產(chǎn)物不斷形成，連續(xù)收獲產(chǎn)物，對分泌性和非分泌型蛋白都適用。工程菌的培養(yǎng)第二十六章基因工程藥物new發(fā)酵過程的影響因素

⒈培養(yǎng)基的影響培養(yǎng)基的組成既要提高工程菌的生長速率，又要保持工程菌的穩(wěn)定性，使外源基因高效表達。常用的碳源有：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。常用的氮源有：酵母提取液、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米漿、氨水、硫酸

銨、氯化銨等。還有無機鹽、維生素等工程菌的培養(yǎng)第二十六章基因工程藥物new⒉接種量的影響

接種量是指移入的種子液體積和培養(yǎng)液體積的比例。接種量的大小影響發(fā)酵的產(chǎn)量和發(fā)酵周期。接種量?。壕w延遲期較長，使菌齡老化，不利于外源基因表達。接種量大：可縮短生長延遲期，菌體迅速繁衍，很快進入對數(shù)生長

期，適于表達外源基因接種量過高，使菌體生長過快，

代謝物積累過多，反而會抑制后期菌體的生長。第二十六章基因工程藥物new3.溫度的影響

溫度對基因表達的調(diào)控作用表現(xiàn)在對復制，轉錄，翻譯和小分子調(diào)節(jié)分子的合成等水平的影響。它影響各種酶的反應速度，改變菌體代謝產(chǎn)物的反應方向。高溫或低溫都會使發(fā)酵異常，影響終產(chǎn)物的形成并導致減產(chǎn)溫度還影響蛋白質(zhì)的活性和包含體的形成。是工程菌發(fā)酵培養(yǎng)過程中影響菌體代謝的一個重要參數(shù)。對菌體的生長和產(chǎn)物的合成都有著很大的影響。對于好氧發(fā)酵，溶解氧濃度是重要的參數(shù)。好氧微生物利用溶解于培養(yǎng)液中的氧氣進行呼吸。若能提高溶氧速度和氧的利用率，則能提高發(fā)酵產(chǎn)率。4.溶氧第二十六章基因工程藥物new5.誘導時機的影響一般在工程菌的對數(shù)生長期或對數(shù)生長期后進行加溫或加入誘導劑誘導表達，在對數(shù)生長期細胞快速繁殖，菌群數(shù)目倍增，對營養(yǎng)和氧的需求激增，對于營養(yǎng)和溶氧要求很高。

pH對細胞的正常生長和外源蛋白的高效表達都有影響，所以應根據(jù)工程菌的生長和代謝情況，對pH進行適當?shù)恼{(diào)節(jié)如采取兩段培養(yǎng)工藝，培養(yǎng)前期重點是優(yōu)化工程菌的生長條件，其最佳pH在6.8～7.4左右；培養(yǎng)后期重點是優(yōu)化外源蛋白的表達條件,其最佳pH為6.0～6.5。6.

pH值第二十六章基因工程藥物new目標產(chǎn)物的分離主要包括兩個階段。產(chǎn)物的初級分離階段:任務是分粒細胞和培養(yǎng)液，破碎細胞釋放內(nèi)容物，溶解包涵體，復性蛋白質(zhì)，濃縮產(chǎn)物，去除大部分雜質(zhì)。精制純化階段：在初級分離基礎上，利用各種高選擇手段（各種色譜方法）將目標產(chǎn)物和干擾雜質(zhì)盡可能的分開，使產(chǎn)物的純度達到相關要求，最后制成可以儲存，運輸和使用的產(chǎn)品。細胞破碎與固液分離細胞破碎與固液分離屬于初級分離階段第二十六章基因工程藥物new細胞破碎按照是否加作用力分為機械破碎法和非機械破碎法。機械破碎法：高壓勻漿法、超聲破碎法、高速珠磨法、

高壓擠壓法。非機械破碎法：酶溶法、化學滲透法、熱處理法、滲透壓沖擊法。第二十六章基因工程藥物new固液分離分離細胞碎片可以用離心，膜過濾或雙水相分配的方法。離心：高速離心，超速離心。膜過濾：微濾，超濾，反滲透。雙水相萃?。簩⑵扑楹蟮募毎麘乙号c聚乙二醇-無機鹽混合，然后

離心分相。

第二十六章基因工程藥物new精制純化主要是各種色譜分離方法：名稱分離原理吸附層析法組份在吸附劑表面吸附，固定相是固體吸附劑，各能力不同分配層析法各組份在流動相和靜止液相（固相）中的分配系數(shù)不同離子交換層析法固定相是離子交換劑，各組份與離子交換劑親和力不同凝膠層析法固定相是多孔凝膠，各組份的分子大小不同，因而在凝膠上受阻滯的程度不同親和層析法固定相只能與一種待分離組份專一結合，以此和無親和力的其它組份分離第二十六章基因工程藥物new純度及活性檢測純度檢測電泳法，色譜法，質(zhì)譜法，和末端氨基酸分析法。活性檢測

免疫學檢測：放射免疫，酶標法

生物檢測：抗原抗體反應，對細胞，組織和動物的生物功能影響。第二十六章基因工程藥物new第三節(jié)舉例第二十六章基因工程藥物newhGM-CSF第二十六章基因工程藥物newIFN-α第二十六章基因工程藥物new4選擇分離純化方法的依據(jù)（1）根據(jù)產(chǎn)物表達形式來選擇

①分泌型的表達：產(chǎn)物通常體積比較大、濃度低，因此必須在純化之前進行濃縮處理，以盡快縮小樣品的體積，濃縮的方法可用沉淀和超濾第二十六章基因工程藥物new②可溶性表達產(chǎn)物：產(chǎn)物破菌后，其上清液首選親和層析的分離方法，若無單克隆抗體或特異性的配基可用，一般選用離子交換色譜，處于極端等電點的蛋白用離子交換分離可以得到較好的分離效果，能去除大部分的雜質(zhì)第二十六章基因工程藥物new③周質(zhì)表達產(chǎn)物：周質(zhì)表達是介于細胞內(nèi)可溶性表達和分泌表達之間的一種形式獲得：菌體經(jīng)溶菌酶破碎后，一般采用滲透壓休克的方法獲得滲透壓休克:突然改變滲透壓并使細胞發(fā)生物理性破裂第二十六章基因工程藥物new④不溶性的表達產(chǎn)物（包含體）獲得：通過離心，得到變性的包含體，再通過復性劑促使包含體復性，得到目的產(chǎn)品第二十六章基因工程藥物new（2）根據(jù)單元之間的銜接來選擇正確選擇分離純化的次序：盡早采用高效的分離手段，去除主要雜質(zhì)；昂貴、費時的分離單元在最后階段通常先選用非特異性、低分辨率的操作單元，如沉淀、超濾和吸附等，這一階段主要目的是盡快縮小樣品的體積，提高產(chǎn)物的濃度，去除主要的雜質(zhì)隨后采用高分辨率的操作單元，如具有高選擇性的離子交換和親和色譜凝膠過濾色譜這類分離規(guī)模小、分離速度慢的操作單元放在最后，可以提高分辨效率第二十六章基因工程藥物new（3）根據(jù)分離純化工藝的要求來選擇①具有良好的穩(wěn)定性和重復性②要盡可能減少組成工藝的步驟③組成工藝的各技術或步驟之間要相互適應和協(xié)調(diào)、工藝和設備也能相互適應，從而減少步驟之間對物理的處理和條件的調(diào)整第二十六章基因工程藥物new（3）根據(jù)分離純化工藝的要求來選擇④工藝過程中盡量少的使用試劑⑤時間盡可能短⑥工藝和技術必須高效、高收率、易操作，對設備要求低、能耗低⑦具有較高安全性（能去除有危險的污染）第二十六章基因工程藥物new第十一節(jié)變性蛋白的復性包含體：重組蛋白在E.coil中的高水平表達經(jīng)常導致蛋白聚集而形成不溶的、無活性的顆粒，即包含體第二十六章基因工程藥物new大腸桿菌表達的重組蛋白易形成包含體

高效表達的目的蛋白在大腸桿菌內(nèi)形成大量無活性包含體因無法有效的解決復性問題，在美國每年造成的經(jīng)濟損失就達幾十億美元

包含體電鏡圖第二十六章基因工程藥物new包涵體的組成與特性：

一般含有50%以上的重組蛋白，其余為核糖體元件、RNA聚合酶、外膜蛋白等，環(huán)狀或缺口的質(zhì)粒DNA，以及脂體、脂多糖等，大小為0.5-1um，難溶與水，只溶于變性劑如尿素、鹽酸胍等

一般得到包涵體后要進行超生破菌、與可溶性蛋白分離、洗滌、變性溶解、復性，最終拿到你的相對比較純的目的蛋白第二十六章基因工程藥物new包含體可以富集目的蛋白、抗蛋白酶、對宿主的毒性小包含體蛋白復性率低，大大增加了提取成本解決方法：①使重組蛋白在E.coil中表達成可溶性的活性形式②優(yōu)化包含體的復性第二十六章基因工程藥物new一包含體形成的原因高水平表達的結果①重組蛋白高水平表達時，新生肽鏈的聚集速率超過了蛋白的正確折疊速率導致了包含體的形成②重組蛋白表達時，缺乏一些蛋白在折疊過程中需要的酶和輔助因子，如折疊酶和分子伴侶

第二十六章基因工程藥物new二包含體的分離和溶解包含體的分離：①收集重組菌進行破碎（高壓勻漿、超聲破碎等），還可加入一定的溶菌酶

包含體抗剪切力，保持完整結構②離心除去破碎上清后的沉淀部分用含有低濃度的變性劑（尿、鹽酸胍）、去垢劑等緩沖溶液洗滌如需要對包含體進行純化，還可采用蔗糖密度梯度離心的方法第二十六章基因工程藥物new二包含體的分離和溶解包含體的溶解打斷包含體蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的各種化學鍵，使得多肽鏈伸展強的變性劑：脲、鹽酸胍或硫氰酸鹽

鹽酸胍優(yōu)于脲，因為鹽酸胍是較強的變性劑、而且脲中常含有異氰酸鹽或酯會不可逆地修飾蛋白質(zhì)的氨基或巰基第二十六章基因工程藥物new蛋白質(zhì)復性概念將蛋白質(zhì)從結構不規(guī)則、無活性的狀態(tài)，恢復到有唯一立體結構、有生物活性的狀態(tài)的過程稱為蛋白質(zhì)復性。三包含體蛋白復性的方法第二十六章基因工程藥物new三包含體蛋白復性的方法稀釋、透析復性法：除去變性劑、還原劑，促進蛋白復性二硫鍵的復性：①空氣氧化法：利用空氣中的氧氣在折疊期間氧化巰基，金屬離子的存在具有催化作用

②加入氧化-還原轉換試劑③復性前后，氧化型與還原型試劑的恰當使用封閉蛋白的疏水簇復性：疏水簇的存在增加了聚集，用特異性結合疏水簇的單克隆抗體來封閉疏水簇，可減少分子間結合引起的聚集

第二十六章基因工程藥物new凝膠過濾層析復性：①層析介質(zhì)的隔離作用，降低了蛋白之間相互作用產(chǎn)生的凝集，提高了復性濃度和復性率②蛋白經(jīng)過凝膠過濾層析本身可以得到一定的純化小分子添加劑復性：小分子添加劑可以防止蛋白的凝集①穩(wěn)定蛋白的活性狀態(tài)、降低了非正確折疊分子的穩(wěn)定性，增加了折疊中間體的穩(wěn)定性②添加劑并不加快折疊速率，只抑制凝集的發(fā)生第二十六章基因工程藥物new分子伴侶或折疊酶復性：

分子伴侶：一類在序列上沒有相關性但有共同功能的蛋白質(zhì)，它們在細胞內(nèi)幫助其他含多肽的結構完成正確的組裝，而且在組裝完畢后與之分離，不構成這些蛋白質(zhì)結構執(zhí)行功能時的組份應用分子伴侶和折疊酶在體外幫助蛋白復性可以提高復性率，但分離較為繁瑣，增加成本人工分子伴侶復性可加入去垢劑等，形成蛋白-去垢劑復合體，復合體的形成抑制蛋白的聚集，加入環(huán)糊精去除去垢劑，促使蛋白折疊第二十六章基因工程藥物new透析法:簡單;但費時,費緩沖液,蛋白質(zhì)濃度不能過高(容易產(chǎn)生沉淀)快速稀釋法:

最常用的小規(guī)模復性方法;但比較費時,費緩沖液,蛋白質(zhì)的濃度不能高(容易產(chǎn)生沉淀)

超濾透析法:比較省緩沖液,處理量大;但費時,要控制好蛋白質(zhì)濃度凝膠過濾法:

快速,可重復性高,不會產(chǎn)生沉淀,操作復雜一點分子伴侶或折疊酶法：復性率率高，

但分離較為繁瑣，增加成本包含體來源蛋白質(zhì)的復性第二十六章基因工程藥物new①活性蛋白回收率高②正確產(chǎn)物易于分離③折疊復性后能得到濃度較高的蛋白產(chǎn)品④折疊復性方法易于放大⑤復性過程耗時少有效理想的折疊復性方法的特點第二十六章基因工程藥物new第十二節(jié)基因工程藥物的質(zhì)量控制基因工程產(chǎn)品相對于一般藥品，有著許多不同之處①活的細胞作為表達系統(tǒng)來制備產(chǎn)品，產(chǎn)品分子質(zhì)量大、結構復雜②具有顯著效應，在微量情況下就可以發(fā)揮作用，因此，產(chǎn)品的任何性質(zhì)或數(shù)量上的偏差，都可能貽誤病情甚至造成嚴重的傷害③雜質(zhì)多，需嚴格控制產(chǎn)品的有效性、安全性、均一性第二十六章基因工程藥物new第十二節(jié)基因工程藥物的質(zhì)量控制一原材料的控制原材料的質(zhì)量是要確保藥品的DNA序列的準確性，重組微生物來自單一克隆，所用質(zhì)量純而穩(wěn)定，以保證產(chǎn)品質(zhì)量的安全性和一致性，所以原材料的質(zhì)量控制主要是對目的基因、表達載體已經(jīng)宿主細胞的檢查第二十六章基因工程藥物new1目的基因

①需明確目的基因的來源、克隆經(jīng)過②對于改造過的基因應說明被修飾改過的密碼子、被切除的肽段及拼接方法③使用PCR技術擴增得到的基因，應說明擴增的模板、引物及酶反應等情況，并以限制性內(nèi)切酶圖譜和核苷酸序列等分析方法確證基因結構的正確無誤第二十六章基因工程藥物new2表達載體

應提供表達載體的名稱、結構、遺傳特性及其組成部分（如復制子、啟動子等）的來源與功能，構建中所用位點的酶切圖譜，抗生素抗性標記等第二十六章基因工程藥物new3宿主細胞

①需提供宿主細胞的的名稱、來源、傳代歷史、檢定結果及其生物學特性②需闡明載體引入宿主細胞的方法及載體在宿主細胞內(nèi)的狀態(tài)，是否整合到染色體內(nèi)及拷貝數(shù)，并證明宿主細胞與載體結合后的遺傳穩(wěn)定性③提供載體插入基因與表達載體兩側控制區(qū)內(nèi)的核苷酸序列，詳細敘述在生產(chǎn)過程中，啟動與控制克隆基因在宿主細胞中表達的方法和水平第二十六章基因工程藥物new第十二節(jié)基因工程藥物的質(zhì)量控制二培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制

貯存中要求種子純而穩(wěn)定培養(yǎng)過程中，要求質(zhì)粒穩(wěn)定生產(chǎn)發(fā)酵中，工程菌表達穩(wěn)定，能排除外源微生物污染第二十六章基因工程藥物new1生產(chǎn)用細胞庫

基因工程產(chǎn)品的生產(chǎn)采用種子批細胞系統(tǒng)。需證明種子批不含致癌物質(zhì)，無細菌、病毒、霉菌和支原體等污染，再由原始種子批建立生產(chǎn)用工作細胞庫在同一個實驗室工作區(qū)內(nèi)，不得同時操作兩種不同的細胞或菌種，一個工作人員不得同時操作兩種細胞或菌種第二十六章基因工程藥物new2培養(yǎng)過程

培養(yǎng)過程中應測定被表達基因分子的完整性及宿主細胞長期培養(yǎng)后的基因型特征培養(yǎng)周期結束后，應監(jiān)測宿主細胞/載體系統(tǒng)的特性：比如：質(zhì)?？截悢?shù)、宿主細胞中表達載體殘留程度、含插入基因的載體的酶切圖譜等第二十六章基因工程藥物new第十二節(jié)基因工程藥物的質(zhì)量控制三純化過程的質(zhì)量控制保證提純分子批次間保持一致、提純過程中能去除有害物質(zhì)和熱源質(zhì)純化工藝的每一步完成后均應測定收獲物純度，計算提純倍數(shù)、收獲率等，要對每一步的純化效率、活性回收率和蛋白回收率進行檢測，只有當這兩種回收率呈正相關時，純化過程才是有效、可行的第二十六章基因工程藥物new四目標產(chǎn)品的質(zhì)量控制

基因工程的質(zhì)量控制主要包括這些：產(chǎn)品的理化性質(zhì)的鑒別、純度、活性、安全性、穩(wěn)定性和一致性第十二節(jié)基因工程藥物的質(zhì)量控制第二十六章基因工程藥物new1生物活性的測定

多肽或蛋白質(zhì)藥物的生物活性是蛋白質(zhì)藥物的重要質(zhì)量控制指標生物學效價的測定必須采用國際上通用的方法采用在動物體內(nèi)或通過細胞培養(yǎng)進行體外效價測定重組蛋白是抗原，具有相應的抗體或單克隆抗體，可采用放射性免疫分析法或酶標法測定其免疫學活性第二十六章基因工程藥物new2理化性質(zhì)的測定

采用多種方法對重組技術獲得的蛋白質(zhì)藥物產(chǎn)品進行全面的鑒定特異性鑒別、非特異性鑒別、相對分子質(zhì)量測定、等電點測定、肽圖分析、氨基酸組成分析、部分氨基酸序列分析、蛋白質(zhì)二硫鍵分析第二十六章基因工程藥物new3蛋白質(zhì)含量的測定

根據(jù)蛋白質(zhì)的物理、化學性質(zhì)進行測定Folin-酚法、染色法、雙縮尿法、紫外吸收法、HPLC法、凱式定氮法質(zhì)量鑒定中常用的方法是：Folin-酚法、染色法第二十六章基因工程藥物new4蛋白質(zhì)純度分析

蛋白質(zhì)純度分析方法

SDS

等電點聚焦

HPLC

毛細管電泳第二十六章基因工程藥物new第二十六章基因工程藥物new第二十六章基因工程藥物new5雜質(zhì)檢測

蛋白類雜質(zhì)：

①純化過程中殘留的宿主細胞蛋白，可采用免疫學的方法測定

②目的蛋白發(fā)生了某些變化，形成在理化性質(zhì)上與原蛋白極為相似的蛋白雜質(zhì)，比如一些目的蛋白的沉淀等這些目的蛋白的變構體在體內(nèi)往往會產(chǎn)生抗體，因此對這類雜質(zhì)的質(zhì)量控制也要嚴格限定第二十六章基因工程藥物new非蛋白類雜質(zhì)具有生物學作用的