臨床病原體檢測專家講座

臨床病原體檢測芮勇宇南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院檢驗醫(yī)學科臨床病原體檢測第1頁某年9月某日晚上某院急診科來一病人，突然起病，寒戰(zhàn)、猛烈頭痛、惡心嘔吐，面色潮紅、眼結(jié)膜充血、咳嗽，左耳紅腫熱痛，體溫40℃。案例分析臨床病原體檢測第2頁醫(yī)生及時抽血進行血液培養(yǎng)，血常規(guī)白細胞增高及核左移。初步診療敗血癥，收入院，使用泰能。不過使用泰能3天，病人癥狀沒有改進，血液培養(yǎng)陰性，給家眷下病危通知書。案例分析臨床病原體檢測第3頁請南方醫(yī)院教授會診，詳細問詢病史和仔細體查，得到主要線索，病人一周前爬過白云山，并躺在草地上休息；病人左耳有似被蚊蟲叮咬后形成焦痂。案例分析臨床病原體檢測第4頁懷疑恙蟲病，外裴試驗陽性。恙蟲病立克次對頭孢菌素類耐藥，用四環(huán)素類抗生素，1天后退熱，繼續(xù)用藥1周，病人康復出院。病原體檢測主要性：明確臨床診療和指導臨床用藥。案例分析臨床病原體檢測第5頁免疫室：酶鏈免疫吸附試驗（ELISA）、膠體金層析試紙條、化學發(fā)光或電化學發(fā)光、乳膠凝集方法。檢測肝炎病毒、性病、呼吸系統(tǒng)病原體抗原或抗體。檢驗科三個試驗室合作進行病原體檢驗臨床病原體檢測第6頁基因室：熒光定量PCR方法，定量檢測病原體基因。細菌室（重點）：涂片檢驗、培養(yǎng)判定和藥敏試驗，檢測細菌真菌。檢驗科三個試驗室合作進行病原體檢驗臨床病原體檢測第7頁第一部分細菌真菌涂片檢驗及臨床意義第二部分細菌真菌培養(yǎng)判定及臨床意義第三部分細菌真菌藥敏檢測及臨床意義第四部分臨床各科科研工作結(jié)合此次課臨床病原體檢測第8頁Part1Morphologicalexaminationsofbacteriaandfungi1non-stained.2gramstain,bacteriaandfungi.3acid-faststain,acid-fastbacillus.4Indianinkstain,cryptococcus.臨床病原體檢測第9頁single-celled,buddingformscalledyeast(spore).multicellular,filamentousformscalledmold(sporeandhypha).dimorphicfungi,existintwodistinctmorphologicforms.

1Non-stained臨床病原體檢測第10頁Skinscraping,nailscraping,andobservationofhairsdirectlybymicroscopyarealsomosthelpfulindiagnosingdermatophyticinfections.Employingadropofpotassiumhydroxide(15%)onaglassslideoverthesurfaceofthespecimen.臨床病原體檢測第11頁hairs臨床病原體檢測第12頁Skinscraping臨床病原體檢測第13頁Routineurineexamination臨床病原體檢測第14頁Basicprinciple？

Procedure？

Peptidoglycan.crystalviolet,iodine,alcohol.carbofuchsinred.Results,G+orG-,cocciorbacillibacteria,fungi,inoilimmersionfield.2Gram-stained臨床病原體檢測第15頁fungiinurine臨床病原體檢測第16頁positiveculturedblood臨床病原體檢測第17頁positiveculturedblood臨床病原體檢測第18頁positiveculturedblood臨床病原體檢測第19頁positiveculturedblood臨床病原體檢測第20頁positiveculturedblood臨床病原體檢測第21頁positiveculturedblood臨床病原體檢測第22頁sputum臨床病原體檢測第23頁sputum臨床病原體檢測第24頁sputum臨床病原體檢測第25頁sputum臨床病原體檢測第26頁sputum臨床病原體檢測第27頁Fungiinleukorrhea,vaginitis臨床病原體檢測第28頁DiplococcusNeisseriagonorrhoeae臨床病原體檢測第29頁Basicprinciple?Procedure?Lipid.

carbolfuchsinred,hydrochloricacid3%alcohol,methyleneblue.Results,acid-fastbacteriared,otherbacteriaandbackgroundblue.3acid-faststain臨床病原體檢測第30頁TheresultreportmodeNegative,acid-fastbacillinotfound,Positive(1or2),1or2wholevisualfield,Positive（+）,3to9wholevisualfield,Positive（++）,10to99wholevisualfield,Positive（+++）,1to9everyvisualfield,Positive（++++）,>10everyvisualfield.

臨床病原體檢測第31頁acid-fastbacillifromsputum（++++）臨床病原體檢測第32頁Cryptococcusincerebrospinalfluid.Basicprinciple,capsule.Procedure,sediment.Results.

4theIndianinkstain

臨床病原體檢測第33頁Cryptococcusneoformans臨床病原體檢測第34頁germinative臨床病原體檢測第35頁臨床病原體檢測第36頁Advantages.cheap,rapid,diagnoseprimarily.Disadvantages.Notaccurate.Part1Morphologicalexaminationsofbacteriaandfungi臨床病原體檢測第37頁第二部分細菌真菌培養(yǎng)判定及臨床意義一、血液

二、中段尿

三、糞便

四、痰液

五、咽拭子

六、穿刺液

七、分泌物

八、器械臨床病原體檢測第38頁一、血液病原體檢驗

EtiologicExaminationofBloodandBoneMarrow目標和意義；采血指征；采血注意事項;結(jié)果匯報形式。臨床病原體檢測第39頁

當前我國社會老齡化日趨嚴重，慢性病及惡性腫瘤、器官移植、愛滋病和結(jié)核病病人不停增多，侵襲性診療技術(shù)廣泛應用，敗血癥發(fā)病率不停增加。敗血癥病死率30%以上；早期病原學診療和合理抗生素治療，顯著降低敗血癥病死率。臨床病原體檢測第40頁血液培養(yǎng)送檢指征：發(fā)燒>38℃或低溫<36℃；白細胞增多>10×109/L，“核左移”白細胞增多；粒細胞降低，成熟多核白細胞<1×109/L；血小板降低；皮膚粘膜出血；心率>90次/分；呼吸頻率>20次/分；二氧化碳分壓<32mmHg；昏迷；多器官衰竭。臨床病原體檢測第41頁最好在抗生素使用前采集，若已用抗菌藥須，則盡可能避開血藥濃度高峰期，最好在下次用藥前。血液標本采集時間臨床病原體檢測第42頁血液標本采集時間臨床病原體檢測第43頁理想狀態(tài)：在發(fā)燒高峰期前半小時，提議第一次可在病人發(fā)燒早期或高峰期采集，依據(jù)病人發(fā)燒情況，在24h內(nèi)再取2-3次標本，最好每次“雙套”“雙瓶”，“雙套”指不一樣采血部位，“雙瓶”指樹脂瓶和厭氧瓶。血液標本采集時間臨床病原體檢測第44頁臨床病原體檢測第45頁標準血培養(yǎng)瓶（藍色帽）：帽子和標簽紙左上方為藍色，“Standard10Aerobic/F”，用于成人需氧菌和真菌培養(yǎng)，血液量3-10ml，8-10ml最正確。

臨床病原體檢測第46頁中和抗生素樹脂瓶（灰色帽）：帽子和標簽紙左上方為灰色，“PLUS+Aerobic/F”，血液量3-10ml，8-10ml最正確。臨床病原體檢測第47頁厭氧瓶（黃色或橘紅色帽）：帽子和標簽紙左上方為黃色，“StandardAnaerobic/F”，血液量3-7ml，5-7ml最正確。

臨床病原體檢測第48頁中和抗生素兒童瓶（粉紅色帽）：帽子和標簽紙左上方為粉紅色，“PEDSPLUS/F”,血液量1-3ml。臨床病原體檢測第49頁采集標本前先開申請單，到檢驗科細菌室或門診領取血培養(yǎng)瓶；采血前先在培養(yǎng)瓶標簽紙左側(cè)空白處（箭頭所指處）填寫抽血時間和病人科別、床號和姓名；不要在培養(yǎng)瓶條形碼上涂寫，以免影響掃描。臨床病原體檢測第50頁將標簽紙上條形碼右側(cè)部分（含數(shù)字）撕下貼于檢驗申請單上；而其它標本均是將申請單上雙聯(lián)號碼撕下貼于標本上。臨床病原體檢測第51頁注射器采血后，將血培養(yǎng)瓶帽子揭下，橡皮由金屬皮（圍脖）固定于瓶上；將橡皮塞用70%酒精消毒，注射器針頭刺穿橡皮塞將血注入培養(yǎng)瓶內(nèi)；橡皮塞裸露即可。臨床病原體檢測第52頁細菌室接到已采集血液培養(yǎng)瓶后，馬上放入自動血液培養(yǎng)檢測儀，自動培養(yǎng)及實時檢測。臨床病原體檢測第53頁臨床病原體檢測第54頁陽性初步結(jié)果匯報：儀器陽性報警，90%以上陽性標本24h內(nèi)檢出；取出陽性瓶，對血液涂片及革蘭氏染色；馬上將涂片結(jié)果（G+、G-細菌，球菌或桿菌，或真菌）電話通知對應科室，并在網(wǎng)上發(fā)出；利用陽性血液進行K-B法藥敏試驗，第二天將初步藥敏結(jié)果電話通知對應科室。結(jié)果匯報形式臨床病原體檢測第55頁陽性最終止果匯報：將陽性血液接種血平板培養(yǎng)細菌；第二天將血平板上生長細菌判定及MIC法藥敏試驗；第三天發(fā)判定及MIC法藥敏結(jié)果正式匯報。陰性結(jié)果匯報：如培養(yǎng)5天仍為陰性，再接種血平板培養(yǎng)一天，核實為陰性后再發(fā)匯報。結(jié)果匯報形式臨床病原體檢測第56頁二、中段尿標本病原體檢驗

EtiologicExaminationofUrine目標和意義；采集方法;結(jié)果匯報形式。臨床病原體檢測第57頁檢測泌尿系統(tǒng)感染；普通進行細菌和真菌培養(yǎng)、菌落計數(shù)和藥敏；也可離心后對沉渣進行涂片檢驗，革蘭氏染色或抗酸染色；也可用于淋球菌培養(yǎng)和涂片檢驗。目標和意義臨床病原體檢測第58頁最常采集中段尿，晨起第一次尿送檢最正確；先用肥皂水、或1：1000高錳酸鉀水溶液沖洗女性外陰部及尿道口或男性尿道口，再用滅菌水清洗，最終用滅菌紗布檫拭；排尿棄去前段尿，留取中段尿約10ml于無菌容器內(nèi)加蓋送檢。采集方法臨床病原體檢測第59頁尿道病原菌可在溫暖尿液中繁殖，中段尿標本采集后應盡快送檢，不然將影響病原菌計數(shù)準確性；排尿困難者可導尿，防止屢次導尿所致尿路感染，導尿包必須為無菌合格產(chǎn)品。采集方法臨床病原體檢測第60頁“培養(yǎng)出3種以上細菌，疑采集污染，重留標本”：如培養(yǎng)出3種或以上細菌，且無優(yōu)勢菌；約10%標本不合格，采集時污染，采集中段尿（尤其女性）最好由專門醫(yī)護人員指導采集，以降低污染。結(jié)果匯報形式臨床病原體檢測第61頁“培養(yǎng)出少許某種細菌、菌落計數(shù)結(jié)果”：如菌量較少<103ml，但為單一菌種，可能為采集時污染，也可能是真正感染，臨床醫(yī)生可依據(jù)病人臨床表現(xiàn)判斷或再留取標本送檢。結(jié)果匯報形式臨床病原體檢測第62頁“培養(yǎng)出某種細菌、菌落計數(shù)結(jié)果、藥敏結(jié)果”：普通認為細菌或真菌>105／ml，且必須有優(yōu)勢，才能夠確定為感染，對優(yōu)勢菌進行判定和藥敏。104／ml至105／ml，也有意義。結(jié)果匯報形式臨床病原體檢測第63頁三、糞便標本病原體檢驗

EtiologicExaminationofStool目標和意義：對腸道疾病進行病原學診療；涂片染色：查真菌、弧菌、球菌/桿菌比；培養(yǎng)病原菌和藥敏：培養(yǎng)沙門氏和志賀菌；培養(yǎng)弧菌；培養(yǎng)真菌；菌群失調(diào)病人，對占優(yōu)勢細菌進行判定藥敏。臨床病原體檢測第64頁標本采集：挑取含膿、血或粘液糞便約2-3g；置于清潔容器或置于保留液中送檢；排便困難者或嬰幼兒可用直腸拭子采集。臨床病原體檢測第65頁檢驗上下呼吸道感染痰液（下呼吸道）和咽拭子（咽喉部）；可進行涂片查細菌、真菌或抗酸桿菌；可進行細菌、真菌或結(jié)核桿菌培養(yǎng)；上述檢驗只要一口痰即可，在一張檢驗申請單上選上述多個項目。四和五、呼吸道標本病原體檢驗臨床病原體檢測第66頁采集深部痰（sputum），不是唾液和口水；自然咳痰法(Expectoratedsputum)；最好為清晨第一口痰，用清水重復漱口用力咳出第一口痰于無菌容器內(nèi)；支氣管鏡采集法（Bronchoscopy）。采集方法

臨床病原體檢測第67頁報“正常菌群”：培養(yǎng)出均為不致病細菌；培養(yǎng)出細菌種類較多且無優(yōu)勢菌；分離出少許嗜血桿菌,也匯報判定及藥敏。結(jié)果匯報形式

臨床病原體檢測第68頁報“無菌生長”：病人抗生素使用過分造成；可能病毒、支原體、衣原體等血平板無法培養(yǎng)。結(jié)果匯報形式

臨床病原體檢測第69頁報“分離出某種細菌或真菌，百分比，藥敏”：分離出致病菌，而不是常見正常菌群，且含有優(yōu)勢，約占血平板菌群總數(shù)百分比%；同一病人如痰中連續(xù)分離出同一個菌，3天內(nèi)假如已經(jīng)做過藥敏試驗，則不再做藥敏；同一病人痰中細菌種類和百分比，會伴隨治療情況改變，也受留取痰標本質(zhì)量影響。結(jié)果匯報形式

臨床病原體檢測第70頁六、穿刺液（腦脊液）病原體檢驗

Etiologic

ExaminationofCerebrospinalFluid目標和意義：判斷是否為感染性疾病腦脊液采集：經(jīng)過腰椎穿刺術(shù)（Lumberpuncture）以無菌操作采集腦脊液3-5ml于無菌小瓶或無菌試管中，普通第一管用于微生物學檢驗；臨床病原體檢測第71頁六、穿刺液（腦脊液）病原體檢驗

Etiologic

ExaminationofCerebrospinalFluid引發(fā)腦膜炎病原體腦膜炎奈瑟菌等抵抗力弱，不耐冷，故采集腦脊液應馬上保溫送檢或床邊接種;可查普通細菌真菌、隱球菌、抗酸桿菌。臨床病原體檢測第72頁其它穿刺液：如胸腹水、關(guān)節(jié)腔液等，穿刺針注入無菌拭子管送檢或?qū)⒆⑸淦髦苯铀蜋z；如為多管穿刺液或相關(guān)組織，請在申請單上注明是否都做培養(yǎng)判定；采集注意事項：注意無菌操作；如培養(yǎng)出類白喉桿菌，常為采集時污染所致；可用血液培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。臨床病原體檢測第73頁七、分泌物（傷口或膿液）病原體檢驗開放性化膿灶：應先用滅菌生理鹽水沖洗表面污染菌，再用棉拭子蘸取或注射器吸收膿性分泌物；瘺管內(nèi)膿液：先用滅菌棉拭子擠壓瘺管棄去前端膿液，再搜集膿汁；臨床病原體檢測第74頁七、分泌物（傷口或膿液）病原體檢驗封閉性膿腫：可用注射器穿刺抽取；疑為厭氧菌感染者：取膿液后馬上排凈注射器內(nèi)空氣，針頭插入無菌橡皮塞送檢；如為液體，最好床旁接種厭氧血培養(yǎng)瓶；外界相通部位標本，如痰不能作厭氧菌培養(yǎng)。臨床病原體檢測第75頁七、分泌物（生殖道）病原體檢驗

EtiologicExaminationofSTDs性傳輸疾病，簡稱性病，是一組經(jīng)過性行為傳輸，侵犯皮膚、性器官和全身多臟器損害感染性疾病；標本采集：常取生殖道分泌物，男性取尿道口分泌物或前列腺液，女性取外陰糜爛面病灶邊緣分泌物、陰道宮頸口分泌物等。臨床病原體檢測第76頁淋病（gonorrhea）涂片染色鏡檢：急性淋菌性尿道炎敏感度和特異度高達90%以上；對慢性無癥狀淋病女性患者涂片檢驗漏診率達40%，故必須同時進行培養(yǎng)。培養(yǎng)判定及藥敏結(jié)果準確，診療金標準。臨床病原體檢測第77頁解脲/人型支原體：細菌室開展了培養(yǎng)判定及藥敏方法；需注意是標本采集后應盡快送檢。診療試劑和方法要符合衛(wèi)生部相關(guān)要求；注意保護病人隱私。臨床病原體檢測第78頁八、器械病原體檢驗

EtiologicExaminationofotherspecimens靜脈插管等標本：放入無菌拭子管中送檢；無菌試驗：懷疑醫(yī)療用具被污染時送檢；空氣培養(yǎng)：到細菌室取培養(yǎng)平皿置于待測地點，打開平皿蓋10min，蓋上后送檢；醫(yī)護人員手培養(yǎng)和物表培養(yǎng)：到細菌室取含消毒劑中和液無菌試管，用棉簽涂抹后放入試管中送檢。臨床病原體檢測第79頁第三部分細菌真菌藥敏檢測及臨床意義藥敏結(jié)果檢驗匯報解讀，細菌分布及藥敏結(jié)果分析。臨床病原體檢測第80頁藥敏結(jié)果檢驗匯報解讀臨床病原體檢測第81頁MIC稀釋法（dilutionmethod）K-B紙片擴散法（Kirby-Bauermethod）E-test藥敏檢測慣用藥敏試驗方法臨床病原體檢測第82頁K-B法是將含有定量抗菌藥品紙片，貼在已接種測試菌瓊脂平板上，紙片中所含藥品吸收瓊脂中水分溶解后，不停向紙片周圍擴散形成遞減梯度濃度。K-B紙片擴散法藥敏試驗臨床病原體檢測第83頁K-B法藥敏試驗不一樣抗生素紙片細菌接種于MH平板量取直徑臨床病原體檢測第84頁MIC稀釋法普通在瓊脂或肉湯中將抗菌藥品系列對倍稀釋，定量接種待檢菌，35℃培養(yǎng)18至24小時后觀察結(jié)果；抑制檢測菌肉眼可見生長最低藥品濃度，即最小抑菌濃度；MIC稀釋法結(jié)果以MIC（μg/ml）數(shù)值匯報，數(shù)值越小越敏感，與K-B法相反；MIC稀釋法藥敏檢測臨床病原體檢測第85頁臨床病原體檢測第86頁稀釋法結(jié)果比K-B法更準確。本試驗室利用細菌自動判定和藥敏儀，為稀釋法藥敏試驗，由儀器自動判斷藥敏結(jié)果。藥敏檢測方法臨床病原體檢測第87頁BDPhoenix100細菌自動判定及藥敏分析儀臨床病原體檢測第88頁MIC稀釋法藥敏判定孔生化試驗細菌判定孔臨床病原體檢測第89頁E-test藥敏檢測結(jié)合K-B法和稀釋法優(yōu)點；原理同稀釋法檢測，操作同K-B法簡單；試紙條上含干化、穩(wěn)定、濃度由高到低呈指數(shù)梯度分布某種抗菌藥品；主要用于少數(shù)抗生素結(jié)果驗證。臨床病原體檢測第90頁E-test藥敏檢測臨床病原體檢測第91頁臨床試驗室標準化委員會（clinicallaboratorystandardsofinstitute,CLSI）標準判斷敏感（susceptible，S）：推薦使用；中介（intermediate，I）：藥品MIC靠近體液或組織可到達藥品濃度，但反應低于敏感株；耐藥（resistant，R）；指常規(guī)用藥劑量不能到達MIC，臨床療效不可靠。藥敏檢測方法臨床病原體檢測第92頁抗菌藥品作用靶位臨床病原體檢測第93頁氨基糖甙類：阿米卡星Amikacin、慶大霉素Gentamicin1代頭孢：頭孢唑啉Cefazolin2代頭孢：頭孢呋辛鈉Cefuroximesodium3代頭孢：頭孢他啶Ceftazidime、頭孢噻肟Cefotaxime、頭孢吡肟（馬斯平）Cefepime細菌室藥敏試驗中常選取抗生素種類臨床病原體檢測第94頁單環(huán)β-內(nèi)酰胺類：氨曲南Aztreonam廣譜青霉素類：氨芐西林Ampicilin、青霉素GPenicillin、苯唑西林Oxacillin抗假單胞菌廣譜青霉素：哌拉西林Piperacillin臨床病原體檢測第95頁復方β-內(nèi)酰胺類：阿莫西林-克拉維酸（奧格門?。〢moxicilin/clavelanate氨芐西林-舒巴坦（優(yōu)力新）Ampicillin/Sulbactam哌拉西林-他唑巴坦（特治星）Pioeracillin/Tazobactam頭孢哌酮-舒巴坦（舒普深）efoperazone/Sulbactam碳青霉烯類：亞胺培南Imipenem、美羅培南Meropenem臨床病原體檢測第96頁多肽類：多粘菌素EColistinE、替考拉寧Teicoplanin、萬古霉素Vancomicin磺胺類：復方新諾明（甲氧芐唑-磺胺甲唑）Timethoprim/Sulfamethoxazole林可霉素類：克林霉素Clindamycin大環(huán)內(nèi)脂類：紅霉素Erythromycin臨床病原體檢測第97頁氯霉素：氯霉素Chloramphenicol三代喹諾酮：環(huán)丙沙星Ciprofloxaxin、氧氟沙星Ofloxaxin、左旋氧氟沙星Levofloxacin、莫西沙星Moxifloxacin四環(huán)素類：四環(huán)素Tetracycline利福平Rifampin臨床病原體檢測第98頁產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extendedspectrumβ-lactamase，ESBL)：該酶水解青霉素、頭孢菌素及單胺類超廣譜β-酶，主要由肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌等腸桿菌科細