化妝品舒緩功效測試方法-PolyI-C和LPS誘導(dǎo)3D表皮模型的炎癥因子(IL-8)體外測試方法

ICS71.100.70Y42T/ZHCAxxx-2023化妝品舒緩功效測試方法——PolyI:C和LPS誘導(dǎo)3D表皮模型的炎癥因子(IL-8)體外測試方法Invitrotestmethodofinflammatorycytokines(IL-8)basedon3DepidermalmodelinducedbyPolyI:CandLPS（征求意見稿）2023-xx-xx發(fā)布2023-xx-xx實施浙江省健康產(chǎn)品化妝品行業(yè)協(xié)會發(fā)布T/ZHCAxxx—xxxx前??言本文件按照GB/T1.1-2020《標準化工作導(dǎo)則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。本文件由浙江省食品藥品檢驗研究院提出。本文件由浙江省健康產(chǎn)品化妝品行業(yè)協(xié)會（ZHCA）歸口。本文件起草單位：浙江省食品藥品檢驗研究院、廣東博溪生物科技有限公司、珀萊雅化妝品股份有限公司。本文件主要起草人：桑晶，匡榮，李樂，楊鑫，馮俊化妝品舒緩功效測試方法——PolyI:C和LPS誘導(dǎo)3D表皮模型的炎癥因子(IL-8)體外測試方法1范圍本文件規(guī)定了一種化妝品舒緩功效的體外測試方法。本文件適用于采用于體外重組三維表皮模型炎癥因子IL-8體外測試試驗評價化妝品及原料的舒緩功效。2規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。3術(shù)語及定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1三維表皮皮膚模型3Depidermalmodel三維表皮皮膚模型是以人皮膚組織分離出的角質(zhì)形成細胞為種子細胞，使用精細調(diào)節(jié)的無血清培養(yǎng)基促使細胞在體外發(fā)育成復(fù)層化結(jié)構(gòu)的三維表皮模型。其具有高度類似于天然皮膚的復(fù)層化結(jié)構(gòu)、屏障功能。3.2炎癥因子IL-8IL-8屬于白介素家族的一種促炎因子，是濕疹發(fā)生過程中角質(zhì)形成細胞釋放的特異性促炎因子，角質(zhì)形成細胞釋放IL-8后進一步會激活T細胞介導(dǎo)的特異性免疫反應(yīng)，從而誘導(dǎo)紅斑瘙癢等不適癥狀的出現(xiàn)。3.3酶聯(lián)免疫吸附測定enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA一種將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合起來的高靈敏度分析技術(shù)。原理是通過酶（如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等）標記抗體，該酶標抗體可與待測的抗原或抗體免疫吸附結(jié)合，酶所催化的呈色反應(yīng)可以間接反映抗原的量。4試驗原理采用PolyI:C和LPS聯(lián)合誘導(dǎo)體外重組三維表皮模型，使其釋放特異性的炎癥因子IL-8，IL-8釋放后會進一步激活特異性免疫反應(yīng)，進而介導(dǎo)炎癥的級聯(lián)放大，最終出現(xiàn)紅斑瘙癢等不適癥狀。而抑制IL-8釋放的化妝品可以達到舒緩瘙癢紅斑等不適癥狀的作用。采用IL-8酶標抗體的酶標板測定450nm波長下測定吸光度（OD值）得到IL-8含量，受試物組與陰性對照組比較來計算IL-8抑制率。通過測試受試物對IL-8抑制率情況，來評價樣品的舒緩功效。5試劑和材料5.1體外重組3D表皮模型（EpiKutis?）。5.2體外重組3D表皮模型培養(yǎng)液（EpiGrowth培養(yǎng)液）。5.3IL-8ELISA檢測試劑盒或其他IL-8細胞因子檢測試劑。5.4PolyI:C（Sigma）。5.5LPS（Sigma）。5.6地塞米松（Sigma）5.7磷酸鹽緩沖液（PBS）：pH7.2~pH7.4。6儀器6.1分析天平：分度值為0.0001g。6.2二氧化碳培養(yǎng)箱：37℃±1℃，（5±1）%CO2，95%相對濕度。6.3可調(diào)節(jié)移液器：1000μL、200μL、300μL多道移液器。6.4超凈工作臺。6.5離心機。6.6倒置顯微鏡。6.7細胞板振蕩器。6.8酶標儀。6.9水平振蕩儀。6.10恒溫培養(yǎng)箱7試驗步驟7.1前處理7.1.1受試物準備水溶受試物直接采用培養(yǎng)液作為溶劑。水難溶的受試物使用二甲基亞砜（DMSO）作為溶劑。其余溶劑需在使用溶劑前。必須仔細評估受試物的特殊性質(zhì)，是否與受試物發(fā)生反應(yīng)?？梢允褂脺u旋混合/或超聲處理和/或加熱到適當溫度等方法輔助溶解，除非這些操作會影響到受試物的穩(wěn)定性。除有穩(wěn)定性數(shù)據(jù)證明儲備液可接受，受試物均使用前新鮮配置直接使用。如果受試物無毒，原液表面給藥；受試物毒性有毒，則根據(jù)毒性預(yù)試驗選擇的無毒劑量濃度進行表面給藥。7.1.2刺激物準備采用PolyI:C和LPS聯(lián)合刺激，其中PolyI:C的推薦使用濃度為60μg/mL，LPS的推薦使用濃度為20μg/mL，二者混合后加到模型培養(yǎng)液中配置成誘導(dǎo)工作液。試驗可接受質(zhì)量標準為：與空白對照組相比，刺激物作用下陰性/溶劑對照組的IL-8含量顯著性增加（具有統(tǒng)計學差異P<0.05）。7.1.3陽性對照每一次試驗都應(yīng)同時使用陽性對照進行試驗。例如地塞米松，給藥濃度為100μg/mL。試驗可接受標準為：與陰性對照組相比，陽性對照組IL-8的分泌量顯著性降低（具有統(tǒng)計學差異P<0.05）。7.2正式試驗7.2.1試驗分組試驗需設(shè)置空白對照組、陰性對照組、陽性對照組和受試物組，每組3個模型，根據(jù)實驗分組準備6孔板并做分組標記。7.2.2受試物給藥駐留型配方產(chǎn)品：模型給藥量為25μL，采用正壓移液器緩慢滴加于模型表面。給藥后，用正壓槍頭輔助受試物在模型表面的鋪展。最后一個模型給藥結(jié)束后，將所有含有模型的6孔板轉(zhuǎn)移到CO2培養(yǎng)箱中孵育24h（37±1℃、5±1%CO2、95%相對濕度）注意：給藥時不可按壓模型表面。化妝品原料：根據(jù)角質(zhì)形成細胞MTT操作規(guī)程確定其在角質(zhì)形成細胞上的安全濃度。若為系統(tǒng)給藥，推薦使用培養(yǎng)基配制成安全濃度進行給藥培養(yǎng)；若為表面給藥，應(yīng)在安全濃度基礎(chǔ)上放大一定系數(shù)，配制成相應(yīng)濃度進行表面給藥，表面給藥量為25μL。7.2.3誘導(dǎo)刺激給藥孵育完成后，從培養(yǎng)箱中取出六孔板。采用無菌棉簽輕輕擦拭模型表面，盡量保證擦拭干凈，然后對每組3個平行模型的培養(yǎng)液進行換液（polyI:C與LPS誘導(dǎo)工作液），空白對照組換TA培養(yǎng)液（無氫化可的松），換液后，將所有六孔板轉(zhuǎn)移到CO2培養(yǎng)箱中孵育24h（37±1℃、5±1%CO2、95%相對濕度）。7.2.4模型培養(yǎng)液收集孵育培養(yǎng)結(jié)束后，收集200μL模型培養(yǎng)液于1.5mL無菌離心管中，置于-80℃超低溫冰箱冷凍保存。7.2.5ELISA檢測ELISA檢測需根據(jù)IL-8的ELISA檢測試劑盒的操作說明書進行檢測。7.2正式試驗（細胞增殖試驗）7.2.6IL-8含量計算：標準品及樣品測定的OD450值減去空白孔OD450值后，3個復(fù)孔取其平均值計算。采用專業(yè)制作曲線軟件CurveExpert，以標準品的濃度為縱坐標，OD450值為橫坐標，繪出標準曲線，得出回歸方程式，將樣品組測定的OD450值代入方程式，計算出樣品的IL-8含量。7.2.7IL-8抑制率計算：抑制率%(1)式中：T—實驗組含量平均值；C—陰性對照組含量平均值。8結(jié)果判定8.1試驗成立的條件8.1.1試驗系統(tǒng)有效每批次實驗均須設(shè)置陰性對照組及陽性對照組，要求每批次測試陰性對照組相較空白對照組，IL-8的分泌量顯著性增加（具有統(tǒng)計學差異P<0.05）、陽性對照相較陰性對照組檢出IL-8含量顯著性降低（具有統(tǒng)計學差異P<0.05），則認為試驗系統(tǒng)有效。8.1.2試驗平行性有效統(tǒng)計酶標儀測得的各組平行孔間吸光度的標準差（StandardDeviation，SD），并計算變異系數(shù)（CoefficientofVariation，C.V），C.V值≤20%，則認為實驗平行性有效。8.2結(jié)果判定評價受試物的舒緩功效，需要受試物組與陰性對照組相比，IL-8的含量下降，且檢測值具有統(tǒng)計學差異（P<0.05），說明受試物具有抑制IL-8含量的作用。在所有試驗濃度下，至少有