2011CB944300-G精子遺傳信息穩(wěn)定傳遞的分子機(jī)理

項(xiàng)目名稱：精子遺傳信息穩(wěn)定傳遞的分子機(jī)理首席科學(xué)家：沙家豪南京醫(yī)科大學(xué)起止年限：2011.1至2015.8依托部門：江蘇省科技廳

二、預(yù)期目標(biāo)總體目標(biāo)：本項(xiàng)目以闡明精子遺傳信息穩(wěn)定傳遞的分子機(jī)理為目標(biāo)，通過實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型與臨床人群資源相結(jié)合開展相關(guān)基因的功能研究，探討在精原細(xì)胞有絲分裂、精母細(xì)胞減數(shù)分裂和精子細(xì)胞變形過程中建立父源遺傳物質(zhì)穩(wěn)定傳遞的結(jié)構(gòu)和功能基礎(chǔ)，為人類生殖和發(fā)育相關(guān)疾病診治提供理論基礎(chǔ)。五年預(yù)期目標(biāo)1.制備和引進(jìn)5-8個(gè)精原細(xì)胞有絲分裂相關(guān)的基因敲除小鼠模型，揭示染色體復(fù)制修復(fù)、染色體分離和染色體結(jié)構(gòu)對(duì)精原細(xì)胞的DNA穩(wěn)定性的影響及其機(jī)制。2.制備和引進(jìn)2-3個(gè)精母細(xì)胞減數(shù)分裂相關(guān)的基因敲除/轉(zhuǎn)基因小鼠模型，探討DNA損傷修復(fù)機(jī)制在維持精母細(xì)胞減數(shù)分裂基因組完整性方面的作用；在整體水平上了解泛素化和SUMO化蛋白在減數(shù)分裂過程中的時(shí)空和動(dòng)態(tài)變化。3.制備和引進(jìn)3-5個(gè)精子細(xì)胞變形相關(guān)的基因敲除小鼠模型，闡明在精子細(xì)胞形態(tài)建成過程中遺傳信息穩(wěn)定的分子機(jī)理。4.通過基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選臨床不育人群的遺傳變異和蛋白表達(dá)修飾異常，闡述上述研究的基因及其他精子發(fā)生相關(guān)基因在精子發(fā)生障礙中的作用及其分子機(jī)理。5.預(yù)期在本領(lǐng)域一流、生命科學(xué)有重要影響刊物上發(fā)表論文40-50篇，其中IF＞5的論文10-15篇，力爭(zhēng)發(fā)表IF>10的論文1-2篇。6.在精子發(fā)生的研究領(lǐng)域集聚一支高水平的科研隊(duì)伍，培養(yǎng)博士和碩士研究生20-30名。

三、研究方案本項(xiàng)目將基礎(chǔ)研究與臨床研究緊密結(jié)合，一方面利用精子發(fā)生障礙人群資源(主要選擇無精子癥、少精子癥、弱精子癥和畸形精子癥等)篩選出與精子發(fā)生相關(guān)的基因/蛋白質(zhì)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步制備基因敲除小鼠深入探討其在精原細(xì)胞有絲分裂、精母細(xì)胞減數(shù)分裂和精子細(xì)胞變形過程中的作用；另一方面選擇與上述過程相關(guān)的基因敲除小鼠模型，在臨床上驗(yàn)證該基因與精子發(fā)生障礙的相關(guān)性。從基礎(chǔ)-臨床-基礎(chǔ)，在各課題組已有工作的基礎(chǔ)上，發(fā)揮各自的技術(shù)特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，集中目標(biāo)，重點(diǎn)突破。在基因水平、蛋白質(zhì)水平、細(xì)胞與組織水平和整體水平上，綜合應(yīng)用生物信息學(xué)、分子生物學(xué)、生殖生物學(xué)、表觀遺傳學(xué)以及系統(tǒng)生物學(xué)等多學(xué)科交叉手段，各課題間既有側(cè)重點(diǎn)又有交叉，系統(tǒng)深入地研究精子遺傳信息穩(wěn)定傳遞的分子機(jī)理。創(chuàng)新點(diǎn)與特色、可行性分析：1.從學(xué)術(shù)思路來看，本項(xiàng)目將基礎(chǔ)研究與臨床研究密切結(jié)合，從臨床提出問題，到基礎(chǔ)研究中尋找答案，再回到臨床驗(yàn)證可行性。2.從技術(shù)手段來看，本項(xiàng)目綜合運(yùn)用多種技術(shù)平臺(tái)，圍繞精子遺傳信息穩(wěn)定傳遞的重要事件開展一系列研究。3.從研究對(duì)象來看，本項(xiàng)目已經(jīng)收集近千例臨床精子發(fā)生障礙患者的精液和外周血標(biāo)本，同時(shí)南京醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院和北京大學(xué)深圳醫(yī)院還可以源源不斷提供不育癥病人的標(biāo)本，資源豐富。4.從研究內(nèi)容和課題設(shè)置來看，本項(xiàng)目6個(gè)承擔(dān)單位之間的研究內(nèi)容相互交叉，互相滲透，密切合作，形成一個(gè)統(tǒng)一的整體（詳見課題設(shè)置）。5.本項(xiàng)目以國家目標(biāo)為導(dǎo)向，以強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合、優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)、成果集成為組建原則，項(xiàng)目主要參加單位包括南京醫(yī)科大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地、中科院動(dòng)物所生殖生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、南京大學(xué)科技部國家小鼠資源中心、中科院北京基因組學(xué)研究所和北京大學(xué)深圳醫(yī)院；參加項(xiàng)目的PI有中科院院士1名、工程院院士１名、國家杰出青年基金獲得者1名、中科院百人計(jì)劃獲得者3名、教育部百篇優(yōu)秀博士論文獲得者1名等，具備取得重大突破的科學(xué)積累和人才基礎(chǔ)。課題設(shè)置各課題間相互關(guān)系圍繞我們要解決的關(guān)鍵科學(xué)問題和達(dá)到的研究目標(biāo)，本項(xiàng)目設(shè)置了4個(gè)課題:1.精原細(xì)胞有絲分裂及遺傳穩(wěn)定的調(diào)控機(jī)制2.減數(shù)分裂中DNA重組、修復(fù)及穩(wěn)定性3.精子細(xì)胞形態(tài)建成的調(diào)控機(jī)制4.精子發(fā)生相關(guān)基因的人群研究四個(gè)課題之間相互交叉，互相滲透，密切合作，形成一個(gè)統(tǒng)一的整體，前三個(gè)課題是圍繞精子發(fā)生過程中的三個(gè)重要過程設(shè)置的基礎(chǔ)性研究，所制備的基因敲除小鼠平臺(tái)不僅可以深入研究精子遺傳信息穩(wěn)定傳遞過程中相關(guān)基因和蛋白的功能，而且可以作為第四個(gè)課題進(jìn)行臨床精子發(fā)生障礙人群研究篩選基因的重要依據(jù)。而第四個(gè)課題中運(yùn)用高通量篩選出的突變基因又可以為前三個(gè)課題提供可研究的基因資源。除此之外，由于四個(gè)課題具有高度關(guān)聯(lián)性，在項(xiàng)目實(shí)施的過程中通過課題之間的滲透合作和交叉，能獲得突破性進(jìn)展。課題一：經(jīng)費(fèi)比例：20%承擔(dān)單位：南京醫(yī)科大學(xué)、南京大學(xué)課題負(fù)責(zé)人：黃曉燕學(xué)術(shù)骨干：黃行許課題二：經(jīng)費(fèi)比例：30%承擔(dān)單位：中國科學(xué)院北京基因組研究所、中國科學(xué)院動(dòng)物研究所、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所課題負(fù)責(zé)人：郭彩霞學(xué)術(shù)骨干：劉以訓(xùn)、王琳芳課題三：經(jīng)費(fèi)比例：30%承擔(dān)單位：中國科學(xué)院動(dòng)物研究所、北京大學(xué)深圳醫(yī)院課題負(fù)責(zé)人：李衛(wèi)學(xué)術(shù)骨干：高飛、桂耀庭課題四：經(jīng)費(fèi)比例：20%承擔(dān)單位：南京醫(yī)科大學(xué)課題負(fù)責(zé)人：沙家豪學(xué)術(shù)骨干：胡志斌、郭雪江

四、年度計(jì)劃年度研究內(nèi)容預(yù)期目標(biāo)第一年1、構(gòu)建和引進(jìn)精原細(xì)胞特異性基因、精母細(xì)胞減數(shù)分裂相關(guān)基因以及精子細(xì)胞變形相關(guān)基因條件敲除小鼠模型；2、對(duì)已有的基因敲除小鼠模型進(jìn)行表型分析，探討其與精子發(fā)生各個(gè)階段可能的關(guān)系；3、制備酵母的HBT-UB/SUMO過表達(dá)體系，構(gòu)建小鼠過表達(dá)載體。4、收集符合納入標(biāo)準(zhǔn)的精液質(zhì)量異常的患者和正常男性對(duì)照各2000例，采集基礎(chǔ)流行病學(xué)信息和精液、血液、尿液等生物樣本，針對(duì)不同表型（無精、少精、弱精和畸形精子）進(jìn)行分組。通過各研究內(nèi)容的實(shí)施，逐步建立相關(guān)生物樣本庫（包括精液、尿液、血液、DNA、組織等生物樣本），為課題提供適宜的樣本資源。1、成功建立和引進(jìn)多種與精子發(fā)生相關(guān)的條件敲除小鼠模型，為后續(xù)研究提供動(dòng)物模型。2、構(gòu)建酵母和小鼠的HBT-UB過表達(dá)體系，并制備相應(yīng)的酵母株系3、完成2000精液質(zhì)量異常患者和2000正常男性對(duì)照基礎(chǔ)流行病學(xué)信息、精液、血液和尿液等生物樣本的收集，完成生殖功能評(píng)價(jià)，完成相關(guān)生物樣本庫的建立第二年1、繼續(xù)構(gòu)建和引進(jìn)精原細(xì)胞特異性基因、精母細(xì)胞減數(shù)分裂相關(guān)基因以及精子細(xì)胞變形相關(guān)基因條件敲除小鼠模型；2、總結(jié)分析前一年已經(jīng)構(gòu)建好的小鼠模型的表型分析結(jié)果，探討其與精子發(fā)生各個(gè)階段的相關(guān)性。3、純化并進(jìn)行質(zhì)譜分析酵母減數(shù)分裂過程中被泛素或者是SUMO修飾的蛋白。4、以臨床無精子癥患者為代表，選擇課題1-3所研究的基因、其他文獻(xiàn)報(bào)道的精子發(fā)生障礙相關(guān)基因等，對(duì)其全部外顯子進(jìn)行深度測(cè)序，篩選和驗(yàn)證突變，研究這些突變與精子發(fā)生的相關(guān)性；以臨床少、弱精子癥為主要表型，選擇課題1-3所研究的基因、其他文獻(xiàn)報(bào)道的精子發(fā)生障礙相關(guān)基因和DNA修復(fù)、凋亡等基因，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，選擇可能影響基因表達(dá)和調(diào)控及引起氨基酸改變的SNPs，定制高通量芯片。5、收集臨床弱精及畸精患者精液標(biāo)本與正常對(duì)照精液標(biāo)本，使用蛋白質(zhì)組學(xué)策略鑒定差異表達(dá)蛋白。繼續(xù)成功建立和引進(jìn)多種與精子發(fā)生相關(guān)的條件敲除小鼠模型，為后續(xù)研究提供動(dòng)物模型。獲得與精子發(fā)生相關(guān)基因敲除小鼠表型分析結(jié)果。獲得減數(shù)分裂過程中被泛素或者是SUMO修飾的蛋白變化譜。4、完成臨床無精子患者所選基因全外顯子深度測(cè)序，根據(jù)篩選和驗(yàn)證結(jié)果，進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析；臨床少、弱精子患者開始進(jìn)行所選基因SNP位點(diǎn)的設(shè)計(jì)，定制高通量芯片及相關(guān)試劑。5、篩選出弱精子癥以及畸形精子癥精子重要的差異表達(dá)蛋白,完成這些蛋白的表達(dá)驗(yàn)證。6、在國際主流雜志（IF>3）上發(fā)表論文10-12篇第三年1、繼續(xù)總結(jié)分析前一年已經(jīng)構(gòu)建好的小鼠模型的表型分析結(jié)果，探討其與精子發(fā)生各個(gè)階段的相關(guān)性。2、純化并進(jìn)行質(zhì)譜分析小鼠減數(shù)分裂過程中以及精子發(fā)生相關(guān)的其他過程中被泛素或者是SUMO修飾的蛋白。進(jìn)一步通過離體和在體實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方式驗(yàn)證其是否真的被泛素/SUMO化，研究這一泛素/SUMO化所需要的信號(hào)通路以及催化機(jī)制問題。3、在前一年工作基礎(chǔ)上，采用定制芯片等高通量方法分析精子發(fā)生重要基因與精子發(fā)生障礙之間的聯(lián)系。對(duì)于發(fā)現(xiàn)的與精子發(fā)生障礙存在關(guān)聯(lián)的陽性位點(diǎn)，進(jìn)行SNP的功能分析，確認(rèn)后對(duì)所在基因反饋給課題1-3進(jìn)行動(dòng)物模型研究。4、對(duì)于深度測(cè)序獲得的關(guān)聯(lián)陽性位點(diǎn)進(jìn)行功能研究；驗(yàn)證弱精子癥與畸形精子癥精子差異表達(dá)蛋白的改變。5構(gòu)建弱精癥精子蛋白差異磷酸化修飾譜。1、獲得與精子發(fā)生相關(guān)基因敲除小鼠表型分析結(jié)果。2、獲取小鼠減數(shù)分裂和精子發(fā)生過程中被泛素和SUMO所修飾的蛋白，并通過其他試驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證3、完成臨床少、弱精子癥患者相關(guān)基因SNP和突變的檢測(cè)和分析，對(duì)陽性關(guān)聯(lián)位點(diǎn)進(jìn)行功能學(xué)分析及/或進(jìn)一步的動(dòng)物模型研究；完成弱精子與畸形精子癥精子差異蛋白表達(dá)譜的驗(yàn)證工作；完成弱精子癥精子差異磷酸化修飾譜的構(gòu)建。4、在國際主流雜志（IF>3）上發(fā)表論文10-12篇第四年1、繼續(xù)總結(jié)分析前一年已經(jīng)構(gòu)建好的小鼠模型的表型分析結(jié)果，探討其與精子發(fā)生各個(gè)階段的相關(guān)性。2、在酵母和小鼠中通過必要的生物學(xué)手段探討相應(yīng)被泛素化修飾的蛋白在減數(shù)分裂過程中以及精子發(fā)生過程中的作用機(jī)制問題，并根據(jù)情況構(gòu)建相應(yīng)購得動(dòng)物模型開展深入研究3、驗(yàn)證弱精癥精子蛋白差異磷酸化修飾譜；構(gòu)建少精子癥精子差異蛋白表達(dá)譜；構(gòu)建畸形精子癥差異磷酸化修飾譜1、獲得與精子發(fā)生相關(guān)基因敲除小鼠表型分析結(jié)果。2、闡明幾個(gè)被蛋白的泛素化修飾在減數(shù)分裂過程中以及精子發(fā)生過程中的作用機(jī)制問題。3、完成弱精子癥精子差異磷酸化修飾的驗(yàn)證；完成少精子癥精子差異蛋白表達(dá)譜的構(gòu)建和驗(yàn)證。完成畸形精子癥精子差異磷酸化修飾譜的鑒定。4、在國際主流雜志（IF>3）上發(fā)表論文10-15篇第五年1、完成和整理上述基因敲除小鼠的表型分析和作用機(jī)理研究2、在臨床人群研究方面，完成所有研究內(nèi)容并探索臨床和人群轉(zhuǎn)化潛力3、總結(jié)課題，匯總數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)好新的研究計(jì)劃。1、通過基因敲除小鼠模型的構(gòu)建以及表型分析，獲得對(duì)精子發(fā)生各個(gè)階段：精原細(xì)胞有絲分裂、精母細(xì)胞減數(shù)分裂以及精子細(xì)胞變形過程關(guān)鍵基因的作用機(jī)理，并對(duì)每一個(gè)敲除小鼠表型與課題四開展的臨床精子發(fā)生障礙模型相關(guān)基因的研究進(jìn)行比對(duì)分析，從基礎(chǔ)和臨床兩個(gè)水平探討精子遺傳信息穩(wěn)定傳遞的分子機(jī)理2、在國際主流雜志（IF>3）上發(fā)表論文10-12篇，其中五年之內(nèi)爭(zhēng)取發(fā)表IF>10文章1-2篇

一、研究內(nèi)容精子發(fā)生是一個(gè)連續(xù)的細(xì)胞分裂分化過程，其最終目的是維持父系遺傳信息的穩(wěn)定傳遞。本項(xiàng)目擬通過基礎(chǔ)研究與臨床研究的緊密結(jié)合，闡明精子建立遺傳物質(zhì)穩(wěn)定傳遞的分子基礎(chǔ)。圍繞著這個(gè)