GB∕ T 40251-2021 牡蠣單孢子蟲(chóng)病診斷規(guī)程 原位雜交法（正式版）

ICS65.020.30牡蠣單孢子蟲(chóng)病診斷規(guī)程原位雜交法國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)IGB/T40251—2021本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部提出。本文件由全國(guó)水產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC156)歸口。1GB/T40251—2021牡蠣單孢子蟲(chóng)病診斷規(guī)程原位雜交法本文件規(guī)定了牡蠣單孢子蟲(chóng)病診斷規(guī)程中病原定位方法的要求，針對(duì)主要病原尼氏單孢子蟲(chóng)本文件適用于尼氏單孢子蟲(chóng)在牡蠣中感染程度的評(píng)估和確診；其他貝類也可參照?qǐng)?zhí)行。下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。SC/T7205.1—2007牡蠣包納米蟲(chóng)病診斷規(guī)程第1部分：組織印片的細(xì)胞學(xué)診斷法3術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。4縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。AP:堿性磷酸酶(alkalinephosphatase)BCIP:5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸-甲苯胺鹽(5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphatep-toluidinesalt)DAFA:戴維森氏乙醇-福爾馬林-乙酸固定液(davidson'salcohol-formalin-aceticacidfixative)DIG:地高辛(digoxigenin)EDTA-Na?·2H?O:二水合乙二胺四乙酸二鈉(Ethylenediaminetetraaceticacid,disodiumdi-hydrate)MgCl?·6H?O:六水合氯化鎂(magnesiumchloridehexahydrate)NaCl:氯化鈉(sodiumchloride)Na?HPO?·12H?O:十二水合磷酸氫二鈉(sodiumphosphatedibasicdodecahydrate)Na?C?H?O,·2H?O:二水合檸檬酸三鈉(sodiumcitratedihydrate)NBT:氯化硝基四氮唑藍(lán)(4-Nitrobluetetrazoliumchloride)KH?PO?:磷酸二氫鉀(potassiumphosphatemonobasic)KCl:氯化鉀(potassiumchloride)PBS:磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffersalinebuffer)SSC:枸櫞酸鈉緩沖液(salinesodiumcitratebuffer)Tris:三羥甲基氨基甲烷(Tris[hydroxymethyl]aminomethane)25試劑或材料5.5Na?HPO?·12H?O。5.9MgCl?·6H?O。5.12BCIP。5.13蛋白酶K。5.14多聚賴氨酸(相對(duì)分子質(zhì)量25000)。5.15聚乙烯醇(相對(duì)分子質(zhì)量30000～70000)。5.17俾斯麥棕Y。5.19聚蔗糖400。5.20聚乙烯吡咯烷酮360。5.24石蠟(熔點(diǎn)52℃~54℃):切片級(jí)。5.26丹哈特液(Denhardt's)。5.27鮭精DNA。5.31濃鹽酸。5.33二甲苯。5.35無(wú)水乙醇。5.3695%乙醇。5.37甲醛(37%)。3GB/T40251—20215.49100pg/mL蛋白酶K:按A.15.570.5%俾斯麥棕Y(BismarkbrownY):按A.24配制。6.7烘片機(jī)。度高于15%時(shí)為采樣的最佳時(shí)期。稚貝(附著后～2mm)和幼貝(2mm～30mm)取內(nèi)臟團(tuán)；成貝(>30mm)取胃、腸道、閉殼肌和外套膜。4GB/T40251—20218試驗(yàn)步驟組織塊依次浸入盛有不同濃度乙醇溶液的燒杯中；流程如下：70%乙醇(1h45min)→80%乙醇(1h45min)→80%乙醇(1h45min)→95%乙醇(45min)→95%乙醇(脫水后的組織塊依次浸入盛有無(wú)水乙醇：二甲苯(1:1)混合液和二甲苯溶液的燒杯中，流程如下：8.2原位雜交(每次3min)。8.2.2切片平放在切片保濕孵育箱中，吸取500μL100pg/mL蛋白酶K溶液，加到每張組織切片上，8.2.3把組織切片上的蛋白酶K溶液吸凈，然后將其浸入預(yù)冷到4℃的0.4%甲醛溶液中5min。8.2.5把組織切片平放在切片保濕孵育箱中，添加500μL雜交緩沖液至每張組織切片，42℃孵育8.2.6添加500μL含2ng/μLDIG標(biāo)記的寡聚核苷酸探針雜交混合液至每張組織切片，置于90℃~95℃平板烘片機(jī)上保溫10min。8.2.7將組織切片置于平整的冰面上淬冷1min。5緩沖液I(1min～2min,室溫)。8.2.11用緩沖液Ⅱ?qū)P-抗DIG稀釋至0.75U/μ9結(jié)果判定9.1檢測(cè)結(jié)果成立條件6(規(guī)范性)試劑配方A.1DAFA固定液95%乙醇甲醛(37%)冰醋酸過(guò)濾海水A.280%乙醇95%乙醇加水定容至A.370%乙醇95%乙醇加水定容至95%乙醇加水定容至A.5500μg/mL多聚賴氨酸多聚賴氨酸(相對(duì)分子質(zhì)量25000)加水定容至A.620×SSCNaClNa?C?H?O?·2H?O加水溶解定容至調(diào)節(jié)pH至A.72×SSC20×SSC水330mL220mL335mL950mL700mL950mL500mL950mL900mL7水水A.10PBSNaClNa?HPO?·12H?O蛋白酶K10mg/mL蛋白酶K甲醛(37%)水A.14雜交緩沖液100%甲酰胺25%硫酸葡聚糖NaCl用濃HCl調(diào)節(jié)pH至8加水定容至A.16緩沖液I10×緩沖液I水A.17緩沖液Ⅱ山羊血清緩沖液I2mL在60℃~80℃水浴中溶解，不斷晃動(dòng)，直至顆粒溶解。4℃可貯存2周。A.1810×緩沖液ⅢNaCI58.4g加水溶解至800mL用濃HCl調(diào)節(jié)pH至9.5MgCl?·6H?O101.6g加水定容至1000mLA.19緩沖液ⅢEDTA-Na?·2H?OA.21緩沖液IV10×緩沖液IV水A.2210%聚乙烯醇聚乙烯醇(相對(duì)分子質(zhì)量30000～70000)加水溶解至900mL9A.23顯色液緩沖液ⅢmL鹽酸左旋咪唑10%聚乙烯醇mL4℃保存用前在每1mL上述混合液中加入：NBTA.240.5%俾斯麥棕Y俾斯麥棕Yg水mL把染料溶于水中，過(guò)濾。室溫貯存。A.25NBT貯存液二甲基甲酰胺0.931mL避光，—20℃貯存。A.26BCIP貯存液二甲基甲酰胺2mLA.2720×丹哈特液牛血清白蛋白0.4g聚蔗糖4000.4g聚乙烯吡咯烷酮3600.4g加水溶解并定容至100mL0.45μm的濾器過(guò)濾，5mL/支分裝，—20℃貯存。A.2825%硫酸葡聚糖硫酸葡聚糖25g加水定容至100mL低熱攪拌片刻使之溶解，—20℃保存。A.2910mg/mL鮭精DNA將鮭精DNA鈉鹽加入水中，用玻璃棒攪拌直至