GB∕T 19495.4-2018 轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光定性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測(cè)方法

代替GB/T19495.4—2004國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局I—-GB/T19495.1轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)通用要求和定義； ——GB/T19495.6轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)基因芯片檢測(cè)方法； ——GB/T19495.9轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)植物產(chǎn)品液本部分為GB/T19495的第4部分。1GB/T19495的本部分規(guī)定了植物及其加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分篩選和品系檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光定性聚合GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T19495.2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求GB/T19495.7轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)抽樣和制樣方法GB/T27403實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因transgene實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系中加入熒光2利用生物工程技術(shù)轉(zhuǎn)入的其他生物基因。每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。3.2縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。bp:堿基對(duì)(basepat)CP4-EPSPS:農(nóng)根菌C蛋白基因和5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(AgrobasteriumtumefaciensstrainCP4Prodya:herhictidetolerantformof5-enolCryIA(c):蘇云晶芽孢桿菌殺蟲(chóng)蛋白CryIA(c)基因[Bacillusthurtngierisis(Bt)subsp.Cry3A:蘇云晶芽孢桿菌殺重蛋自Cr8A基因BaillisthatugiensisCBt)sbsp.TenebrionisCTAB十六烷基三甲基溴化銨(tyltrithylammonjotbromieDNA:脫氧核糖核酸(deoxyilbonucleicadATP脫氧腺苷三磷酸(deoxgadenosiretrighosphatedCTP脫氧胞苷三磷酸Cdooxgoyfdinetrphosphate)dGTP:脫氧喜苷三磷酸(deoxygusnosinetriphospkate)dNTP:脫氧核苷三磷酸(deoxyrbonucleoscaihospladUTP:脫氧尿音三磷酸(deoxyuridnetphosphatoEPSPS:5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(5GOX:草甘膦氧化還原酶基因(glyphosateoxidoreductasegehe)LAT52:花粉特異蛋白LAT52基因Lectin:植物凝集素基因NPTⅡ:新霉素-3'-磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(neomycin-3'-phosphotransferasegene)PAT:草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(phosphinothricinacetyltransferasegene)PLD:磷脂酶D家族基因(phospholipaseDfamilygene)PMI:6-磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(phosphomannose-isomerasegene)pCaMV35S:花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子(35Spromoterfromcauliflowermosaicvirus)pFMV35S:玄參花葉病毒35S啟動(dòng)子(35SpromoterfromamodifiepNOS:來(lái)源于農(nóng)桿菌的胭脂堿合成酶基因啟動(dòng)子(promoterofnopalinesynthasegenefrom3tg7:谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶7基因(transglutUGPase:馬鈴薯UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(UDP-glucosepyrophosphorylasegenefromzSSⅡb:玉米淀粉合成酶b亞基[theendosper4為T(mén)aqDNA聚合酶(5U/pL)熒光校正試劑(50×,使用時(shí)稀釋至1×)根據(jù)需薯檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因植物品系，參照陰錄日中表B工的序列合成引物和探針加超純水配制成按照GB/Tn495.7中規(guī)定的方法執(zhí)行6.2樣品DNA的提取與純化按照GB/Tn94938的方法或采用具有相同效果的植物基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取。每個(gè)樣品應(yīng)制備2個(gè)測(cè)詞樣品提取DNA(提取平行重復(fù))。6.3DNA濃度測(cè)定和定量按照GB/T19495.3中規(guī)定的方法6.4實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)表1轉(zhuǎn)基因篩選檢測(cè)基因選用物種選用基因大豆及其加工品內(nèi)源基因，pCaMV35S,pFMV35S,tNOS,BAR,PAT,GOX,CP4-EPSPS,CTP2-CP4-玉米及其加工品內(nèi)源基因，pCaMV35S,pFMV35S,tNOEPSPS,Cry3A,tCaMV35S,PMI,CryIA(b),CRYIA(c),pRice5表1(續(xù))物種選用基因油菜及其加工品內(nèi)源基因，pCaMV35S,pFMV35S,tNOS,NEPSPS,pNOS,pSSuAra,pTA29,tCaMV35S,tE9,t水稻及其加工品內(nèi)源基因，pCaMV35S,tNOS,BAR,CryIA(b),CRYIA(c)棉花及其加工品內(nèi)源基因，pCaMV35S,pFMV35S,tNOS,NPTⅡ,BAR,PAT,CP4-EPSPS,pUbi,tE9,馬鈴薯及其加工品亞麻及其加工品內(nèi)源基因，pCaMV35S,pFMV35S,tNOS,NPTⅡ甜菜及其加工品內(nèi)源基因，pCaMV35S,pFMV35S,tN苜蓿及其加工品內(nèi)源基因，pFMV35S,CTP2-CP4-EPSPS,tE9pCaMV35S,pFMV35S,tNOS,CP小麥pCaMV35S,pFMV35S,tNOS,CP6.4.2實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系配制見(jiàn)表2。每個(gè)樣品設(shè)置2個(gè)平行重復(fù)。10×PCR緩沖液dNTP(含dUTP)見(jiàn)表A.1、表B.1下游引物見(jiàn)表A.1、表B.1見(jiàn)表A.1、表B.16表2(續(xù))終濃度注1:可選用含有PCR緩沖液、MgCl?、dNTP和Tag酶等成分的基于Taqman探針的實(shí)時(shí)熒光PCR預(yù)混液進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。注2:ROX熒光試劑僅在具有ROX校正通道的實(shí)時(shí)熒光PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)添加，否則用超純水補(bǔ)注3:反應(yīng)體系中各試劑的量可根據(jù)具體情況或不同的反應(yīng)總體積進(jìn)6.4.3實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)程序?qū)CR反應(yīng)管或反應(yīng)板放入實(shí)時(shí)熒光PCR儀后，設(shè)置PCR反應(yīng)熒光信號(hào)收集條件，應(yīng)與探針標(biāo)應(yīng)的空白對(duì)照(以雙蒸水代替DNA模板)?！幮詫?duì)照：內(nèi)源基因檢測(cè)Ct值≤30,轉(zhuǎn)化事件特異性檢測(cè)Ct值≥40;7.2結(jié)果判定測(cè)試樣品外源基因檢測(cè)Ct值≥40,內(nèi)源基因檢測(cè)Ct值≤30,則可判定該樣品不含所檢基因或測(cè)試樣品外源基因檢測(cè)Ct值≤35,內(nèi)源基因檢測(cè)Ct值≤30,判定該樣品含有所檢基因或品系。測(cè)試樣品外源基因檢測(cè)Ct值在35～40,應(yīng)調(diào)整模板濃度，重做實(shí)時(shí)熒光PCR。再次擴(kuò)增后的外源基因檢測(cè)Ct值仍在35～40,則可判定為該樣品含有所檢基因或品系。再次擴(kuò)增后的外源基因檢測(cè)Ct7檢測(cè)過(guò)程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403和GB/T19495.2中的規(guī)定執(zhí)行。各基因片段的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增的最低檢出限(LOD)為0.01%。8基因/品系名稱(chēng)引物/探針序列(5'-3')產(chǎn)物大小適用范圍1F植物內(nèi)源基因RPFAM-tgcgcgcctgctgccttcct2F油菜內(nèi)源基因RPFAM-cggagccactcggtgccgcaactt3FRPFAM-agtccttatgtgctccactttctggtgca4F玉米內(nèi)源基因RPFAM-aatcagggctcattttctcgctcctca5FRPFAM-agcaaagtcagagcgctgcaatgca-6F大豆內(nèi)源基因RPFAM-ccctcgtctcttggtcgcgccctct7FRPFAM-ccacaaacacatgcaggttatcttgg8F番茄內(nèi)源基因RPFAM-ctctttgcagtcctcccttgggct9F水稻內(nèi)源基因RPFAM-tecgagccgtecgtgcgtc9基因/品系名稱(chēng)引物/探針序列(5'-3')產(chǎn)物大小適用范圍F水稻內(nèi)源基因RPFAM-tgttgtgctgccaatgtggcctgFRPFAM-tgttgtgctgccaatgtggcctgF馬鈴薯內(nèi)源基因RPFAM-ctaccaccattacctcgcacctcctcaFagtttgtaggttttgatgt棉花內(nèi)源基因RPFAM-aaacataaaataatgggaacaaccatgacatgtF甜菜內(nèi)源基因RPFAM-ctacgaagtttaaagtatgtgccgctcF小麥屬內(nèi)源基因RPFAM-ttcccgcagccccaacaaccgcF小麥種內(nèi)源基因RPFAM-caaggcggccgaaataagtF苜蓿內(nèi)源基因RPFAM-tgaatgctcctgtgatctgcccatgc-F木瓜內(nèi)源基因RPFAM-ttcccttcatccattcccactcttgagaF水稻、番茄、馬外源篩選基因RPFAM-caaagatggacccccacccacg表A.1(續(xù))基因/品系名稱(chēng)引物/探針序列(5'-3)產(chǎn)物大小適用范圍F轉(zhuǎn)基因大豆、油和苜蓿等篩選檢測(cè)RPFAM-tgaaagtaatcttgtcaacatcgagcagctggF瓜等篩選檢測(cè)RPFAM-catcgcaagaccggcaacaggF番茄、馬鈴薯、檢測(cè)RPFAM-cacccagccggccacagtcgatFRPFAM-ccgagccgcaggaaccgcaggagF轉(zhuǎn)基因油菜、檢測(cè)RPFAM-tggccgcggtttgtgatatcgttaaF檢測(cè)RPFAM-tgctcacgttctctacactcgcgctcgF麥等篩選檢測(cè)RPFAM-tcatgttcggcggtctcgcgF轉(zhuǎn)基因玉米、檢測(cè)RPFAM-acctatgctcaagctgccaacacccF轉(zhuǎn)基因油菜、馬鈴薯RPFAM-cgcaataatggtttctgacgtatgtgcttagc引物/探針序列(5'-3')產(chǎn)物大小適用范圍F內(nèi)源基因RPFAM-ccttatcggcttgaaccgctggaataaF轉(zhuǎn)基因油菜、對(duì)煙草是內(nèi)源基因RPFAM-agtccagccacccaccttatgcaagtcF轉(zhuǎn)基因棉花、對(duì)玉米是內(nèi)源基因RPFAM-cgtcgacgagtctaacggacaccaacF轉(zhuǎn)基因玉米、RPFAM-aaaccctataagaaccctaattccttatctgggaF基因RPFRPFAM-tcttattcaaatttcaaaagtgccccagggFatgcaagtttaaattcagaaRatgtattacacataatatcgcPFRPFAM-tgccgccaacgaatcaccggF篩選基因RPFAM-ccgccgcgagctgaccctgaccgtgF任選其一，轉(zhuǎn)基因水稻、玉米、棉花RPFAM-acatgaacagcgccttgaccacagcFRPFAM-tcccgaactatgactccagaacctaccctatcc表A.1(續(xù))引物/探針序列(5'-3')產(chǎn)物大小適用范圍F對(duì)大米是內(nèi)源基因RPFRPFAM-cacgccgtggaaacagaagacatgacc轉(zhuǎn)基因植物品系特異性檢測(cè)用引物探針序列見(jiàn)表B.1。品系名稱(chēng)引物/探釷序列(5'-3')終濃度產(chǎn)物大小FuatlcaaaataagatcatacataRPFAM-cctttccatttggg-MGBFRPRPM章bigtcataccgtcatggtgt-TAMRRPFAM-tgacacaaatgatttcatacaaaagtcgagaFkPFAMhstagagateegtcaacatggtggagcacTAFRPFAM-tcagtgtttgacacacacactaagcgtgccFaacagaagtttccgttgagRPFAM-tttggggaagctgtcccatgcccFRPFAM-aagagactcagggtgttgttatcactgcgg品系名稱(chēng)引物/探針序列(5'-3)終濃度產(chǎn)物大小FRPFAM-cccggacatgaagccattacaattgacFRPFAM-aatgtggttcatccgtctt-FRPFAM-tcccggacttagctcaaaatgcatgtaFRPFAM-tttctcaacagcaggtgggtccgggtFaagagataacaggatccacPFAM-tggtaccacgcgacacacttccactcFRPFAM-ttccatgaccaaaatcccttaacgtgagtFRPFAM-agcaaccagatcggccgacaccFRPFAM-aacatcctttgccattgcccagcFRPFAM-tgaacacccatccgaacaagtagggtcaFRPFAM-tcattgagtcgttecgccattgtcgFRPFAM-gtcgacctgcaggcatgcaaggaattccatt表B.1(續(xù))品系名稱(chēng)引物/探針序列(5'-3')終濃度產(chǎn)物大小FRPFAM-taactcaaggccctcactccgFRPFAMtttaaactgaaggCgggaaacgacaaRPFAM-aggcgggaaacgacaatctgatcatgFRBFAMacgeIgag中ctg工AMRAF0pFAM-cgagcggtatggg5F0FRPFAM-tcccgccttcagtttaaacagagtcgggtRPFAM-ctctatcgatccceetetttgatagttaanct-TFRPFAM-tctagacaattcagtacattaaaaacgtccgccaFRPFAM-cgtagctaaccttcattgtattccgFRPFAM-agggagtatgtagataaatttcaaagcgttagacggc品系名稱(chēng)引物/探針序列(5'-3′)產(chǎn)物大小FRPFAM-ttgtccctccacttcttctc-FRPFAM-atcagattgtcgttcccgccttcagtt-FRPFAM-ccgctctagaactagtggatctgcactgaa-FRPFAM-aactatcagtgttgactacat-MFRPFAM-cttaacagtactcggccgtcgaccgc-FRPFAM-ctccatggcgatcgctacgttctagaatt-FRFAM-ttgggttaataaagtcagattagagggagacaa-FaaatattaacaatgcattgRPFAM-tactcattgctgatccatgtagattcccg-FRPFAM-tcgcgcgcggtgtcatctatctc-FRPFAM-cctgcaggtcgacggccgagtac-FRPFAM-atctgcccagcactcgtccg-品系名稱(chēng)引物/探針序列(5'-3')產(chǎn)物大小FR