高效毛細(xì)管電泳技術(shù)

高效毛細(xì)管電泳技術(shù)

中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院施榮華

辦公室電話63607433郵箱rhsh@“工欲善其事必先利其器”

有了回旋加速器，核物理學(xué)才有了進(jìn)展有了掃描隧道顯微鏡，才有納米科學(xué)的發(fā)展與諾貝爾獎(jiǎng)有關(guān)的技術(shù)發(fā)明2014年埃里克·貝齊格等在超分辨率熒光顯微技術(shù)領(lǐng)域取得的成就2008年美國(guó)錢(qián)永健等發(fā)現(xiàn)和改造了綠色熒光蛋白2002年日本人田中耕一等發(fā)展了對(duì)生物大分子進(jìn)行鑒定和結(jié)構(gòu)分析的方法，建立了軟解析電離法對(duì)生物大分子進(jìn)行質(zhì)譜分析1993年，美國(guó)凱利·穆利斯發(fā)展了以DNA為基礎(chǔ)的化學(xué)研究方法，開(kāi)發(fā)了聚合酶鏈鎖反應(yīng)（PCR）1948年瑞典人阿爾內(nèi)·蒂塞利烏斯對(duì)電泳現(xiàn)象和吸附分析進(jìn)行深入研究，分離了血清蛋白的幾種主要成分前言電泳帶電物質(zhì)在電場(chǎng)中的泳動(dòng)

毛細(xì)管電泳被分離物質(zhì)在毛細(xì)管中的電泳高效毛細(xì)管電泳高效率高度自動(dòng)化的毛細(xì)管電泳高效毛細(xì)管電泳(highperformancecapillaryelectrophoresis,HPCE)

作為90年代最重要的分離分析手段之一，HPCE是當(dāng)今分析化學(xué)和分析生物化學(xué)的公認(rèn)前沿。HPCE技術(shù)的誕生象征著人類(lèi)開(kāi)始進(jìn)入納米技術(shù)時(shí)代。其涉及范圍包括諸如物理學(xué)、化學(xué)、電子學(xué)、光學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)等眾多學(xué)科和領(lǐng)域。前言HPCE的發(fā)展歷程：

?

1808年俄國(guó)物理學(xué)家VonReuss首次發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象；

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1937年，

瑞典的蒂塞利烏斯（Tiselius）將電泳發(fā)展成為一種分離技術(shù)，因?qū)﹄娪痉治龊臀椒椒ǖ难芯?，特別是發(fā)現(xiàn)了血清蛋白的組分而獲得1948年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)；

?1981年Jorgenson和Lukacs發(fā)展的現(xiàn)代毛細(xì)管電泳技術(shù)首次在75微米口徑的毛細(xì)管內(nèi)分離氨基酸，理論塔板（表示分離效率的參數(shù)）數(shù)達(dá)到40萬(wàn)；【理論塔板數(shù)=5.54(保留時(shí)間/半高峰寬)2】

?1988年第一臺(tái)自動(dòng)化的毛細(xì)管電泳儀問(wèn)世；

?HPCE與其它技術(shù)聯(lián)用：CE-MS、LC-CE、CITP-CE等。HPCE能做什么？？？HPCE號(hào)稱(chēng)萬(wàn)能分析儀器，可以分離各種不同的樣品，包括：肽類(lèi)、蛋白、核酸、離子、手性化合物和藥物。各種化合物的定量定性分析分子相互作用細(xì)胞分析毛細(xì)管區(qū)帶電泳分離多肽混合物：

UV：214nmV：25KV

Buffer:硼酸鹽PH:6.5

蛋白等電點(diǎn)測(cè)定生物堿標(biāo)準(zhǔn)樣品定量

碳酸胺緩沖液:50mmol/L檢測(cè)波長(zhǎng)（PDA）：308nm

無(wú)涂層毛細(xì)管：50cm電壓：15KVPH:6.8

分子間相互作用的鑒定-------結(jié)核相關(guān)蛋白與銅離子絡(luò)合分析

下左圖,未加銅離子的分離

下右圖,加銅離子絡(luò)合后的圖譜毛細(xì)管電泳分析Hela細(xì)胞，左圖為新鮮的細(xì)胞，右圖為凋亡后的細(xì)胞，分離buffer為硼酸和硼砂緩沖液，PH8.0實(shí)物圖HPCE的結(jié)構(gòu)?

儀器結(jié)構(gòu)HPCE的結(jié)構(gòu)?毛細(xì)管柱

材料：要求1化學(xué)、電學(xué)惰性,2導(dǎo)(散)熱性強(qiáng)，3紫外-可見(jiàn)光透光性，4柔韌性，高強(qiáng)度，價(jià)廉。常用材料為熔融石英，外層涂聚酰亞胺；新材料有聚四氟乙烯(散熱性不好)。內(nèi)徑：25

—75m外徑：350—400m長(zhǎng)度：50cm左右Ki’1、內(nèi)可容納毛細(xì)管的制冷劑管道2、毛細(xì)管

3、UV和PDA檢測(cè)窗口

4、LIF檢測(cè)窗口檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)原理：1利用化合物對(duì)紫外光有吸收，將吸收光信號(hào)變?yōu)殡娦盘?hào)傳送給計(jì)算機(jī)，由計(jì)算機(jī)制作成電泳圖而被分析42利用化合物對(duì)特定發(fā)射光具有吸收而產(chǎn)生激發(fā)光，由激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器完成。檢測(cè)器選擇紫外/可見(jiàn)光檢測(cè)測(cè)器（UV/VIS）二極管陣列檢測(cè)器（DAD)激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器(LIF)HPCE的結(jié)構(gòu)?進(jìn)樣系統(tǒng)流體力學(xué)方式：進(jìn)樣端加壓、毛細(xì)管的出口抽真空、利用虹吸現(xiàn)象。進(jìn)樣量不受樣品基質(zhì)的影響。一般進(jìn)樣長(zhǎng)度不超過(guò)有效長(zhǎng)度的1%電動(dòng)方式：

用樣品換緩沖液并加電壓（分離場(chǎng)強(qiáng)的1/3—1/5）。對(duì)離子型組分有進(jìn)樣歧視

.

(正負(fù)離子不一樣)但適合于粘性介質(zhì)或

凝膠電泳時(shí)使用。HPCE的結(jié)構(gòu)?高壓系統(tǒng)

HPCE采用高電壓（10—30kV）加在毛細(xì)管兩端以產(chǎn)生高電場(chǎng)強(qiáng)度（100—500V/cm）。加大電壓可縮短電泳時(shí)間，提高分離度，使峰形變窄。HPCE的結(jié)構(gòu)HPCE的分離模式?毛細(xì)管區(qū)帶電泳（capillaryzoneelectrophoresis,

CZE）?膠束電動(dòng)色譜（micellarelectrokineticchromatography,MEKC）?毛細(xì)管凝膠電泳（capillarygelelectrophoresis,

CGE）?毛細(xì)管等電聚焦（capillaryisoelectricfocusing,CIEF）?毛細(xì)管等速電泳（capillaryisotachophoresis,

CITP）?毛細(xì)管電色譜（capillaryelectrochromatography,

CEC）?親和毛細(xì)管電泳（affinitycapillaryelectrophoresis,

ACE）?電動(dòng)色譜（electrokineticchromatography,EKC）?非水相毛細(xì)管電泳（non-aqueouscapillaryelectrophoresis,

NACE）毛細(xì)管區(qū)帶電泳CZE是HPCE是最簡(jiǎn)單的一種方式，主要原因是在CZE中毛細(xì)管內(nèi)只充入單純的緩沖溶液，溶質(zhì)以不同的速率在分立的區(qū)帶內(nèi)進(jìn)行遷移而被分離。由于電滲流（EOF）的存在，正、負(fù)離子都可以用CZE來(lái)分離，中性溶質(zhì)本身在電場(chǎng)中不移動(dòng)，隨EOF一起流出毛細(xì)管。

毛細(xì)管區(qū)帶電泳由于操作簡(jiǎn)單、多樣化，毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）是目前應(yīng)用最廣的一種方式，CZE的應(yīng)用范圍很寬，包括氨基酸分析、多肽分析、離子分析、廣泛的對(duì)映體分析和很多其它離子態(tài)物質(zhì)的分析。例如，在蛋白質(zhì)分析領(lǐng)域，CZE被用來(lái)進(jìn)行蛋白質(zhì)的純度鑒定、肽譜分析、等。毛細(xì)管區(qū)帶電泳原理：基于各被測(cè)物凈電荷與質(zhì)量比存在差異。不同離子表面電荷密度的差異使其以不同的速度在電解質(zhì)中移動(dòng)，最后達(dá)到分離。應(yīng)用：CZE成為目前應(yīng)用最廣泛的一種模式，適用于蛋白質(zhì)、氨基酸、多肽、對(duì)映體和離子等的分析。關(guān)于電滲流毛細(xì)管電泳所用的毛細(xì)管是由石英玻璃拉制的，在水溶液中由于硅烷醇基團(tuán)（硅羥基）離子化作用，使其內(nèi)表面帶負(fù)電荷，于是管壁和電解質(zhì)界面上形成雙電層，在外加電場(chǎng)作用下，雙電層中的水合陽(yáng)離子引起流體整體地向陰極流動(dòng)，形成電滲流（ElectroosmoticFlow，EOF）。

電滲流的作用

可以同時(shí)分離正負(fù)離子，帶電粒子的電泳速度是矢量相加的結(jié)果蛋白質(zhì)定量定性分析肽譜分析使用合適的酶消化蛋白質(zhì)，使之產(chǎn)生特定的一系列酶切肽段，在毛細(xì)管中就會(huì)分離出對(duì)應(yīng)的圖譜，這就是肽譜，可以大致鑒別蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)（類(lèi)似的原理可以推廣到中藥的指紋圖譜分析）毛細(xì)管區(qū)帶電泳如何提高分離效率？--------選擇性和添加劑的使用選擇性，即對(duì)溶質(zhì)遷移的先后順序進(jìn)行人為的干預(yù)，是由產(chǎn)生分離的機(jī)理所決定的，控制選擇性能夠提高分離度并且獲得確證的輔助性信息。毛細(xì)管區(qū)帶電泳緩沖溶液的選擇

操作緩沖溶液的選擇對(duì)于任何形式的HPCE的成功分離都是非常重要的。EOF對(duì)于pH的改變很敏感（但EOF本身的改變只會(huì)使遷移時(shí)間和分離度發(fā)生變化而不會(huì)影響出峰的順序。

），所以要求使用緩沖溶液以維持恒定的pH。緩沖溶液的有效緩沖范圍是pH在pKa±1的區(qū)間內(nèi)。毛細(xì)管區(qū)帶電泳在HPCE中應(yīng)該根據(jù)以下性質(zhì)來(lái)選擇緩沖溶液：·在所選的pH范圍內(nèi)有較強(qiáng)緩沖能力；·在檢測(cè)波長(zhǎng)處有低的紫外吸收；·小的淌度（即大體積、低電荷離子）以降低所產(chǎn)生的電流(避免發(fā)熱)。一些常用的緩沖溶液及其pH使用范圍見(jiàn)表13。那些被稱(chēng)為生物“優(yōu)良緩沖液”的（如Tris,borate,histidine,CAPS等）特別有用，因?yàn)檫@些緩沖溶液中的離子一般較大，能夠在較高濃度下使用而不會(huì)產(chǎn)生大的電流，但一個(gè)潛在的缺點(diǎn)是這些大的緩沖離子有強(qiáng)的紫外吸收。

毛細(xì)管區(qū)帶電泳緩沖溶液的pH

當(dāng)溶質(zhì)的pI相接近時(shí)，如多肽和蛋白質(zhì)，調(diào)節(jié)pH對(duì)分離特別有用。在pH高于或低于溶質(zhì)的pI值操作會(huì)使其所帶電荷改變，(高于PI則帶負(fù)電荷)從而使得溶質(zhì)在EOF之前或之后進(jìn)行遷移。當(dāng)pH低于pI時(shí)，溶質(zhì)帶凈的正電荷而向陰極遷移，在EOF之前流出；當(dāng)pH高于pI時(shí)則相反。由于溶融石英毛細(xì)管化學(xué)穩(wěn)定性較好，pH應(yīng)用范圍可以從2～12，但是在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，通常要受到溶質(zhì)的pH穩(wěn)定性所限。不同的緩沖液PH對(duì)分離的影響(提高PH影響蛋白2和3的出峰順序)毛細(xì)管區(qū)帶電泳

除了影響溶質(zhì)所帶電荷以外，pH的改變還伴隨著EOF的變化，因此需要對(duì)分離重新進(jìn)行優(yōu)化。例如在某一較低pH下，溶質(zhì)間有沒(méi)有足夠的分離度，但pH提高后改變了溶質(zhì)所帶電荷，EOF也可能增大以至于溶質(zhì)還未被分離就隨之流出毛細(xì)管，在這種情況下，可以增加毛細(xì)管的有效長(zhǎng)度，或者利用添加劑降低EOF,或者干脆用涂層毛細(xì)管來(lái)消除EOF。

毛細(xì)管區(qū)帶電泳表面活性劑

表面活性劑（如SDS）是HPCE中使用最多的一種緩沖溶液添加劑，在CZE中可以使用多種類(lèi)型的表面活性劑（陰離子型、陽(yáng)離子型、兩性離子型或非離子型）。在臨界膠束濃度（CMC）以下，離子型表面活性劑單體能夠作為疏水性溶質(zhì)的增溶劑，還可形成離子對(duì)或者作為毛細(xì)管內(nèi)壁改性劑。表面活性劑單體以?xún)煞N機(jī)理與溶質(zhì)發(fā)生相互作用：表面活性劑分子的帶電端與溶質(zhì)親水端的離子相互作用和/或其烷基鏈與溶質(zhì)疏水端之間的疏水相互作用。

毛細(xì)管區(qū)帶電泳

除了與溶質(zhì)發(fā)生相互作用以外，很多表面活性劑還會(huì)吸附在毛細(xì)管內(nèi)壁，改變EOF從而大大減小溶質(zhì)在管壁的吸附。根據(jù)表面活性劑所帶電荷不同，EOF可能增大、減小或者反向。例如在緩沖溶液中加入陽(yáng)離子表面活性劑如CTAB使EOF反向。CTAB單體分子通過(guò)離子性相互作用結(jié)合到毛細(xì)管內(nèi)壁，它們與自由CTAB分子間由于存在著疏水相互作用而使后者帶正電端遠(yuǎn)離管壁。表面活性劑濃度超過(guò)CMC將改變分離機(jī)理，形成

HPCE的另一種分離方式MEKC，隨后將討論它。

毛細(xì)管區(qū)帶電泳手性選擇劑等

手性分析在藥物和食品工業(yè)中正變得日益重要。目前手性分離主要是利用HPLC和GC進(jìn)行，復(fù)雜而難以令人滿意，而且手性固定相常常是很昂貴的。與使用手性固定相相比，利用CZE進(jìn)行手性分離非常簡(jiǎn)單，只需要在操作緩沖溶液中加入手性選擇劑，如環(huán)糊精、冠醚、膽汁鹽、Cu(Ⅱ)一天冬氨酸絡(luò)合物等。CE分離的高效率使其只需要少量的手性添加劑。毛細(xì)管區(qū)帶電泳

選擇性的調(diào)整可以通過(guò)調(diào)節(jié)手性添加劑的類(lèi)型和濃度來(lái)實(shí)現(xiàn)，也可以加入修飾劑，如醇類(lèi)、尿素和金屬離子來(lái)實(shí)現(xiàn)。CZE已成功地用于分離D型和L型氨基酸以及手性藥物、位置異構(gòu)體等物質(zhì)。環(huán)糊精（CDs）也可用于分離疏水性的非手性物質(zhì)，如多環(huán)芳烴。毛細(xì)管區(qū)帶電泳CDs是應(yīng)用最廣的手性選擇劑，它是非離子型的包含六、七、八個(gè)葡萄糖基單元的環(huán)狀低聚糖，分別叫作α-、β-、γ-CDs。CDs是一個(gè)兩端開(kāi)口的環(huán)狀空腔結(jié)構(gòu)，空腔直徑由組成它的葡萄糖基的數(shù)目決定，空腔內(nèi)壁呈弱的疏水性而外表面是親水性的，空腔周?chē)鷰в惺中缘亩?jí)醇羥基。CDs的手性識(shí)別是基于溶質(zhì)的疏水部分進(jìn)入到疏水性的空腔內(nèi)，而親水部分與手性的二級(jí)醇羥基形成氫鍵。不同的CDs衍生物，如羧烷基衍生物、丁二酰衍生物和可溶性的離子型聚合物，都可以用來(lái)改變選擇性和提高檢測(cè)性能。毛細(xì)管區(qū)帶電泳溫度盡管毛細(xì)管恒溫的主要目的是維持恒定的溫度以散逸焦耳熱，溫度也可以作為一個(gè)優(yōu)化CZE分離的參數(shù)。當(dāng)然保持恒溫主要是作為提高重現(xiàn)性考量的。毛細(xì)管區(qū)帶電泳毛細(xì)管內(nèi)壁改性

CZE對(duì)于小分子和大分子來(lái)說(shuō)都是一項(xiàng)重要的分離技術(shù)，但是溶質(zhì)與毛細(xì)管內(nèi)壁的相互作用，尤其是蛋白質(zhì)在毛細(xì)管內(nèi)壁的吸附，使分離效率大為降低。內(nèi)壁對(duì)蛋白質(zhì)吸附作用機(jī)理

毛細(xì)管區(qū)帶電泳毛細(xì)管內(nèi)壁改性不直接對(duì)毛細(xì)管壁作任何改性，采用極端的pH可以有效地降低離子性相互作用，但其局限性在于在非生物性的pH下，可能使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。采用高離子強(qiáng)度緩沖溶液能夠限制離子性相互作用，但是會(huì)產(chǎn)生大量的焦耳熱。使用小孔毛細(xì)管能夠降低熱效應(yīng)，但是高的比表面會(huì)加重蛋白質(zhì)——管壁間的相互作用。毛細(xì)管區(qū)帶電泳毛細(xì)管內(nèi)壁改性

進(jìn)行毛細(xì)管內(nèi)壁改性是限制溶質(zhì)吸附的一種選擇方案，有兩種基本的方法：

（a）通過(guò)共價(jià)鍵合或物理粘合進(jìn)行永久性改性；

（b）使用操作緩沖溶液進(jìn)行動(dòng)力學(xué)去活。兩種方法各有其成功之處，但沒(méi)有哪一種方法占明顯優(yōu)劣。

毛細(xì)管區(qū)帶電泳形成鍵合相或粘合相

先進(jìn)行硅烷化再用合適的官能團(tuán)去活是應(yīng)用最廣的方法?？梢岳貌煌奈镔|(zhì)去活，如聚丙烯酰胺、五氟代芳基或多糖類(lèi)。但是硅氧鍵（Si-O-Si）只有在pH4-7的范圍內(nèi)才是穩(wěn)定的，而且使用時(shí)會(huì)發(fā)生水解，限制了它的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。

化學(xué)鍵合物理吸附毛細(xì)管區(qū)帶電泳形成鍵合相或粘合相

共價(jià)改性劑是很穩(wěn)定的，不需要特殊保存。由于毛細(xì)管用后通常需要清洗（即使涂壁以后仍不能完全消除吸附），它們必須對(duì)清洗溶液穩(wěn)定而且耐沖洗。遺憾的是，大多數(shù)涂層的穩(wěn)定性是有限的。毛細(xì)管區(qū)帶電泳動(dòng)力學(xué)去活

除了與管壁形成鍵合相或粘合相以外，把改性劑直接加到操作緩沖溶液中是毛細(xì)管壁改性的另一種方法。動(dòng)力學(xué)涂壁的優(yōu)點(diǎn)是其動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性，因?yàn)楦男詣┐嬖谟诰彌_溶液中，管壁表面的改性劑被連續(xù)更新，不要求其熱力學(xué)穩(wěn)定。與共價(jià)涂層一樣，添加劑能夠與毛細(xì)管壁作用而改變其電荷和疏水性，這一類(lèi)改性劑很容易補(bǔ)充和更換，因?yàn)橹恍璋阉鼈內(nèi)芙庥诰彌_溶液中即可。但是重現(xiàn)比較差。膠束電動(dòng)色譜

原理：是電泳技術(shù)與色譜技術(shù)的交叉，它由Terabe于1984年提出，在操作緩沖液中加入表面活性劑（如8~9mMSDS），形成疏水內(nèi)核、外部帶負(fù)電的膠束相，根據(jù)分子在膠束相-溶液兩相中的分配系數(shù)不同進(jìn)行分離測(cè)定，還可以通過(guò)形成手性的復(fù)合膠束用于手性對(duì)映體的拆分。應(yīng)用：是目前唯一既能分離中性又能分離帶電組分的HPCE模式。表面活性劑的種類(lèi)按極性基團(tuán)的解離性質(zhì)分類(lèi)1、陰離子表面活性劑：硬脂酸，十二烷基苯磺酸鈉

2、陽(yáng)離子表面活性劑：季銨化物3、兩性離子表面活性劑：卵磷脂，氨基酸型，甜菜堿型4、非離子表面活性劑：脂肪酸甘油酯，脂肪酸山梨坦（司盤(pán)），聚山梨酯（吐溫）根據(jù)親水基進(jìn)行分類(lèi)，分為羧酸鹽、硫酸鹽、季銨鹽、PEO衍生物、內(nèi)酯等膠束電動(dòng)色譜用MEKC分離中性組分需要在操作緩沖溶液中加入表面活性劑，在臨界膠束濃度（例如對(duì)SDS為8—9mM）以上，單個(gè)的表面活性劑分子之間聚集而形成膠束。膠束是一個(gè)團(tuán)狀結(jié)構(gòu)，表面活性劑分子疏水性的一端聚在一起朝向里從而避開(kāi)了親水性的緩沖溶液，帶電荷的一端則朝向緩沖溶液。分離機(jī)理是基于膠束與中性分子之間的相互作用。

膠束電動(dòng)色譜表面活性劑分子和膠束通常是帶電的，它們沿與EOF相同或相反的方向遷移（取決于其所帶的電荷）。陰離子表面活性劑，如SDS向陽(yáng)極遷移，與EOF的方向相反。由于在中性和堿性pH下，EOF的移動(dòng)通常比膠束的遷移速率快，膠束的實(shí)際移動(dòng)方向是與EOF一致的。膠束在移動(dòng)過(guò)程中，與色譜行為相似，能夠與溶質(zhì)發(fā)生疏水性和靜電相互作用。

膠束電動(dòng)色譜

對(duì)于中性組分來(lái)說(shuō)，分離僅受溶質(zhì)進(jìn)入和離開(kāi)膠束這一行為的影響。由于膠束遷移方向與EOF相反，溶質(zhì)與膠束間作用力越強(qiáng)，遷移時(shí)間越長(zhǎng)，當(dāng)溶質(zhì)不與膠束作用時(shí)，僅隨EOF一起移動(dòng)。溶質(zhì)的疏水性越強(qiáng)，與膠束間的作用力越強(qiáng)，“保留”時(shí)間也就越長(zhǎng)。中性溶質(zhì)在MEKC中的分離機(jī)理與色譜分離類(lèi)似，可以用修改后的色譜關(guān)系式來(lái)描述。

膠束電動(dòng)色譜

在MEKC中很容易控制選擇性，使用不同的表面活性劑以形成具有不同物理性質(zhì)（如大小、電荷、幾何形狀）的膠束就能使選擇性發(fā)生顯著變化，就象在LC中改變固定相一樣。表面活性劑可以是陽(yáng)離子型的、陰離子型的、非離子型的、兩性離子型的或者是幾種類(lèi)型的混合使用。

在各種情況下都可以通過(guò)改變緩沖溶液濃度、pH、溫度及使用添加劑，如尿素、金屬離子或手性選擇劑等方法來(lái)改變MEKC的選擇性。膠束電動(dòng)色譜與色譜分離一樣，在MEKC中也可以加入用來(lái)控制溶質(zhì)——膠束之間的相互作用的有機(jī)修飾劑。已經(jīng)成功應(yīng)用的有機(jī)修飾劑有甲醇、乙腈、異丙醇等。有機(jī)溶劑的用量一般在占操作緩沖溶液的50%（V/V）以下。有機(jī)溶劑的加入將削弱溶質(zhì)與膠束間的疏水相互作用，同時(shí)也將削弱維持膠束結(jié)構(gòu)的表面活性劑分子間的疏水分子相互作用，加快色譜動(dòng)力學(xué)。毛細(xì)管凝膠電泳

在毛細(xì)管中裝入單體，引發(fā)聚合形成凝膠的CE模式，主要用于測(cè)定蛋白質(zhì)、DNA等大分子化合物。它是基于分子尺寸，讓溶質(zhì)在合適的起“分子篩”作用的聚合物內(nèi)進(jìn)行電泳而分離。當(dāng)帶電溶質(zhì)在電場(chǎng)力的推動(dòng)下在聚合物的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)遷移時(shí)，其運(yùn)動(dòng)要受到一定程度的阻礙，大分子受到的阻礙比小分子大。大分子物質(zhì)，如DNA和被SDS飽和的蛋白質(zhì)，由于其質(zhì)荷比與分子大小無(wú)關(guān)，沒(méi)有凝膠存在不可能實(shí)現(xiàn)分離。以DNA為例，DNA鏈每增加一個(gè)核苷酸，就增加一個(gè)相同的質(zhì)量和電荷單位，對(duì)它在自由溶液中的淌度沒(méi)有影響。毛細(xì)管凝膠電泳原理：是一種將凝膠移到毛細(xì)管中作支持物進(jìn)行的電泳。由于溶質(zhì)分子體積不同，在起分子篩作用的聚合物內(nèi)進(jìn)行電泳時(shí)被分離。應(yīng)用：適用于生物大分子的分析，如蛋白質(zhì)、寡聚核苷酸、DNA、RNA，還可用于PCR產(chǎn)物分析。毛細(xì)管凝膠電泳CE比傳統(tǒng)的板式凝膠電泳優(yōu)點(diǎn)在于：可以施加比板式電泳高10—100倍的場(chǎng)強(qiáng)而不會(huì)引起對(duì)分離不利的焦耳熱效應(yīng)。毛細(xì)管柱上檢測(cè)和儀器的自動(dòng)化操作。而且，由于毛細(xì)管本身已經(jīng)具有抗對(duì)流的作用，不必再使用具有抗對(duì)流性質(zhì)的凝膠。

缺點(diǎn)是制備功能遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及板式電泳，當(dāng)然，現(xiàn)在使用大孔徑毛細(xì)管（內(nèi)徑>100—200μm）和低場(chǎng)強(qiáng)，在HPCE中也能實(shí)現(xiàn)一定程度的制備型分離。毛細(xì)管凝膠電泳在傳統(tǒng)的板式或管式電泳中常用交聯(lián)的聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠，前者網(wǎng)孔（或孔尺寸）較小，用于分離蛋白質(zhì)，后者網(wǎng)孔大，適合于分離DNA。在板式或管式電泳中，這些介質(zhì)不僅起尺寸分離的作用，而且能夠抑制對(duì)流并保持自身形狀不變。瓊脂糖電泳使所用凝膠的最小濃度和組成有一定的限制，但是由于小孔毛細(xì)管具有抗對(duì)流的作用，這一限制在CGE中就放寬了。毛細(xì)管凝膠電泳CGE中所使用的“凝膠”這個(gè)詞有些含混不清，因?yàn)橐话隳z是指在板式凝膠電泳中所形成的那種類(lèi)似固體一樣的結(jié)構(gòu)，而CGE中所使用的“凝膠”并不（也不需要）具備這個(gè)特點(diǎn)，把它叫做“聚合物網(wǎng)”更為恰當(dāng)。CGE中使用的聚合物可以是共價(jià)交聯(lián)的（如雙—聚丙烯酰胺）、氫鍵結(jié)合的（如瓊脂糖）或是線狀的聚合物溶液（如聚丙烯酰胺或甲基纖維素）。雖然非交聯(lián)凝膠的聚合物結(jié)構(gòu)與交聯(lián)凝膠有著根本區(qū)別，但它們的分離機(jī)理是相同的，兩種凝膠都能實(shí)現(xiàn)大分子尺寸分離。毛細(xì)管凝膠電泳交聯(lián)聚丙烯酰胺是一種廣泛應(yīng)用的基體，它在使用時(shí)就地聚合，聚合后不能從毛細(xì)管內(nèi)除去。制備這種凝膠時(shí)要特別小心，聚合反應(yīng)過(guò)快，使用未經(jīng)脫氣的溶液，或者化學(xué)藥品的不純都會(huì)使聚合時(shí)出現(xiàn)空泡或形成不穩(wěn)定的凝膠。交聯(lián)聚丙烯酰胺的一個(gè)潛在缺點(diǎn)是它的剛性，使用時(shí)如果樣品較臟，毛細(xì)管未端堵塞，或者出現(xiàn)空泡都使得毛細(xì)管不能再用。因此要格外小心，防止以上情況發(fā)生。如果使用正確，一根毛細(xì)管可以進(jìn)樣多次，但是由于凝膠的剛性，不能采用流體動(dòng)力進(jìn)樣。毛細(xì)管凝膠電泳低粘度的聚合物溶液可以利用壓力進(jìn)樣，管內(nèi)凝膠可以重復(fù)更換（取決于其濃度和粘度），而且不易受空泡形成和其它因素的影響。當(dāng)凝膠具備上述穩(wěn)定性時(shí)，其粘度越低，對(duì)毛細(xì)管壁涂（如果使用的話）的依賴(lài)性越高。不論用哪種方式，通常都進(jìn)行毛細(xì)管涂壁以降低EOF。

毛細(xì)管凝膠電泳

CGE的分離度和分離效率與CZE相當(dāng)，因?yàn)樗鼈兌紝儆凇皡^(qū)帶”電泳技術(shù)。一個(gè)明顯的差別在于CGE對(duì)DNA分離具有極高的效率。用交聯(lián)聚丙烯酰胺分離單鏈寡聚核苷酸能達(dá)到超過(guò)107/米的塔板數(shù)。與CZE相似，CGE的選擇性可以通過(guò)加入手性選擇劑、離子對(duì)試劑或其它更復(fù)雜的試劑（如分析DNA加入ethidiumbromide，分析蛋白質(zhì)加入SDS）來(lái)調(diào)節(jié)，這些試劑可以鍵合到凝膠上，也可以直接加到操作緩沖溶液中。毛細(xì)管等電聚焦毛細(xì)管等電聚焦（CIEF）是一項(xiàng)依據(jù)pI進(jìn)行多肽或蛋白質(zhì)分離的“高分辨”電泳技術(shù)。CIEF能分離僅相差0.005甚至更低的pI單位的蛋白質(zhì)。與CGE相似，這是一項(xiàng)把凝膠電泳應(yīng)用到CE中的新技術(shù)。原理：用兩性電解質(zhì)在毛細(xì)管內(nèi)建立pH梯度，使具有不同等電點(diǎn)（pI）的多肽或蛋白質(zhì)在電場(chǎng)力的作用下遷移到等電點(diǎn)的位置，形成非常窄的聚焦區(qū)帶。該方法能分離僅差0.005甚至更低pH單位的蛋白質(zhì)。應(yīng)用：已成功地用于測(cè)定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)、分離異構(gòu)體或其它方法難以分離的蛋白質(zhì)、多肽等。毛細(xì)管等電聚焦在CIEF中，首先要用兩性電解質(zhì)在毛細(xì)管內(nèi)建立pH梯度。兩性電解質(zhì)是指那些同時(shí)具有酸性基團(tuán)和堿性基團(tuán)（兩性離子），而且在CIEF實(shí)驗(yàn)所需要的pH范圍內(nèi)（如pH3—9）具有廣泛pI值的物質(zhì)。當(dāng)把毛細(xì)管內(nèi)充滿溶質(zhì)混合物和兩性電解質(zhì)后pH梯度很快形成。陰極放到堿溶液中，陽(yáng)極放到酸溶液中，施加電場(chǎng)后，帶電的兩性離子和蛋白質(zhì)在介質(zhì)中開(kāi)始遷移直到它們到達(dá)一個(gè)不帶電的區(qū)域（在其pI處），這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為“聚焦”。蛋白質(zhì)在CIEF中能夠保持在一個(gè)很窄的區(qū)帶內(nèi)，因?yàn)橐坏┧M(jìn)入一個(gè)不同于其pI值的pH區(qū)域就會(huì)帶上電荷，在電場(chǎng)力的作用下又會(huì)遷移回pH等于其pI處。毛細(xì)管等電聚焦聚焦過(guò)程可以利用電流來(lái)指示，一旦聚焦完成即達(dá)到穩(wěn)態(tài)，電荷不再移動(dòng)。聚焦完成后移動(dòng)溶質(zhì)和兩性電解質(zhì)使區(qū)帶通過(guò)檢測(cè)器，這種移動(dòng)可以通過(guò)從毛細(xì)管一端施加壓力或在一個(gè)電極槽中加入鹽類(lèi)來(lái)實(shí)現(xiàn)。毛細(xì)管等電聚焦在CIEF中需要降低或消除EOF，因?yàn)镋OF會(huì)使得兩性電解質(zhì)在溶質(zhì)聚焦完成之前就流出毛細(xì)管?？梢允褂脛?dòng)力學(xué)涂