綿羊體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程

1綿羊體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了綿羊體外胚胎生產(chǎn)過程中的體外成熟、體外受精和早期胚胎體外培養(yǎng)、胚胎移植等內(nèi)本文件適用于綿羊體外胚胎生產(chǎn)程序。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。NY/T1234牛冷凍精液生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程NY/T1571羊胚胎移植技術(shù)規(guī)程3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。體外成熟Invitromaturation卵母細胞在體外恢復(fù)減數(shù)分裂并發(fā)育到第二次減數(shù)分裂中期（MII）這一過程，經(jīng)歷核成熟和細胞質(zhì)成熟。3.2體外受精Invitrofertilization哺乳動物的精子和卵子置于適宜的培養(yǎng)條件下使之完成受精的一種技術(shù)。3.3胚胎移植EmbryoTransfer將體外或體內(nèi)生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)胚胎移植給另外一個同種、生理狀態(tài)相同的受體動物體內(nèi)，使之繼續(xù)妊娠發(fā)育為新個體的技術(shù)。4器皿清洗和消毒器皿的清洗和消毒方法參照NY/T1234執(zhí)行。25體外胚胎生產(chǎn)培養(yǎng)液配制體外成熟培養(yǎng)液、抽卵液、洗卵液、受精液（IVF液）和胚胎發(fā)育液（IVC液）配方見附錄A。6操作前準(zhǔn)備實驗室和超凈工作臺紫外燈，照射20min后用酒精擦拭消毒；待關(guān)閉實驗室紫外燈30min后，操作人員將雙手清洗干凈后，更換拖鞋進入實驗室，并隨手關(guān)閉實驗室門；穿戴工作服、口罩、手套、帽子等；用75%酒精噴灑消毒雙手；工作臺和加熱臺消毒滅菌：實驗室工作臺，顯微鏡以及加熱臺面用酒精擦拭消毒，并且將加熱臺打開預(yù)熱。7卵母細胞體外成熟7.1準(zhǔn)備工作7.1.1拉制揀卵針點燃酒精燈，拉制多根適宜的撿卵針，口徑大于卵丘卵母細胞復(fù)合體，管口在火焰上燒圓鈍，并使用酒精燈火焰滅菌。7.1.2制作成熟液滴實驗開始前制作卵母細胞成熟液滴（100μl成熟液滴，覆蓋3.5mL礦物油并放入二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)平衡2h以上；采卵液于37℃恒溫板上提前預(yù)熱。7.2檢卵將采集后的卵母細胞迅速送回實驗室，操作人員將其推入60mm平皿，平皿底部畫線，在體式顯微鏡下依橫線從左到右、從上到下的順序仔細挑選卵，將撿出的卵母細胞放置于盛有采卵液的30mm平皿。將撿卵皿順時針方向晃動，集中皿中的卵子，待撿出全部的卵母細胞后，依次將皿擺放恒溫板上，統(tǒng)一復(fù)檢；將挑選出的卵母細胞依次使用采卵液、平衡后的成熟液洗滌3次。8體外成熟將洗滌好的卵母細胞，按15/20枚/100μl液滴的密度，移入成熟液滴中，后放入二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)22h～24h；記錄成熟時間、成熟培養(yǎng)的卵母細胞數(shù)量。培養(yǎng)條件為5%CO2、95%空氣、38.6℃、飽和濕度。8.1記錄記錄抽卵時間、供體羊耳號、供體羊數(shù)、品種、抽卵人員、卵泡數(shù)、回收卵總數(shù)、可用卵數(shù)（根據(jù)卵丘卵母細胞復(fù)合體形態(tài)，將其分為A、B、C級）、退化卵數(shù)（胞質(zhì)不均勻、卵丘擴散嚴(yán)重）、裸卵數(shù)。9卵母細胞體外受精9.1準(zhǔn)備工作3體外受精實驗開始前，在二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)，平衡受精液（IVF液）2h～3h；37℃預(yù)熱0.2%的透明質(zhì)酸酶工作液。9.2準(zhǔn)備體外受精精液9.2.1精液選擇根據(jù)前期試驗結(jié)果，選擇體外受精效果較好的公羊號和相同生產(chǎn)批次的精液，并根據(jù)體外成熟卵母細胞的數(shù)量計算所需的凍精數(shù)量。9.2.2解凍精液從液氮中找到所需精液，置于37℃水浴鍋內(nèi)解凍1min后將細管取出，用紗布將凍精細管外部水分擦干。剪去凍精細管封口端，緊貼離心管壁，再將帶有棉塞的另一端剪掉，待精液自動流入離心管后，輕彈凍精細管，使剩余精液流出，用移液槍輕吹混勻。9.2.3檢查精子活力取約3μl精液置于載玻片上，蓋上蓋玻片后，觀察精子活力（視野內(nèi)直線運動精子數(shù)量占總精子數(shù)比例）和密度，再綜合前期相同個體凍精的受精數(shù)據(jù)，使用精子上游法預(yù)估上游后獲得的精子數(shù)量（未曾使用過的新批次精液，必須做預(yù)實驗，且受精效果較好，才能用于后續(xù)生產(chǎn)。）9.2.4上游精液將試管架置于37℃加熱臺上，移液槍吸取約100μl精液，緩慢注入裝有500μl受精液的試管底部，后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)上游30min。9.3處理卵母細胞將體外成熟培養(yǎng)22h～24h的卵母細胞取出，并觀察卵母細胞成熟情況，記錄卵丘細胞擴展情況；用移卵針將全部卵母細胞移入預(yù)熱的0.2%透明質(zhì)酸酶液滴中，輕吹直至剩余2-3層卵丘細胞，后依次使用抽卵液、受精液洗滌3次。將洗滌后的卵母細胞按50～60枚/100μl受精液（四孔板）或15～20枚/100μl受精液的密度移入受精液中。9.4體外受精將上游30min后的精液從培養(yǎng)箱中取出，用移液槍，沿試管壁從每管上游液中吸取200～300μl上清液加入提前預(yù)熱好的離心管中，1500rpm離心4min后棄掉上清液，剩余約30～50μl精子沉淀（每個精子上游試管），將精子沉淀輕輕混勻。用移液槍吸取精子沉淀，傾斜槍頭從邊緣插入受精液滴或孔，對準(zhǔn)卵母細胞后吹出精液，使其吹散而不結(jié)團（每換液滴必須更換槍頭），后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20h。10體外培養(yǎng)預(yù)先將綿羊胚胎體外發(fā)育液（IVC液）在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中平衡2h以上。將體外受精20h~22h的卵母細胞取出置于IVC液內(nèi)，移液槍輕吹以去除黏附的精子及全部卵丘細胞，使用IVC液洗滌3次并對受精卵進行選擇（淘汰胞質(zhì)不均勻、胞質(zhì)發(fā)黑及死卵之后按50～60枚/500μlIVC液（四孔板）或15～20枚/100μlIVC液的密度移入IVC液中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：90%N2、5%O2、5%CO2、38.6℃、飽和濕度。410.1觀察胚胎發(fā)育情況受精后第48h統(tǒng)計卵裂率（卵裂的個數(shù)/總卵母細胞數(shù)）；受精后第168h統(tǒng)計囊胚率（囊胚的個數(shù)/卵裂的個數(shù)）并對囊胚進行評分。11胚胎移植胚胎移植方法參照NY/T1571進行。5附錄A體外胚胎生產(chǎn)培養(yǎng)液配制A.1卵母細胞體外成熟液配制0.02IU/mLFSH、0.02IU/mLLH、1μg/mLE2、0.1mmol/L半胱胺、1mLFBS、0.1ml青鏈霉素合劑，使用TCM-199培養(yǎng)基定容至10mL，混勻后用Millipore0.22μm的過濾器過濾，在0℃~5℃條件下可保存2周。A.2抽卵液配制0.05gBSA、0.035g肝素鈉、0.5mL青鏈霉素合劑，使用PBS定容至50mL，混勻后用Millipore0.22μm的過濾器過濾，在0℃~5℃條件下可保存2周。A.3SOF液配制3.1452gNaCl、0.2675gKCl、0.0814gKH2PO4、0.0442gMgSO4、0.2655g丙酮酸鈉、1.3115gCaCl2、0.0251g肌醇、0.0074g谷氨酰胺、300μL乳酸鈉、0.5mL青鏈霉素合劑、1%酚紅，使用胚胎水定容至50mL，混勻后用Millipore0.22μm的過濾器過濾，在0℃~5℃條件下可保存2周。A.4受精液(IVF液)配制1mL發(fā)情羊血清、6IU/ml肝素鈉,使用SOF液定容至50mL，混勻后