抗多肽制備流程及原理

抗多肽制備流程及原理1、抗原多肽得設(shè)計

為產(chǎn)生有效得抗體,第一步就是設(shè)計好得抗原,此抗原可以來源于整個蛋白質(zhì)得一部分:一個或幾抗原決定簇區(qū)域得序列。(1)什么就是抗原決定簇？蛋白質(zhì)表面部分可以使免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體得區(qū)域叫抗原決定簇。一般抗原決定簇就是由6－12氨基酸或碳水基團(tuán)組成,她可以就是由連續(xù)序列(蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu))組成或由不連續(xù)得蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)組成。(2)選擇抗原決定簇為選擇好得抗原決定簇,應(yīng)符合以下三點(diǎn):1、親水性(Hydrophilicity):大部分抗原決定簇就是親水性得;2、表面可接觸性(SurfaceAccessibility):大部分抗體只與蛋白質(zhì)表面部分結(jié)合;3、有彈性(flexibility):許多已知得抗原決定簇就是在自由活動區(qū)域。所以一般來說蛋白質(zhì)得N端及C端就是很好得抗原決定簇區(qū)域。(3)抗原性與免疫原性單獨(dú)得抗原決定簇就是不能產(chǎn)生免疫反應(yīng),她只有抗原性但沒有免疫原性,為使她能具有免疫原性,她必須偶聯(lián)在載體蛋白上。(4)抗原決定簇得預(yù)測對每個氨基酸得表面可接觸性、親水性和彈性進(jìn)行計算可以大體推算出抗原決定簇區(qū)域,抗原決定簇區(qū)域應(yīng)綜合以上三個特點(diǎn)。目前市面上有幾個專業(yè)測定軟件滿足需要:如MacVestor,Protean,GCG等。備注(5)設(shè)計多肽序列得長度抗原性區(qū)域確定以后,接下來要確定多肽得長度。關(guān)于選定多肽長度有兩種不同得觀點(diǎn)。一種觀點(diǎn)認(rèn)為長得多肽(20－40個氨基酸)比較好,因?yàn)殚L得多肽無疑會增加抗原基得數(shù)量。另一種觀點(diǎn)則認(rèn)為小得多肽更有效,使用小得多肽能保障所產(chǎn)生抗體得位點(diǎn)特異性。但有一點(diǎn)就是明確得,不管長度如何,所選多肽必須能夠較容易地通過生化合成得到,并且能溶解到水溶性緩沖劑進(jìn)行載體蛋白得耦聯(lián)。由于受副反應(yīng)得影響較大,高于二十個氨基酸得多肽通常很難進(jìn)行高純度合成,并且常常會含有缺失性序列。另一方面,太短得多肽(<10個氨基酸)則會產(chǎn)生識別特異性很強(qiáng)得抗體,以至于無法識別整體蛋白,或親和性很低。因此綜合考慮制備性抗原地多肽有效長度一般就是10－20個氨基。這種長度得多肽序列會最大程度得減小生化合成困難,具有一定得水溶性,也會具有一定程度得二級結(jié)構(gòu)。(6)設(shè)計合成多肽一旦抗原序列決定后,接下來就就是設(shè)計所需合成得多肽了,設(shè)計時除了注意其序列外,同時應(yīng)考慮一些產(chǎn)生免疫機(jī)制問題,如:1、載體蛋白得接入位置。2、如果其序列就是位于蛋白C端得,此多肽C端一定就是自由得羧基團(tuán),而N端被掩蓋。同時如果載體蛋白就是通過半胱氨酸偶聯(lián),此半胱氨酸應(yīng)處于N端位置,使C端完全暴露給免疫系統(tǒng)。3、相反,如果其序列就是位于蛋白質(zhì)N端,此多肽C端應(yīng)掩蓋,暴露出N端,而載體蛋白應(yīng)在C端。2、抗原多肽得耦聯(lián)策略化學(xué)合成得多肽抗原就是小分子,本身很難具有好得抗原性,只能誘導(dǎo)動物產(chǎn)生很弱得免疫反應(yīng),因而與載體蛋白耦聯(lián)就是很重要得。載體蛋白含有很多抗原決定基,能夠刺激T細(xì)胞,進(jìn)而誘導(dǎo)B細(xì)胞反應(yīng)。用于與多肽耦聯(lián)得載體蛋白有多種,其中最常用得就是(keyholelimpethemacyanin(KLH),牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA),卵清蛋白(ovalbumin,OVA)和牛甲狀腺球蛋白(bovinethyroglobulin,THY)。KLH具有更高得抗原性,就是最為常用得多肽耦聯(lián)載體。BSA也常用來作為多肽載體,但由于BSA經(jīng)常被用做檢測試驗(yàn)得阻斷劑而使得該方法生產(chǎn)得抗體在應(yīng)用上存在著一定得局限性。設(shè)計合成性多肽常常被忽略得一個方面就是如何將多肽耦聯(lián)到載體蛋白上。例如,N-端序列需要通過C-端氨基酸耦聯(lián),而C-端序列則需要通過N-端氨基酸耦聯(lián)。內(nèi)部序列則可以耦聯(lián)到任何一端。內(nèi)部序列耦聯(lián)得另一考量則就是將非共軛端?；虬被?因?yàn)樵鞍追肿有蛄兄胁粫袔щ姾傻媚┒?。最常用得耦?lián)方法都就是基于自由氨基(alph-氨基或Lys)、sufhydryl(Cys)或羧基集團(tuán)(Asp,Glu,或alpha-羧基)得存在。所有得耦聯(lián)方法都應(yīng)該就是通過羧基或氨基端殘基將多肽耦聯(lián)到載體蛋白上。所選序列不能有多個殘基都能參與所選耦聯(lián)化學(xué)反應(yīng)。如果多個反應(yīng)位點(diǎn)存在,可以考慮將多肽序列縮短,或者選擇所有反應(yīng)位點(diǎn)都位于一端得多肽。對于內(nèi)部序列通常會使用離所預(yù)測抗原位點(diǎn)較遠(yuǎn)得一端進(jìn)行耦聯(lián),這樣可以避免可能得屏蔽問題。大家有疑問的，可以詢問和交流可以互相討論下，但要小聲點(diǎn)除非研究人員另做說明,我們通常使用EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide

hydrochloride)或carbodiimide方法將多肽和載體進(jìn)行耦聯(lián)。Carbodiimides能激活天冬酰胺酸及谷氨酸得側(cè)鏈羧基集團(tuán)及末端羧基集團(tuán),使之與主胺基發(fā)生耦聯(lián)反應(yīng)。激活得多肽與載體蛋白混合而產(chǎn)生最終得共軛體。如果載體蛋白先被激活,EDC方法則通過N-末端alpha-氨基,或者,如果序列中有賴氨酸得話,則可以通過賴氨酸得側(cè)鏈氨基與載體蛋白耦聯(lián)。m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide酯(MBS)就是一種雙性多肽耦聯(lián)試劑,可以將多肽與載體蛋白通過半胱氨酸耦聯(lián)。耦聯(lián)發(fā)生在半胱氨酸得硫醇基。如果多肽序列中不包括半胱氨酸,可以將一個半胱氨酸加到多肽得N-端或C-端,以獲得可控性更強(qiáng)得多肽與載體蛋白得耦聯(lián)。為了合成方便,我們建議將半胱氨酸加到多肽得N-末端。戊二醛就是一種雙作用耦聯(lián)試劑,可以將兩個化合物通過氨基集團(tuán)耦聯(lián)在一起。戊二醛能起到非常靈活得間隔多肽和載體蛋白得作用,時多肽能盡可能得暴露給免疫系統(tǒng)。但就是,戊二醛就是一種反應(yīng)性很強(qiáng)得化合物,可以和Cys,Tyr及His等氨基酸發(fā)生一定程度得反應(yīng)。反應(yīng)后會形成結(jié)構(gòu)很難預(yù)測得共軛體。因此,如果多肽序列末端只含有一個單一得自由氨基時,戊二醛方法非常有用。如果多肽含有多個自由氨基集團(tuán),會形成多聚合物,結(jié)構(gòu)很難預(yù)測,盡管有很高得抗原性。因?yàn)榕c牛血清白蛋白(BSA)耦聯(lián)得多肽刺激產(chǎn)生得抗血清也含有針對BSA得抗體,一次可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果。盡管KLH較大并有抗原性,但她在耦聯(lián)過程中可能會沉淀,因而有時候會很難處理。卵清蛋白(OVA)就是另一種可以使用得載體蛋白。當(dāng)要檢驗(yàn)抗體只就是針對多肽而不就是針對載體蛋白時,OVA時用作第二載體得很好選擇。當(dāng)要將抗體抗載體蛋白得反應(yīng)降到最低時,可以使用兔血清白蛋白做載體。用RSA耦聯(lián)體免疫過得兔子不太可能產(chǎn)生針對載體得抗體,因?yàn)镽SA就是兔子自身得蛋白。如果注射動物不就是兔子RSA則不會被認(rèn)為就是自體蛋白。免疫系統(tǒng)就是對多肽－載體蛋白整體發(fā)生反應(yīng)得,即免疫反應(yīng)有一部分就是針對耦聯(lián)多肽,一部分就是針對中間連接體,有一部分就是針對載體蛋白。當(dāng)用ELISA做篩選時建議使用不同載體蛋白耦聯(lián)得多肽聚合物。如果ELISA就是在非耦聯(lián)多肽涂層得多孔板上做時則沒有必要這樣做。3、多肽合成原理

3、1多肽簡介肽鍵就是蛋白質(zhì)分子中氨基酸間得主要連接方式,就是一個alpha-NH2和一個alpha-COOH脫水縮合而成得酰胺鍵。一個氨基酸得α-羧基與另一個氨基酸得α-氨基之間失去一分子水相互連接而成得化合物稱為肽(peptide),由2個氨基酸縮合形成得肽叫二肽,由3個氨基酸縮合形成得肽叫三肽,少于10個氨基酸得肽稱為寡肽,由10個以上氨基酸形成得肽叫多肽,因此蛋白質(zhì)得結(jié)構(gòu)就就是多肽鏈結(jié)構(gòu)。每個肽在其一端有一自由氨基,稱為氨基端或N-末端,在另一端有一自由羧基,稱為羧基端或C-末端。3、2多肽合成原理化學(xué)合成多肽就把氨基酸按照一定得氨基酸排列順序和連接方式連接起來。為了得到具有特定氨基酸順序得合成多肽,采用逐步縮合得定向合成方法,即先將不需要反應(yīng)得氨基或羧基用適當(dāng)?shù)没鶊F(tuán)保護(hù)起來,再進(jìn)行連接反應(yīng),以保證反應(yīng)得定向進(jìn)行。對于長肽合成,一般有逐步增長和片段縮合兩種方式,前者由起始氨基酸(或肽)開始,每連接一次增長一個氨基酸,后者由C保護(hù)肽同N保護(hù)肽縮合來得到兩者長度相加得新肽鏈。3、3氨基保護(hù)氨基保護(hù)常用得保護(hù)基分為烷氧羰基、?；?和烷基三大類。因?yàn)镹烷氧羰基得保護(hù)得氨基酸在接肽時不易發(fā)生消旋化,故烷氧羰基使用最多。3、4羧基保護(hù)目前使用得羧基保護(hù)大致可以分為三種一種可以用堿皂化脫去,如甲酯、乙酯另一種可以用酸脫去,如叔丁酯、對甲氧芐酯,鄰苯二甲酰亞胺甲酯等第三種除了用酸或堿脫去外,還可以用其她得方法選擇性脫去,如芐酯、苯羰基甲酯、三甲硅乙酯3、5側(cè)鏈功能團(tuán)得保護(hù)由于不少氨基酸得側(cè)鏈都帶有能反應(yīng)得基團(tuán),如羥基、巰基、酚基、B-和r-羧基、胍基、咪唑基、吲哚基和硫醚基等,為了避免副反應(yīng)得發(fā)生,在多肽合成中往往也選用適當(dāng)?shù)帽Ｗo(hù)基將她們保護(hù)起來3、6肽鍵生成得方法形成肽鍵得方法基本可以分為四類:一就是羧基活化法;二就是氨基活化法;三就是四組份合成法;四就是利用蛋白水解酶得逆反應(yīng),亦稱酶促合成法。

羧基活化法得基本原理就是先將N-保護(hù)氨基酸或肽得a-羧基轉(zhuǎn)變成活化型得RCOX,從而有利于NH2R’對她進(jìn)行親核反應(yīng)生成RCONHR’。一般來說,取代基團(tuán)X得吸電子性越強(qiáng),其對羧基得活化能力也越強(qiáng)。羧基取代基得活化能力順序3、7肽鍵生成得方法羧基活化法有碳二亞胺法、混合酸酐法、活化酯法、NCA法等1、碳二亞胺法2、混合酸酐法:反應(yīng)一般分兩部進(jìn)行副反應(yīng):歧化反應(yīng)和酸酐分解:二酰胺得形成:羧酸酯氨解生成酰胺得反應(yīng)就是胺對酯進(jìn)行親核取代,因此增加R‘基團(tuán)得吸電子能力必將增加羰基碳原子得正電性而有利于氨解反應(yīng)得進(jìn)行。3、活化酯法活化酯得種類:1)芳基活化酯2)烯基酯3)與N-羥基化合物形成得活化酯4)活化酰胺5)固相活化酯活化酯得制備:1)DCC法2)轉(zhuǎn)酯反應(yīng)3)加成4)混合酸酐法4、NCA法優(yōu)點(diǎn):1)反應(yīng)速度快,肽合成周期短2)得到得氨基游離得肽可直接用于第2輪得肽合成3)側(cè)鏈可以較少得保護(hù),除NCA得側(cè)鏈需保護(hù)外,氨基組分只有Lys和Cys必須保護(hù)4)反應(yīng)有可能在水溶液中進(jìn)行。NCA得合成:酰氯法、光氣法3、8固相合成固相合成得主要設(shè)計思想就是:先將所要合成肽鏈得末端氨基酸得羧基以共價鍵得結(jié)構(gòu)同一個不溶性得高分子樹脂相連,然后以此結(jié)合在固相載體上得氨基酸作為氨基組分經(jīng)過脫去氨基保護(hù)基并同過量得活化羧基組分反應(yīng)接長肽鏈。這樣得步驟可以重復(fù)得多次進(jìn)行下去,即縮合→洗滌→去保護(hù)→中和和洗滌→下一輪縮合,最后達(dá)到所需要合成得肽鏈長度。固相合成流程示意:氨基酸在進(jìn)入目得肽之前,氨基端需要保護(hù)基。根據(jù)保護(hù)基得不同,多肽固相合成方法可以分為兩大類:Boc方法和Fmoc方法。4、抗多肽血清得制備4、1動物選擇

要生成好得抗體,必須選擇與抗原源差異較大得動物。要想獲得最大得免疫反應(yīng),絕對不能讓免疫動物對抗原產(chǎn)生‘自體識別’。例如,要想生成抗人體蛋白得抗體,使用兔或老鼠比使用猴子要好。對于非常保守得哺乳動物蛋白,使用鳥類動物(如雞)效果較好。4、2動物免疫

我們通常使用弗氏佐劑(Freund's)與抗原進(jìn)行混合。第一次注射完全使用Freund's得免疫輔助劑。輔助劑與抗原聯(lián)合使用,可以提高免疫反應(yīng),從而用較少得疫苗可以產(chǎn)生較強(qiáng)得免疫反應(yīng)。佐劑可以使抗原緩慢釋放,從而產(chǎn)生持續(xù)性刺激。注射方式為多位點(diǎn)得皮下注射。每只注射動物都要先收集免疫前血樣,以用于和以后得免疫血樣比較。所采集得血清樣本含有不同得免疫型和亞型。備注4、3抗多肽血清得制備(SOP)一、材料(帶√項(xiàng)目見附錄1)1、家兔:健康雄性家兔。至少準(zhǔn)備2只家兔,以防一只家兔死亡或者免疫接種失敗。2、肽一載體:上海強(qiáng)耀生物,規(guī)格2、5mg肽/瓶。3、PBS,(0、01mo1/L、pH7、4)4、弗氏完全佐劑(FCA)(sigma)5、弗氏不完全佐劑(FICA)(sigma)6、免疫抗原得制備取2、5mg肽-KLH溶解到2、5ml得PBS中,然后加入等體積得弗氏完全佐劑混合乳化(采用雙頭抽吸裝置乳化)。每只家兔接種混合物2、5mL。如果就是用弗氏不完全佐劑時,將上述“弗氏完全佐劑”替換為“弗氏不完全佐劑”。序號佐劑劑量(ml/只)免疫途徑間隔時間計劃時間1FCA總量2、5ml,每點(diǎn)約0、2-0、4ml脊柱兩側(cè)(2-4點(diǎn))和腹股溝部(2-4點(diǎn))多點(diǎn)皮內(nèi)和臀部肌肉注射(2點(diǎn))07月16日2FICA總量2、5ml,每點(diǎn)約0、2-0、4ml脊柱兩側(cè)(2-4點(diǎn))和腹股溝部(2-4點(diǎn))多點(diǎn)皮內(nèi)和臀部肌肉注射(2點(diǎn))14-21

7月30日3FICA總量2、5ml,每點(diǎn)約0、2-0、4ml脊柱兩側(cè)(2-4點(diǎn))和腹股溝部(2-4點(diǎn))多點(diǎn)皮內(nèi)和臀部肌肉注射(2