醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)基因功能研究的基本策略

基因功能研究的方法：動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)基因打靶基因沉默第一節(jié)轉(zhuǎn)基因動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)(transgenictechnology)：用重組DNA技術(shù)將外源基因?qū)氩⒄系剿拗骰蚪M內(nèi)，并使其在體內(nèi)表達(dá)和穩(wěn)定遺傳給后代。細(xì)胞模型轉(zhuǎn)基因動物轉(zhuǎn)基因植物一.轉(zhuǎn)基因生物的意義20世紀(jì)80年代(BrinsterandPalmiter)：著名的轉(zhuǎn)基因小鼠實驗：金屬硫蛋白基因啟動子驅(qū)動大鼠生長激素基因表達(dá)。轉(zhuǎn)基因生物的用途：研究手段：疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型。改良動物性狀：抗病性、耐寒性等。生產(chǎn)產(chǎn)品：抗體、疫苗等的生產(chǎn)。二、動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的基本原理1.外源目的基因分離；2.轉(zhuǎn)基因與表達(dá)載體重組；3.重組的轉(zhuǎn)基因?qū)胧芫鸦蚺咛ジ杉?xì)胞；4.轉(zhuǎn)基因胚胎的培養(yǎng)和移植；5.胚胎發(fā)育和生長的鑒定及轉(zhuǎn)基因動物品系的篩選；6.外源目的基因的整合率和表達(dá)效率檢測。（一）基本原理供體基因受體的受精卵（一）基本原理轉(zhuǎn)基因的受精卵（一）基本原理轉(zhuǎn)基因動物（二）基本過程上游—基因改造和載體構(gòu)建中游—基因轉(zhuǎn)移、胚胎移植與建系下游—基因整合、表達(dá)的檢測與細(xì)胞篩選1.上游—基因改造和載體構(gòu)建外源基因:完整的轉(zhuǎn)錄單位，由順式作用元件、結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄終止信號組成。報告基因:

在表達(dá)載體中引入易于檢測的報告基因。GFP、LacZ’、Apr。融合基因(fusiongene):將特定的目的基因與報告基因拼接成融合基因，并與順式作用元件拼接成完整的轉(zhuǎn)錄單位。動物轉(zhuǎn)基因常用的載體腺病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體非病毒類載體：如質(zhì)粒等。2.中游—基因轉(zhuǎn)移、胚胎移植與建系基因轉(zhuǎn)移技術(shù)

1)顯微注射法（microinjection)2)胚胎干細(xì)胞法(embryonicstemcells,ES)

3)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法

4)精子載體法1)DNA顯微注射法受精卵原核顯微注射法是最常用、最經(jīng)典基因轉(zhuǎn)移方法。持卵管DNA注射針精原核卵原核DNA顯微注射DNA顯微注射到尚未發(fā)生核融合的受精卵的精原核。顯微鏡下觀察，精原核比卵原核大，容易辨別。線性DNA整合效率比超螺旋DNA高出數(shù)倍，因而用于顯微注射的轉(zhuǎn)入基因通常是去除載體序列的線狀DNA。DNA顯微注射法的特點DNA大小無限制，最大可達(dá)250Kb。隨機整合：在染色體上整合的位點是隨機的，整合的拷貝數(shù)也不一定?？傂瘦^低(實際成功率1/1000)。提高顯微注射DNA表達(dá)的成功率轉(zhuǎn)入的外源基因要能夠高效表達(dá)，最好是可以誘導(dǎo)表達(dá)。轉(zhuǎn)入基因中應(yīng)該包含有幫助提高整合效率的序列，如微衛(wèi)星序列。微衛(wèi)星序列微衛(wèi)星序列誘導(dǎo)表達(dá)啟動子外源基因2)胚胎干細(xì)胞法胚胎干細(xì)胞(embryostemcells,ES細(xì)胞)：可人工培養(yǎng)增殖的小鼠胚泡發(fā)育期胚胎細(xì)胞，當(dāng)把這種胚胎細(xì)胞重新導(dǎo)入另一胚泡期的胚胎之后，它仍然保持著分化成其他類型細(xì)胞的能力。ES細(xì)胞具有與胚胎細(xì)胞相似的形態(tài)特征和分化特性。胚胎干細(xì)胞法分離和培養(yǎng)ES細(xì)胞。外源基因?qū)隕S細(xì)胞。導(dǎo)入外源基因的ES細(xì)胞的子宮轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)基因鼠的鑒定及鼠系建立。胚胎干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)胚泡培養(yǎng)皿中分離胚泡內(nèi)層細(xì)胞胰蛋白酶消化解離加飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞胚胎干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞外源DNA的導(dǎo)入DNA胚胎干細(xì)胞囊胚原囊胚轉(zhuǎn)基因動物磷酸鈣-DNA共沉淀法逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法電穿孔法微注射外源DNA的整合用于ES細(xì)胞的DNA載體一般帶有定點整合元件,避免了隨機整合。定點整合位點應(yīng)選擇在基因組內(nèi)編碼非必需產(chǎn)物的地方，以減少整合對細(xì)胞正常功能的影響。定點整合位點必須在基因組的可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的地方。胚胎干細(xì)胞法的特點定點整合。ES細(xì)胞在體外培養(yǎng)，外源DNA導(dǎo)入后可用正-負(fù)選擇法篩選擇正確整合的ES細(xì)胞,相對較簡單。目前只在小鼠身上獲得成功。3）逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建獲得四/八細(xì)胞胚胎/囊胚/原腸胚外源DNA導(dǎo)入早期胚胎：獲得病毒顆粒感染早期胚胎包裝細(xì)胞與早期胚胎共培養(yǎng)感染后的胚胎植入受體動物子宮，發(fā)育成攜帶外源基因的動物。逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法外源基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒感染四/八細(xì)胞胚胎/囊胚/原腸胚嵌合小鼠純合體小鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法的特點通過病毒DNA插入宿主DNA的機制，將外源目的基因整合到宿主基因組，整合效率高。反轉(zhuǎn)錄病毒載體容量有限，只能轉(zhuǎn)移小片段DNA(＜10kb)。對家禽類的轉(zhuǎn)基因研究有重要意義。4）精子載體法外源DNA精子卵細(xì)胞受精卵轉(zhuǎn)基因動物共育法脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法電穿孔法DNA精子受精卵DNA卵細(xì)胞DNA胚胎干細(xì)胞DNA逆轉(zhuǎn)錄病毒感染磷酸鈣-DNA共沉淀法逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法電穿孔法四細(xì)胞胚胎囊胚原腸胚轉(zhuǎn)基因動物微注射顯微注射3.下游—基因整合與表達(dá)檢測及篩選染色體基因水平：是否整合了外源基因以及整合的位點和拷貝數(shù)。轉(zhuǎn)錄水平：轉(zhuǎn)基因的mRNA的存在與否以及表達(dá)水平。蛋白水平：轉(zhuǎn)基因的蛋白質(zhì)的表達(dá)以及功能檢測。鑒定方法PCRSouthernblot染色體原位雜交NorthernblotRT-PCRWesternblot基因轉(zhuǎn)移鼠純合鼠系的建立×轉(zhuǎn)基因雜合鼠未轉(zhuǎn)基因鼠生殖系細(xì)胞中不含轉(zhuǎn)入基因生殖系細(xì)胞中含轉(zhuǎn)入基因子代多次交配可得到純合轉(zhuǎn)基因鼠系分析動物表型與外源基因的關(guān)系，揭示外源基因的功能。建立人類疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型?；虍a(chǎn)品的制備：乳腺、膀胱生物反應(yīng)器。三.轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用1.人類疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型各種人類遺傳病的鼠模型，如：老年性癡呆癥(Alzheimer’sdisease)、關(guān)節(jié)炎(arthritis)、肌肉營養(yǎng)缺乏癥(musculardistrophy)、腫瘤發(fā)生(tumorigenesis)、高血壓(hypertension)、神經(jīng)退行性疾病(neurodegenenerativedisorder)、內(nèi)分泌功能障礙(endocrinologicaldisfunction)、動脈硬化癥及其他很多疾病。2.利用轉(zhuǎn)基因動物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白轉(zhuǎn)基因動物反應(yīng)器：乳腺、膀胱、血液生物反應(yīng)器抗凝血酶III：轉(zhuǎn)基因綿羊的乳汁中。β乳球蛋白紅細(xì)胞生成素凝血因子VIII凝血因子IX生長激素3.轉(zhuǎn)基因改良移植器官改造異種來源器官的遺傳性狀，使之適應(yīng)于人體器官或組織的移植。1997年起，利用遺傳改良的轉(zhuǎn)基因豬肝做為嚴(yán)重肝病患者的離體生命支持物。4.動物的克隆1996年，首次實現(xiàn)動物的無性生殖。由綿羊的乳腺細(xì)胞提供細(xì)胞核，卵細(xì)胞提供細(xì)胞質(zhì)發(fā)育而來。核移植技術(shù)（NuclearTransfer)核移植技術(shù)（NuclearTransfer)第二節(jié)基因打靶基因打靶(GeneTargeting)

：通過DNA定點同源重組，改變基因組中的某一特定基因，在生物活體內(nèi)研究此基因的功能?；蚯贸?geneknockout):刪除靶基因的重要功能區(qū)，使靶基因失活。基因敲入(geneknockin):將外源基因整合到特定靶位點，進(jìn)行特異性表達(dá)。一、基因打靶的基本程序打靶載體的構(gòu)建。打靶載體導(dǎo)入ES細(xì)胞及其鑒定?；蚯贸鼸S細(xì)胞注射入胚泡。胚泡植入假孕小鼠的子宮。嵌合體的雜交建立基因打靶的純合鼠系。1.打靶載體的構(gòu)建同源基因片段質(zhì)粒載體HB1HB2neor基因HSV-tk基因2.打靶載體導(dǎo)入ES細(xì)胞磷酸鈣-DNA共沉淀法逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法電穿孔法脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法顯微注射法（1）打靶載體的正-負(fù)選擇與整合位點兩端區(qū)域同源的兩段DNA序列(HB1和HB2)。目的基因。編碼抗G418的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（neor基因）。2個不同的胸苷激酶基因（HSV-tk1和HSV-tk2），分別來自I型II型單純皰疹病毒。打靶載體的正篩選

tk1HB1neorHB2tk2載體載體同源重組neorG418正篩選，細(xì)胞存活染色體染色體打靶載體的負(fù)篩選

tk1HB1neorHB2tk2染色體染色體非特異性整合

GCV負(fù)篩選，細(xì)胞死亡（2）PCR鑒定在打靶載體的HB1和HB2之間，加上一個載體和鼠的基因組中都沒有的獨特DNA序列（US）。如發(fā)生隨機整合，PCR無法擴增出預(yù)期的DNA片段。如果整合于特定位點時，則PCR可以擴增出預(yù)期大小的片段。PCR鑒定：特異整合tk1HB1USneorHB2tk2P2P1PCR反應(yīng)有特異條帶特異整合3.基因敲除小鼠的獲得基因敲除ES細(xì)胞注射入胚泡胚泡植入假孕小鼠的子宮嵌合體的雜交育種：同源重組只發(fā)生在一條染色體上，因而同源重組后只能得到嵌合體，將嵌合體雜交，即可得到純合子。×第三節(jié)

基因沉默在RNA水平上研究基因功能的方法：（一）反義RNA（二）RNA干擾技術(shù)

（二）RNA干擾1990年，Jorgense等通過轉(zhuǎn)基因改造牽牛花顏色。外源基因不但不能加深花的顏色，反而造成內(nèi)源基因表達(dá)的降低。

RNA干擾是dsRNA導(dǎo)致的基因沉默1998年，F(xiàn)ire等在

C.elegans中用antisenseRNA抑制基因表達(dá)。dsRNA比sense或antisenseRNA都好。注射甚至口服

dsRNA都能誘發(fā)基因沉默。很少量的dsRNA就能誘發(fā)C.elegans整體的基因沉默，甚至能傳遞到子一代。RNA干擾：RNAinterference(RNAi)

RNAi是真核生物中廣泛存在的現(xiàn)象植物：干擾因素自葉脈向外擴散，綠色熒光蛋白(GFP)基因被抑制，顯露出紅色。

線蟲：左側(cè)為

GFP轉(zhuǎn)基因線蟲；右側(cè)線蟲則經(jīng)

GFPdsRNA處理。部分細(xì)胞

RNAi相關(guān)蛋白表達(dá)較低，仍有綠色熒光。

Hela細(xì)胞：經(jīng)ORC6siRNA作用后，細(xì)胞出現(xiàn)多核現(xiàn)象。綠色為tubulin，紅色為DNA。ORC6細(xì)胞分裂調(diào)控蛋白。

果蠅：右側(cè)果蠅為野生型，左側(cè)為

shRNA

造成的色素缺乏的缺陷型。1.RNA干擾RNA干擾(RNAi)：由短雙鏈RNA誘導(dǎo)的同源mRNA降解，抑制基因表達(dá)。RNA干擾技術(shù)可以用于基因敲除，選擇性關(guān)閉特定細(xì)胞基因。（1）siRNA的產(chǎn)生Dicer：RNaseIII的一種，可降解dsRNA成siRNA。siRNA(ShortinterferingRNA)：21~23nt（2）siRNA誘導(dǎo)同源序列的降解RNA-InducedSilencingComplex（RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物）產(chǎn)生兩種后果：同源mRNA的降解。同源mRNA翻譯受阻。2.基因沉默的機制是多方面的dsRNA造成的mRNA降解。轉(zhuǎn)錄后基因沉默(Post-translationalgenesilencing)dsRNA造成同源性基因的甲基化和表達(dá)關(guān)閉。dsRNA造成染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變化。dsRNA對蛋白質(zhì)的合成產(chǎn)生影響。RNAi和基因敲除在基因組DNA上，通過同源重組進(jìn)行的基因敲除。在mRNA水平進(jìn)行的基因敲除：反義RNA核酶(Ribozyme)RNAi：dsRNA;siRNA;shRNA基因敲除和RNA干擾基因敲除是在基因水平將某個基因定點去除，動物整體水平。RNA干擾不是敲除基因，而是誘導(dǎo)RNA的特異性降解，干擾基因的表達(dá)。