DB33T 822-2011 高致病性豬藍(lán)耳病RT-PCR檢測技術(shù)　　

DB33RT-PCRdetectiontechniqueforhighlypathogenicporcinereproductiverespiratorysyndromevir浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I《標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)則第4部分：化學(xué)分析方法》本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：浙江省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)1高致病性豬藍(lán)耳病RT-PCR檢測技術(shù)本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了高致病性豬藍(lán)耳病病毒RT-PC本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬只感染高致病性和美洲型經(jīng)典豬藍(lán)耳病病毒高致病性豬藍(lán)耳病highlypat神經(jīng)癥狀。PRRSV是套式病毒目、動(dòng)脈炎病毒科、動(dòng)脈炎DNAdeoxyribonucdNTPsDeoxyribonucleosideIFAimmunofluoresPCRpolymerasecRT-PCRreversetranscriptionPCR，反轉(zhuǎn)Taq酶TaqDNAPolymerase，TaqDNA2EBEthidiumbromide，溴化除另有規(guī)定外，所有實(shí)驗(yàn)用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為蒸餾水，規(guī)格符合GB/T665.1.22mol/L醋酸鈉溶液(pH4.05.1.10EB溶液(10μg/μL)：見附錄A.5。5.2.52℃~8℃冰箱和-20℃冰箱。3采集血清或淋巴結(jié)。0℃以下冷藏并在4h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室檢測，或在-20℃的環(huán)境中保存?zhèn)銻NA的提取方法采用異硫氰酸胍一步法，也可采用TRIZOL法或者市售商品化RNA提取試劑盒。注意事5.3.2.2.1每次試驗(yàn)前應(yīng)設(shè)立陽性、陰性4上游引物PRRST1（20pmoL/μ5.3.3.3.5用紫外凝膠成像儀或紫外透射儀觀察在陽性對(duì)照出現(xiàn)421bp（HP-PRRSV）/511bp（美洲型）的擴(kuò)增帶、陰性對(duì)照無相應(yīng)目標(biāo)條帶，該5將250g異硫氰酸胍、17.6mL0.75mol/L（pH7.0）檸檬酸鈉和26.4mL10%（m/V）十二烷基肌酸鈉溶293mL水中。65℃條件下攪拌、混勻，直至完全溶解。室溫條件下保存，每次使用前按每50mL變性液加入0.36mL的14.4mol/L的β用瓊脂糖1.0g，0.5×TAE電泳緩沖液100mL，混勻后在微波爐中完全融化，待冷至50℃~60℃A.4.2TAE電泳緩沖液(50×雙蒸水至1000mL充分混勻。用時(shí)用滅菌雙蒸水稀釋EB20mg、加滅菌雙蒸水至20mL充分溶解混勻聚蔗糖25g、溴酚藍(lán)0.1g、二甲苯青0.1g，加6A.9.1HP-PRRSV和美洲型PRRSV檢測引物序列如下表A5’-ATGGGCGACAATGTCCCTAAC-3’5’-GAGCTGAGTATTTTGGGCGTG-3’增時(shí)2條引物在同一體系中，擴(kuò)增結(jié)束后出現(xiàn)大小為421bp的目的片段為HP-PRRSV，大小為511bp的目7B.1.1樣品處理過程中應(yīng)穿實(shí)驗(yàn)服，戴一次性手套、口罩、帽子。一次性手套應(yīng)經(jīng)常B.1.2提取RNA過程或PCR反應(yīng)液配制過程應(yīng)分別在專用的超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行；未設(shè)專用超凈工作臺(tái)時(shí)B.2.2抽樣和制樣工具應(yīng)清潔干凈，經(jīng)無菌處理過，PCR試驗(yàn)的器皿、離心管、PCR