我國弓形蟲病核酸疫苗研究概況

1、我國弓形蟲病核酸疫苗研究概況關鍵詞：弓形蟲病StatusintheresearhfnulEiaidvaineagainsttxplasainhina.剛地弓形蟲簡稱弓形蟲呈世界性分布，哺乳動物及鳥類普遍易感。人類對弓形蟲有較強的自然免疫力，感染后絕大多數(shù)無明顯病癥表現(xiàn)，或只出現(xiàn)亞急性弓形蟲玻但在孕婦及免疫功能低下者如ADIS并器官或組織移植后承受免疫抑制劑治療的病人等感染弓形蟲后引起的危害嚴重。人體弓形蟲感染日益受到關注，弓形蟲病疫苗成為當前研究的熱點。動物實驗發(fā)現(xiàn)，弓形蟲全蟲疫苗，弓形蟲特異抗原組分疫苗有預防弓形蟲感染或降低感染度作用，但前者可能會引起再感染，后者的免疫保護效果較差。弓形蟲病

2、核酸疫苗克制了上述疫苗存在的缺乏，具有良好的開發(fā)應用前景。我國從上世紀90年代后期開場了弓形蟲病核酸疫苗的研制，通過對表達保護性抗原蛋白基因進展重組，先后研制出弓形蟲基因單價疫苗、復合疫苗和混合疫苗。動物實驗證明部分疫苗具有良好的免疫預防效果。1保護性抗原及目的基因研究弓形蟲裂殖了外表膜蛋白SAG1，2，致密顆粒蛋白GRA3和棒狀體蛋白RP4是重要的弓形蟲抗原，這些抗原物質(zhì)與弓形蟲的侵襲性有關，且能誘導宿主的免疫反響。1.1SAGSAG是弓形蟲裂殖子外表膜蛋白。通過對SAG的分子構造、生物學和免疫學特性研究發(fā)現(xiàn)，有5種分別命名為P22、P23、P30、P35利P43SAGlP30分子質(zhì)量303

3、5kDa含量約占蟲體總蛋白的3%5%，主要存在于弓形蟲表膜及內(nèi)膜系統(tǒng)，也可分泌到蟲體外環(huán)境。P30是重要的弓形蟲外表SAG2SAG2是一個基因家族，包括SAG2B、SAG2和SAG2D。其中SAG2B表達于速殖子外表，而SAG2和SAG2D僅表達于緩殖子的外表201225及301340號氨基酸具有高親水性，利用蛋白質(zhì)分析軟件分析P35基因編碼的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)其編碼的氨基酸序列含有多個T、B淋巴細胞表位，證明P35蛋白具有抗原性。林敏等11采用RT-PR技術從弓形蟲DNA文庫中擴增出編碼P35抗原的基因片段，構建了弓形蟲RH株外表抗原P35基因重組表達質(zhì)粒P35/pGEX-21，并在大腸桿菌J

4、l09中成功表達了分子質(zhì)量為70kDa交融蛋白，該蛋白能為谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶GST外表腆蛋白不同，P23不是GPI錨定蛋白，P23的N端連接有糖基化位點，是慢性弓形蟲病的一個分子標志。疫苗研究發(fā)現(xiàn)，24kDa的多肽物質(zhì)能誘導產(chǎn)生一定的免疫保護力。用24kDa多肽免疫動物后，在該動物血液中檢測到了抗P23抗體12。閃此認為P23可能包含該多肽的免疫表位，其基因序列可能存在同源性。是有希望的弓形蟲病疫苗候選基岡。1.2GRA弓形蟲致密顆粒稈放多種蛋白GRA，已經(jīng)報道的有8種，其中研究較多的有GRAl、GRA4、GRA6手GRA8。說明反響反響從弓形蟲昆山別離株和RH株總DNA中分別擴增到編碼GRA6

5、的基因，導入表達載體PGEX-5X-3，然后在大腸桿菌BL21-dnPlusDE3說明說明致密顆粒抗原GRAS的原核表達質(zhì)粒在大腸桿菌中表達了GRA8的交融蛋白，分子質(zhì)量為41kDa:用提純的真核重組表達質(zhì)粒免疫小鼠后腿肌肉注射，每周1次，每次50g，連續(xù)2周，4周后檢測證實免疫鼠產(chǎn)生了抗弓形蟲抗原的抗體，ELSA滴度1:100。楊慧齡等21構建的pDNA3.1+-GRA8重組質(zhì)粒經(jīng)PR鑒定利測序分析，與GENEBANK相應基因序列完全一致。1.3RP弓形蟲棒狀體可分泌棒狀體蛋白RP序列，設計合成一對PR引物，從弓形蟲RH株基因組DNA中擴增出RP2基因片段，再克隆到pGEX-4T-1質(zhì)粒并在

6、大腸桿菌BL21DE3中進展ITPG誘導表達。經(jīng)SDS分析，RP2基因PR產(chǎn)物大小與預期相符約1043bp，測序結果與序列根本外表抗原P30DNA疫苗誘導小鼠產(chǎn)生的細胞免疫應答。結果免疫組小鼠D8+細胞數(shù)量升高，D4+/D8+比率下降。說明弓形蟲外表抗原P30DNA疫苗能誘導BALB/小鼠產(chǎn)生細胞免疫應答。龔婭等25利用PR技術和亞克隆技術分別構建了弓形蟲表膜型P30基因重組質(zhì)粒個完好的P30編碼序列，包括信號肽pDNA3-P30In，并將以上3種重組質(zhì)粒分別與脂質(zhì)體混合后免疫小鼠，之后的免疫檢測證明3種表達形式的重組質(zhì)粒均能誘導小鼠產(chǎn)生特異性的IgG抗體，雖然膜型及分泌型免疫鼠特異IgG抗體

7、出現(xiàn)的時間早于細胞內(nèi)型免疫鼠，但4周后的抗體程度3組間差異無顯著性。外表抗原P22、P30的有效基因片段同構建在同一克隆載體pUl9和表達載體pGEEXT-1上，并保證其連接方向及開放讀碼框的正確。古飲民等31用IPTG誘導含有P22、P30復合基因的重組菌表達交融蛋白，并進展了免疫活性檢測。結果在66.5kDa位置的交融蛋白帶可與P30抗體特異結合，說明RP2的基因片段重組入pUl8克隆載體，再將酶切的P30-RP2外源基因片段亞克隆入pDNA3.1真核表達載體，成功獲得pUl8-P30-RP2重組質(zhì)粒。陳海峰等34用構建的SAGl和RPl復合基因真核表達質(zhì)粒接種小鼠，觀察誘導產(chǎn)生的拮抗致死

8、性弓形蟲感染的保護性免疫。抗體及細胞因子檢測結果說明，SAGl和RPl復合基因疫苗誘導小鼠產(chǎn)生了很強的體液免疫和細胞免疫，接種該疫苗對于毒性株弓形蟲感染攻擊具有免疫保護作用。楊亭亭等35用構建的弓形蟲SAGl-RP2復合基因疫苗免疫小鼠后，觀察了血中及T淋巴細胞變化。結果顯示，免疫鼠血中和D8+細胞數(shù)均高于用pDND-SAGl重組質(zhì)粒免疫鼠，免疫鼠感染弓形蟲后的平均生存時間為9.51.25d，而用弓形蟲pDND-SAGl重組質(zhì)粒免疫鼠感染弓形蟲后的平均生存時間為70.89d，差異有顯著性P0.05。認為弓形蟲SAGl-RP2復合基因疫苗的免疫效果較好。2.3混合基因疫苗HbsAg是乙型肝炎疫苗

9、的理想候選分子，能有效保護機體免受乙型肝炎病毒感染。HbsAg同時又是理想的基因工程疫苗的載體，在不同部位插入外源基因，能表達相應的HbsAg交融蛋白。HbsAg的佐劑作用能顯著進步疫苗的免疫效果。王丹靜等36將構建的pDNA3-HBsAg-GRAl質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的S-7細胞，轉(zhuǎn)染后的細胞培養(yǎng)上清經(jīng)SDS，estern-blt鑒定證明，轉(zhuǎn)染的細胞能高效表達分子質(zhì)量為47kDa的分泌性交融蛋白HBsAg-GRAl，該蛋白能同時被HBsAb陽性者血清及弓形蟲免疫兔血清識別。霍亂毒素T是常用的粘膜免疫佐劑，具有較強的粘膜免疫原性和佐劑放應，不僅能增強抗原的免疫原性，同時增強機體的免疫反響。叢華等37用構建的SAGl、SAG2和霍亂毒A2/B亞基基因真核重組質(zhì)粒經(jīng)后腿肌肉免疫BALB/小