免疫學(xué)實驗二-ELISA(雙抗夾心法)1

實驗二、酶聯(lián)免疫吸附試驗實驗內(nèi)容：間接法

－－－測乙型肝炎病毒表面抗體（HBsAb）Enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA1ppt課件完整酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）是將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合的一種敏感性很高的實驗技術(shù)，可用于檢測體液中微量的特異性抗體或抗原。首先，抗原、抗體的特異性反應(yīng)在一種固相載體表面－聚苯乙烯微量反應(yīng)板孔中進(jìn)行，通過洗滌去除多余的游離反應(yīng)物；然后加入酶標(biāo)記的抗體或酶標(biāo)記的抗抗體，從而形成抗體－抗原－酶標(biāo)抗體復(fù)合物（雙抗體夾心法）或抗原－抗體－抗抗體復(fù)合物（間接法）；此時加入酶底物和顯色劑，在酶催化底物后，液體呈現(xiàn)顯色反應(yīng)。液體顯色的強(qiáng)弱與復(fù)合物中待測抗原或抗體的量呈正比，借此可檢測待測抗原或抗體的有無及含量。該技術(shù)的特點是敏感性高，特異性強(qiáng)，操作簡易，結(jié)果容易觀察。實驗原理：2ppt課件完整免疫酶技術(shù)是利用酶標(biāo)記抗體或抗原，以檢測相應(yīng)抗原或抗體的一種免疫學(xué)標(biāo)記技術(shù)。其原理是酶與抗體或抗原結(jié)合后既不改變抗體或抗原的特異性及免疫反應(yīng)性，也不影響酶的催化效能。當(dāng)存在相應(yīng)酶底物時，酶能催化產(chǎn)生有顏色的產(chǎn)物，顏色的有無及深淺能反映相應(yīng)的抗原或抗體是否存在及其量的多少。實驗原理：3ppt課件完整ELISA的測定方法包括：雙抗體夾心法：檢測抗原最常用的方法間接法：檢測抗體最常用的方法競爭法：既可檢測抗原，亦可檢測抗體生物素－親和素系統(tǒng)ELISA法：是在ELISA中引入生物素或親和素放大系統(tǒng)，檢測極微量的抗原或抗體的方法。4ppt課件完整直接法間接法5ppt課件完整6ppt課件完整BAS-ELISA底物1.已知Ab包被固相2.加待檢標(biāo)本3.加生物素標(biāo)記的特異性抗體4.加酶標(biāo)記的親和素5.加底物顯色親和素酶生物素待檢標(biāo)本biotin-avidin-system，生物素-親和素系統(tǒng)此法敏感性更高。用于抗原抗體以及DNA、RNA的檢測。7ppt課件完整材料和試劑：1.HBsAg、包被液。2.待檢人血清。3.酶標(biāo)記的抗HBsAb抗體。4.HBsAb陽性對照血清、HBsAb陰性對照血清5.洗滌液：PH7.4

0.01mol/LPBS-吐溫20。6.底物溶液：OPD-H2O2或TMD-H2O2。7.終止液：2mol/LH2SO4。8.酶標(biāo)反應(yīng)板、移液器、恒溫箱、酶標(biāo)儀

酶標(biāo)板移液器酶標(biāo)儀8ppt課件完整操作步驟：包被：將HBsAg用包被液作適當(dāng)稀釋（1：100），在96孔反應(yīng)板中每孔加100μl，置37℃2h后再移置4℃過夜。洗滌：將96孔反應(yīng)板傾去包被液，用洗滌液PBS-吐溫20加滿各孔，置3min,傾去，如此反復(fù)3次。（前兩步已完成）

9ppt課件完整1.已知抗原包被酶標(biāo)板2.1棄去板內(nèi)包被抗原2.2拍干2.3加滿洗滌液（重復(fù)三次）10ppt課件完整3.加樣（1）陽性對照：第1、2孔加HBsAb陽性對照血清50μl；（2）陰性對照：第3、4孔加HBsAb陰性對照血清50μl；（3）空白對照：第5孔加生理鹽水100μl；（4）余下各孔加待檢血清50μl。11ppt課件完整加酶標(biāo)記的抗HBsAb抗體：除空白對照外各孔50μl，充分混勻。將即時帖覆蓋于反應(yīng)板上，37℃孵育30min。棄去反應(yīng)孔內(nèi)液體，拍干，用洗滌液注滿各孔、靜置30秒、再拍干，重復(fù)洗滌5次。(操作同2)顯色：各孔（包括空白對照）加底物A液50μl（1滴），底物B液50μl（1滴），置37℃避光溫育15min。終止反應(yīng)：各孔加終止液50μl（2mol/LH2SO4）。比色：將反應(yīng)板以酶標(biāo)儀450nm處用空白孔調(diào)零，測各孔OD值。

12ppt課件完整6.顯色各孔（包括空白對照）加底物A液50μl（1滴），底物B液50μl（1滴），置37℃避光溫育15min7.終止反應(yīng)各孔加終止液50μl（2mol/LH2SO4）13ppt課件完整OPD（鄰苯二胺）經(jīng)酶作用后的顯色反應(yīng)終止前終止后TMB四甲基聯(lián)苯胺經(jīng)酶作用后的顯色反應(yīng)終止前終止后14ppt課件完整結(jié)果判斷：計算：判斷值＝陰性對照平均OD值×2.1結(jié)果判斷：待測樣品孔OD值大于或等于判斷值為陽性；

小于判斷值為陰性。注：陰性對照OD值小于0.05按0.05計算，大于0.05按實際OD值計算判斷值。

15ppt課件完整注意事項：試劑及待測標(biāo)本使用前應(yīng)平衡至室溫，并將試劑混勻，棄去1～2滴垂直滴加；嚴(yán)格按照操作程序依次加樣，以保證實驗結(jié)果準(zhǔn)確性；應(yīng)盡量避免孔中有氣泡，以免所測得OD值不準(zhǔn)確。

16ppt課件完整思考題：1.免疫標(biāo)記技術(shù)有哪些？各有何特點？。2.ELISA操作過程中應(yīng)注意哪些問題？17ppt課件完整THANKS18ppt課件完整2009級醫(yī)療?？茝?fù)習(xí)題一、名詞解釋2.5*8,共20分

免疫、抗原、抗原決定基(表位)、異嗜性抗原、白細(xì)胞分化抗原、TD-Ag、TI-Ag、抗體、免疫球蛋白、單（多）克隆抗體、補(bǔ)體、經(jīng)典途徑、旁路途徑、細(xì)胞因子、IL、IFN、CSF、TNF、MHC、MHC限制性、TCR、BCR、模式識別受體（PRR）、抗原提呈細(xì)胞（

APC）、適應(yīng)性免疫應(yīng)答、免疫耐受、免疫調(diào)節(jié)、超敏反應(yīng)、人工主動免疫、人工被動免疫、計劃免疫注：紅色標(biāo)記為要求掌握英文19ppt課件完整二、填空題（0.5×40=20分）三、單項選擇題（1×30=30分）20ppt課件完整免疫的三大功能及其生理和病理表現(xiàn)。影響抗原免疫原性的因素。醫(yī)學(xué)上有哪些重要的抗原。簡述Ig的基本結(jié)構(gòu)。免疫球蛋白有哪些主要的生物學(xué)功能？簡述補(bǔ)體的組成。補(bǔ)體活化三條途徑的比較。補(bǔ)體有哪些主要生物學(xué)功能？細(xì)胞因子有哪些共同的特性？細(xì)胞因子的主要生物學(xué)作用。簡答5×2=1021ppt課件完整簡述MHC分子的結(jié)構(gòu)及其分布。HLA的主要生物學(xué)功能。T細(xì)胞表面有哪些與其功能相關(guān)的重要分子。B細(xì)胞表面有哪些與其功能相關(guān)的重要分子。巨噬細(xì)胞的主要生物學(xué)功能。簡述免疫應(yīng)答的基本過程?？乖奶岢释緩剑▋蓷l）。固有免疫的組成及其與適應(yīng)性免疫的關(guān)系。兩種人工免疫的主要區(qū)別。預(yù)防接種的注意事項。滅活疫苗與減毒活疫苗的主要區(qū)別。22ppt課件完整論述題（10×2=20）免疫應(yīng)答：如TD抗原誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答的過程；