醫(yī)院醫(yī)技科室診療規(guī)范

醫(yī)院醫(yī)技科室診療規(guī)范第2章病理學(xué)基本技術(shù)規(guī)范第一節(jié)病理組織學(xué)診斷檢材的制備技術(shù)一、組織的固定㈠凡需要進行病理組織學(xué)檢查的標(biāo)本(器官或組織)，于離體(活體或尸體)后，應(yīng)盡快置放(浸泡)于裝有足夠量固定液的容器中固定。固定液量應(yīng)為被固定標(biāo)本體積的5~10倍。置放標(biāo)本的容器大小視標(biāo)本和固定液的體積而定，應(yīng)適當(dāng)大一些。臨床科室切取的標(biāo)本置放于容器中固定后，應(yīng)盡快送交病理科繼續(xù)固定。未能及時、充分固定的干涸或腐敗標(biāo)本不能再進行固定和用于制做切片。㈡常規(guī)固定液為4%中性甲醛(10%中性福爾馬林)，應(yīng)預(yù)先多量配制貯存，以備隨時使用。小標(biāo)本的固定時間為4~6小時，大標(biāo)本為18~24小時或更久。㈢根據(jù)病理學(xué)特殊檢查(特殊染色和組織化學(xué)染色、免疫組織化學(xué)染色和原位核酸分子雜交染色、電鏡觀察等)的需要，應(yīng)選用其他適宜的固定液進行固定[參見后述的“㈦固定液的常用種類和制備”]。㈣器官、組織固定的基本方法[另參見本章第四節(jié)(病理標(biāo)本的肉眼檢查和組織學(xué)切片取材技術(shù))]1.食管、胃、腸、膽囊、膀胱等空腔器官：依規(guī)范方法剪開后，按其自然狀態(tài)平鋪于硬紙板上(重點暴露黏膜面或內(nèi)表面的病變處)，并用大頭針將標(biāo)本邊緣處固定于紙板上，然后放入4%中性甲醛中固定(黏膜面或內(nèi)表面朝向容器的液面，并覆蓋薄層脫脂棉)。2.肝、脾：由器官背面，沿其長軸每間隔1.5~2.0cm縱向平行剖開，切成數(shù)片。將每片肝或脾輕輕地平放于裝有4%中性甲醛的容器中，容器底面襯以脫脂棉。應(yīng)避免標(biāo)本彎曲和相互間的疊壓。3.肺葉：放入固定液中的肺葉漂浮于液面，需在肺表面覆蓋薄層脫脂棉。必要時從支氣管注入適量4%中性甲醛。4.腎：沿腎外緣中線朝腎門方向作一水平切面(深達于腎盞)，再行固定。5.淋巴結(jié)：先用4%中性甲醛固定1小時后，再沿其長軸切成數(shù)片(厚2~3mm)，繼續(xù)固定。6.骨組織：先鋸成小片(若是長骨應(yīng)作橫向鋸片)，在4%中性甲醛中固定24小時后，再進行脫鈣。7.微小組織或液體沉淀物：先用拭紙或濾紙妥為包裹(需用大頭針扎牢)，然后放入專用小盒內(nèi)進行中性4%甲醛固定，以防檢材遺失。8.凡進入固定程序的標(biāo)本必須連帶其正確無誤的病理檢驗號(病理號)。㈤多數(shù)固定液對人體有害，需要防護，必須在封閉的通風(fēng)條件下進行操作。㈥組織塊的切取和固定：①由較大標(biāo)本切取用于制作切片的組織塊(取材)時，應(yīng)與標(biāo)本的斷面平行，組織塊厚度一般為0.3cm(不應(yīng)>0.5cm)，面積一般在1~1.5×1~1.5以內(nèi)。②切取組織塊的形狀，在充分包括肉眼病變的前提下盡量規(guī)則些(例如方形、矩形、三角形等);由一個標(biāo)本切取的多塊組織的形狀有所不同，便于蠟塊與其相應(yīng)切片的核對。③固定組織塊的固定液量，一般應(yīng)為組織塊總體積的5~10倍以上。④室內(nèi)常溫(25℃左右)下的固定時間為3~24小時;低溫(4℃)下的固定時間應(yīng)延長。⑤固定組織塊的容器要大一些。⑥組織塊固定期間需要間斷地輕搖或攪動固定液以利于固定液的滲入。㈦常用固定液1.4%中性甲醛(10%中性福爾馬林)固定液甲醛(40%)100ml無水磷酸氫二鈉6.5g磷酸二氫鈉4.0g蒸餾水900ml2.乙醇-甲醛(酒精-福爾馬林，AF)固定液甲醛(40%)100ml95%乙醇900ml[說明]一般組織塊經(jīng)乙醇-甲醛固定1～2小時后，即可移入95%乙醇內(nèi)脫水。3.Carnoy固定液無水乙醇60ml氯仿30ml冰醋酸10ml[說明]組織化學(xué)染色的常用固定液，組織經(jīng)Carnoy液固定1～2小時后，即可移入無水乙醇中脫水。4.Zenker固定液升汞5.0g重鉻酸鉀2.5g硫酸鈉1.0g蒸餾水(加至)100ml[說明]配制本液時，先將升汞溶于蒸餾水中、加溫至40～50℃溶解后，再加入重鉻酸鉀，最后加入硫酸鈉，貯存待用。使用前加入5ml冰醋酸，混合。組織塊需固定12~24小時。切片染色前，需進行脫汞沉淀處理。5.Bouin固定液飽和苦味酸水溶液(約1.22%)75ml甲醛(40%)25ml冰醋酸5ml[說明]本液臨用時配制。組織塊置于Bouin液固定12～24小時即可(小塊組織只需固定數(shù)小時)。經(jīng)Bouin液固定的組織被苦味酸染成黃色，可用水洗滌12小時后進入乙醇脫水(兼脫色)。不必將組織中的黃色除凈(殘存于組織中的苦味酸無礙染色)6.過碘酸-賴氨酸-多聚甲醛固定液(PLP)A液：賴氨酸1.827g蒸餾水50ml0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)50mlB液：8%多聚甲醛水溶液100ml[說明]本液臨用時配制：取A液3份、B液1份，混合后，加入過碘酸鈉，使液體終濃度為2%。組織塊在4℃下固定36~54小時。本液對細胞結(jié)構(gòu)和抗原性保存較好。7.B5(醋酸鈉-升汞-甲醛)固定液無水醋酸鈉1.25g升汞6.0g蒸餾水90ml[說明]將以上物質(zhì)混合、溶解，使用前加入甲醛10ml。本液多用于固定淋巴組織。染色前應(yīng)進行脫汞沉淀處理。如不加甲醛稱為B4固定液(蒸餾水為100ml)。8.丙酮固定液冷丙酮(4℃)固定液用于酶組織化學(xué)染色。細胞標(biāo)本的免疫組化染色也常用冷丙酮固定10分鐘。二、常規(guī)石蠟包埋組織切片(常規(guī)切片)的制備㈠組織塊依序進行：①水洗，②脫水，③透明，④浸蠟，⑤包埋和⑥切片。㈡組織切片制備及其HE染色過程中使用的乙醇、丙酮、二甲苯、石蠟等為易燃、有毒物，必須專人管理，2m以內(nèi)不得有明火，局部環(huán)境應(yīng)有良好的通風(fēng)和消防設(shè)施。㈢常規(guī)切片的手工操作(步驟次序和各步驟的持續(xù)時間)1.水洗：用流水沖洗已經(jīng)固定的組織塊30min。2.脫水(常溫下)(1)乙醇-甲醛(AF)液固定60~120min(2)80%乙醇60~120min(3)95%乙醇Ⅰ60~120min(4)95%乙醇Ⅱ60~120min(5)無水乙醇Ⅰ60~120min(6)無水乙醇Ⅱ60~120min(7)無水乙醇Ⅲ60min[注意事項]①未經(jīng)充分固定的組織不得進入脫水程序。②用于脫水的試劑容積應(yīng)為組織塊總體積的5～10倍以上。③自低濃度乙醇向高濃度乙醇逐級移進脫水。④脫水試劑應(yīng)及時過濾、更換(500ml乙醇可用于500個組織塊脫水;加入硫酸銅的無水乙醇變藍時，提示需要更換)。⑤較大組織塊的脫水時間長于較小者，應(yīng)將兩者分開進行脫水。⑥組織置于無水乙醇內(nèi)的時間不宜過長(以免硬化)。⑦丙酮脫水性能強，會使組織塊過縮、硬脆，不宜用以替代無水乙醇。3.透明(1)二甲苯Ⅰ20min(2)二甲苯Ⅱ20min(3)二甲苯Ⅲ20min[注意事項]①二甲苯的容積應(yīng)為組織塊總體積的5～10倍以上。②組織塊在二甲苯中透明的時間不宜過長(以防組織硬、脆)，并依不同種類組織及其大小而異;組織呈現(xiàn)棕黃或暗紅色透明即可。③二甲苯應(yīng)及時過濾、更換。④組織經(jīng)二甲苯適度處理后不顯透明時，常提示該組織的固定或脫水不充分，應(yīng)查找原因并妥善處理。4.浸蠟(1)石蠟Ⅰ(45~50℃)60min(2)石蠟Ⅱ(56~58℃)60min(3)石蠟Ⅲ(56~58℃)60min[注意事項]①熔化石蠟必須有專人負責(zé)，必須在熔蠟箱內(nèi)或水浴中(70℃)進行，不得用明火加溫。②熔蠟的容積應(yīng)為組織塊總體積的5～10倍以上。③組織塊經(jīng)二甲苯適度透明后方可轉(zhuǎn)入浸蠟過程，應(yīng)盡可能減少將透明后組織塊表面的二甲苯帶入熔蠟中。④浸蠟時間適宜，過短時浸蠟不充分(組織過軟)，過長時組織硬脆。⑤熔蠟應(yīng)及時過濾、更換。5.包埋(1)先將熔化的石蠟傾入包埋模具中，再用加熱的彎曲鈍頭鑷子輕輕夾取已經(jīng)過浸蠟的組織塊，使組織塊的最大面或被特別指定處的組織面向下埋入熔蠟中;應(yīng)將組織塊平正地置放于包埋模具底面的中央處;包埋于同一蠟塊內(nèi)的多塊細小組織應(yīng)彼此靠近并位于同一平面上;腔壁、皮膚和黏膜組織必須垂直包埋(立埋)。(2)將與組織塊相關(guān)的病理號小條置入包埋模具內(nèi)熔蠟的一側(cè)。(3)待包埋模具內(nèi)的熔蠟表面凝固后，即將模具移入冷水中加速凝固。(4)從包埋模具中取出凝固的包埋蠟塊(簡稱蠟快)，用刀片去除組織塊周圍的過多石蠟(組織塊周圍保留1~2mm石蠟為宜)。將包埋蠟塊修整成為規(guī)則的正方形或長方形。(5)將病理號小條牢固地烙貼在蠟塊一側(cè)(編號應(yīng)清晰可見)。(6)把修整好的蠟塊烙貼在支持器上，以備切片。(7)使用包埋機的方法按有關(guān)廠商的說明書操作。(8)注意事項①應(yīng)將組織塊嚴格分件包埋。包埋時一定要首先認真核對組織塊的病理號(包括亞號)、塊數(shù)和取材醫(yī)師對包埋面的要求，準(zhǔn)確地包入相應(yīng)的病理號小條。發(fā)生包埋差錯時，必須立即與取材醫(yī)師和病理科當(dāng)班負責(zé)人取得聯(lián)系，及時處置。②必須嚴防各種異物污染，勿將無關(guān)組織(包括縫線、紙屑或其他異物(尤其是硬質(zhì)異物)埋入蠟塊內(nèi)。③包埋過程要操作迅速，以免組織塊尚未埋妥前熔蠟?zāi)獭＂馨裼玫娜巯瀾?yīng)純凈，熔點適宜。浸蠟Ⅰ用軟蠟(熔點為45~50℃)，浸蠟Ⅱ、Ⅲ和包埋用蠟均用硬蠟(熔點為56~58℃)。⑤包埋用熔蠟使用前應(yīng)將先靜置沉淀、過濾。⑥熔蠟時不得使用明火，以防燃燒。包埋用熔蠟的溫度應(yīng)<65℃;包埋用的鑷子不可加溫過高，以免燙傷組織。6.切片(1)切片刀或一次性切片刀片必須鋒利。使用切片刀時，必須精心磨備(在低倍顯微鏡下確認刀刃無缺口);使用一次性切片刀片時，應(yīng)及時更新。(2)載玻片必須潔凈、光亮。(3)將切片刀或刀片安裝在持刀座上(以15°為宜)。(4)將蠟塊固定于持支持器上，并調(diào)整蠟塊和刀刃至適當(dāng)位置(刀刃與蠟塊表面呈5°夾角)。(5)細心移動刀座或蠟塊支持器，使蠟塊與刀刃接觸，旋緊刀座和蠟塊支持器。(6)修塊(粗切)：用右手勻速旋轉(zhuǎn)切片機輪，修切蠟塊表面至包埋其中的組織塊完整地全部切到。修塊粗切片的厚度為15～20μm。[注意：對于醫(yī)囑再次深切片(特別是在原切片中發(fā)現(xiàn)了有意義病變而進行的深切片)，應(yīng)盡量少修塊，以盡量好地獲得有關(guān)病變的連續(xù)性。](7)調(diào)節(jié)切片厚度調(diào)節(jié)器(一般為4~6μm)，進行切片，切出的蠟片應(yīng)連續(xù)成帶，完整無缺，厚度適宜(3～5μm)、均勻，無刀痕、顫痕、皺折、開裂、缺損、松解等。(8)以專用小鑷子輕輕夾取完整、無刀痕、厚薄均勻的蠟片，放入伸展器的溫水中(45℃左右)，使切片全面展開。[注意：必須水溫適宜、潔凈(尤其是水面);每切完一個蠟塊后，必須認真清理水面，不得遺留其它病例的組織碎片，以免污染。](9)將蠟片附貼于涂有蛋白甘油或經(jīng)3-氨丙基-三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane，APES)處理過的載玻片上(HE染色時酌情使用，可省略，必要時)。蠟片應(yīng)置放在載玻片右(或左)2/3處的中央，留出載玻片左(或右)1/3的位置用于貼附標(biāo)簽。蠟片與載玻片之間無氣泡。(10)必須立即在置放了蠟片的載玻片一端(待貼標(biāo)簽的一端)，用優(yōu)質(zhì)記號筆或刻號筆準(zhǔn)確、清楚標(biāo)記其相應(yīng)的病理號(包括亞號)。[注意：必須確保載玻片上的病理號與相關(guān)組織石蠟包埋塊的病理號完全一致，不得錯寫或漏寫病理號。](11)將置放了蠟片的載玻片呈45℃角斜置片刻;待載玻片上的水分流下后，將其置于烤箱中烘烤(60～62℃，30～60min)，然后即可進行染色。(12)注意事項①組織塊固定、脫水、透明和浸蠟的質(zhì)量直接影響切片制備。切片過程中遇到的困難首先應(yīng)注意從切片前的上述各環(huán)節(jié)中尋找原因。②切片機的質(zhì)量是制備優(yōu)質(zhì)切片的重要前提。要使用質(zhì)量好的切片機，規(guī)范地切片，精心維護切片機。③經(jīng)由內(nèi)窺鏡、穿刺等獲取的細小組織，應(yīng)間斷性連續(xù)切片多面(一般至少制備6張蠟片，必要時制備更多張)。需作特殊染色、免疫組化染色等的病例，可預(yù)制蠟片備用。④切片人員應(yīng)細心操作，防范被切片刀具割傷。㈣常規(guī)切片的自動組織處理機操作(步驟次序和各步驟的持續(xù)時間，總計需要14小時)1.乙醇-甲醛(AF)固定液2×60min2.95%乙醇Ⅰ2×60min3.95%乙醇Ⅱ2×60min4.無水乙醇Ⅰ60min5.無水乙醇Ⅱ60min6.二甲苯Ⅰ30min7.二甲苯Ⅱ30min8.石蠟Ⅰ30min9.石蠟Ⅱ60min10.石蠟Ⅲ90min11.包埋(1)手工常規(guī)包埋：參見上述的“㈠手工操作”項。(2)用組織包埋機時，按有關(guān)廠商說明書的規(guī)定操作。12.切片：參見上述的“㈠手工操作”項。14.注意事項(1)必須按有關(guān)說明書的規(guī)定，使用和維護自動組織處理機、包埋機、磨刀機、封蓋玻片機等儀器等。(2)要嚴防因停電、機械故障等造成的組織塊損壞。一旦發(fā)生此類事故，必須及時向科主任報告，盡快采取應(yīng)急措施妥善處置。(3)使用自動組織處理機時：①合理設(shè)定的運行時間(充分利用夜間)。②固定、脫水的環(huán)境溫度不得>30℃。③乙醇、二甲苯和熔蠟的容積，要大于組織塊總體積的5～10倍以上，并應(yīng)經(jīng)常過濾，保持清潔;應(yīng)經(jīng)常檢查試劑的濃度，及時更新。④對于多量組織塊，可按其大小分批進行處理;小塊組織可適當(dāng)縮短處理時間。三、快速石蠟包埋組織切片的制備㈠煮沸固定切片法1.固定：切取大小適宜(厚度<2mm)的組織塊，盡快置入裝有5~8ml10%中性4%甲醛的試管中煮沸1min，然后已入冷水中。2.脫水(1)將已經(jīng)煮沸固定的組織塊取出，用刀片將其厚度修切至<1.5mm，隨即置入盛有5~8ml丙酮的試管中，煮沸2min，然后將丙酮傾棄。(2)再向該試管中重新加入5~8ml丙酮并煮沸2min。如此重復(fù)3~4次。3.浸蠟：將已經(jīng)丙酮脫水的組織塊由試管中取出，用吸水紙去除其表面液體，隨即置入75~80℃熔化的石蠟中，待組織塊下沉、不再出現(xiàn)氣泡時(約需30s)，即可包埋。4.包埋、切片和染色。(1)用熱鑷子將預(yù)制的蠟塊表面熔化，埋入已經(jīng)浸蠟的組織塊。(2)待埋入組織塊的蠟塊表面凝固后，即用載玻片輕壓蠟塊表面片刻，使蠟塊表面平整。(3)將蠟塊置入冰水中，使其變硬。(4)迅速切片，裱片后用吸水紙去除載玻片上的水分。(5)將載玻片用火焰烘干(勿距火焰太近)。(6)迅速進行HE染色。5.注意事項(1)為了盡量縮短制片時間，必須預(yù)先作好有關(guān)準(zhǔn)備工作，備齊取材用具、試管、固定液、丙酮、酒精燈、火柴(或其他引火器)、包埋用蠟塊、載玻片和染色試劑等，放在固定部位待用。(2)全部制片過程一般在20~25min內(nèi)完成。(3)制片后剩余組織塊應(yīng)作常規(guī)石蠟包埋切片染色，進一步診斷。(4)含脂肪較多的組織，須經(jīng)多次丙酮處理。(5)用于組織固定、脫水、透明的試劑和浸蠟用的石蠟應(yīng)及時過濾、更換。(6)丙酮、乙醇、二甲苯等為易燃物，進行上述各項流程時，2m距離內(nèi)不得存在明火。加溫脫水和浸蠟過程必須應(yīng)用隔水溫箱，不得使用干烤箱操作。㈡超聲波快速處理儀石蠟切片法(參照有關(guān)廠商的說明書操作)。四、冷凍組織切片的制備㈠應(yīng)用恒冷箱切片機制備切片：是目前最適用方法。恒冷箱切片機種類較多，應(yīng)嚴格按有關(guān)廠商的說明書操作。用于切片的標(biāo)本必須未曾固定。㈡應(yīng)用開放式冷凍切片機制備切片1.二氧化碳制冷切片(1)將組織塊放在冷凍臺上，滴加OCT或羥甲基纖維素液于組織塊周圍(將組織塊包埋)，使固定在切片機上的切片刀接近組織塊表面。(2)間斷開放液態(tài)二氧化碳桶的開關(guān)，噴凍組織塊和切片刀，使組織塊凍結(jié)和切片刀制冷。(3)迅速移動切片刀進行切片：先將組織塊修平，然后調(diào)節(jié)厚度至8~12μm處進行切片。(4)用毛筆將切片展開，貼附于載玻片上，稍干后，置于冷凍切片固定液中固定1min，隨即進行HE染色。也可用毛筆將切片托入水中，再用玻璃彎針將切片移至染色皿中進行染色。(5)組織塊也可先在4%中性甲醛中煮沸固定1min，水洗后再行冷凍切片。2.半導(dǎo)體致冷切片(1)切片刀與持刀器之間要間隔一層云母片或硬紙片。將冷刀致冷器粘在刀面上。(2)將組織冷凍臺安裝在半導(dǎo)體切片機上。(3)將冷凍臺和切片刀致冷器上的導(dǎo)線連接在控制臺直流電源上(注意：正負電極不可接反)。(4)連接致冷器的冷卻水管并開始放水，然后開啟電源;冷卻水管中的水流量不宜過大，在使用過程不得斷水。(5)調(diào)整冷凍溫度調(diào)節(jié)器，至切片刀和冷凍臺呈現(xiàn)霜凍。(6)將新鮮組織塊或已固定的組織放在冷凍臺中央，滴加水或OCT，或用水調(diào)成糊狀的甲基纖維素于組織塊周圍(將組織塊包埋)。(7)待組織塊冷凍適當(dāng)后，進行切片。(8)對于未經(jīng)固定的新鮮組織，用毛筆將制作滿意的切片展平，立即裱貼于蓋玻片或載玻片上，待冷凍的切片剛要融化時，立即將其置于冷凍切片固定液中固定1min。對于已經(jīng)固定的組織塊，可用毛筆將制作滿意的切片托入水中，再用玻璃彎針將切片移至染色皿中進行染色。(9)切片完畢后，先關(guān)閉電源，再關(guān)閉冷卻水，待冰霜融化后擦干機器，加罩。3.甲醇致冷切片(按有關(guān)廠商的儀器說明書操作)。4.氯乙烷致冷切片(1)將新鮮的或已經(jīng)固定的組織塊置于支持器中央，加少許水或OCT。(2)連續(xù)噴射氯乙烷于組織塊上，待組織塊凍結(jié)后，改為間歇噴射，使凍結(jié)適度，立即切片。使用氯乙烷時應(yīng)注意防火、防爆。(3)進行組織切片的裱貼、固定和染色(與上述方法相同)。㈢注意事項1.制作冷凍切片所需的試劑和設(shè)備等應(yīng)處于隨時可供使用狀態(tài)。2.切取的組織塊大小適宜(厚度<2mm)，并盡快置于冷凍組織切片機上制備切片。3.調(diào)節(jié)冷凍程度，試切合適時便迅速切片。冷凍不足無法切片，冷凍過度切片易碎。4.冷凍切片固定液(1)乙醚-乙醇液無水乙醚1份95%乙醇1份(2)乙醇-冰醋酸液95%乙醇100ml冰醋酸3～5滴五、脫鈣方法骨和其他鈣化組織，通常需要脫去鈣鹽后進行切片。骨組織脫鈣前需先行固定。㈠常規(guī)脫鈣法：1.將骨組織鋸成薄片(約1×1×0.3cm)。2.在AF中或4%中性甲醛中固定6～12h。3.將骨片置于5%硝酸(急需時可置于37℃溫箱)中脫鈣，至用針輕刺可入時為止，約需12~24h(小塊骨組織脫鈣僅需2~3h)，其間可更新脫鈣液2～3次。4.流水沖洗1~2h。5.移入5%甲明礬液，2~4h。6.流水沖洗2~3h。7.按常規(guī)脫水。8.石蠟包埋。㈡電解脫鈣法：將骨片置于裝有8%硝酸和10%甲酸混合液的電泳槽(有蓋的方形玻璃標(biāo)本缸或燒杯)內(nèi)的陽極處，6V直流電源下持續(xù)電解30min~3h，至用針輕刺可入時為止。㈢骨髓組織脫鈣：可浸泡于苦味酸乙醇飽和液(占85%)、甲醛(占10%)和冰醋酸(占5%)的混合液中(同時進行固定和脫鈣)。㈣注意事項1.骨片等脫鈣組織的厚度適宜。2.脫鈣組織與脫鈣液的體積比>1:30。3.脫鈣過程中應(yīng)不時搖動，多次更換脫鈣液。4.脫鈣時間不可過長。5.微波處理可加速脫鈣過程。6.脫鈣后的組織必須用流水充分沖洗。7.用于包埋的石蠟硬度適中(不要過軟或過硬)。六、蘇木素-伊紅(HE)染色HE染色是應(yīng)用最廣泛的組織病理學(xué)常規(guī)染色技術(shù)。㈠染色程序1.石蠟切片HE染色(常規(guī)HE染色)(1)二甲苯Ⅰ5～10min(2)二甲苯Ⅱ5～10min(3)無水乙醇Ⅰ1～3min(4)無水乙醇Ⅱ1～3min(5)95%乙醇Ⅰ1～3min(6)95%乙醇Ⅱ1～3min(7)80%乙醇1min(8)蒸餾水1min(9)蘇木素液染色5～10min(10)流水洗去蘇木素液1min(11)1%鹽酸-乙醇1～3s(12)稍水洗1～2s(13)返藍(用溫水或1%氨水等)5～10s(14)流水沖洗1～2min(15)蒸餾水洗1～2min(16)0.5%伊紅液染色1～3min(17)蒸餾水稍洗1～2s(18)80%乙醇1～2s(19)95%乙醇Ⅰ2～3min(20)95%乙醇Ⅱ2～3min(21)無水乙醇Ⅰ3～5min(22)無水乙醇Ⅱ3～5min(23)石炭酸-二甲苯3～5min(24)二甲苯Ⅰ3～5min(25)二甲苯Ⅱ3～5min(26)二甲苯Ⅲ3～5min(27)中性樹膠封固注：①(12)和(13)項可省去，但(14)的沖水時間需延長至10～15min(細胞核顯示更清晰)。②(23)項可用無水乙醇代替;北方地區(qū)可省略。2.冰凍切片HE染色(1)冰凍切片固定10～30s(2)稍水洗1～2s(3)蘇木素液染色(60℃)30～60s(4)流水洗去蘇木素液5～10s(5)1%鹽酸-乙醇1～3s(6)稍水洗1～2min(7)返藍(用溫水或1%氨水等)5～10s(8)流水沖洗15～30s(9)0.5%伊紅液染色1～2min(10)蒸餾水稍洗1～2min(11)80%乙醇1～2min(12)95%乙醇1～2min(13)無水乙醇Ⅰ1～2min(14)無水乙醇Ⅱ1～2min(15)石炭酸-二甲苯2～3min(16)二甲苯Ⅰ2～3min(17)二甲苯Ⅱ2～3min(18)中性樹膠封固注：①(7)和(8)項可省去，但(9)的沖水時間需延長至10～15min(細胞核顯示更清晰)。②(15)項可用無水乙醇代替;北方地區(qū)可省略。㈡染色結(jié)果：細胞核呈藍色，細胞漿、肌纖維、膠原纖維和紅細胞呈不同程度的紅色。鈣鹽和細菌可呈藍色或紫藍色。㈢染色注意事項1.切片染色前，應(yīng)徹底脫蠟。2.用含有升汞液體固定的組織，其切片染色前應(yīng)先脫去汞鹽：(1)石蠟切片脫蠟至水洗(2)Lugol液20min(3)流水沖洗5min(4)95%乙醇10min(5)水洗1min(6)5%次亞硫酸鈉水溶液5min(7)流水沖洗5min(8)顯微鏡觀察除汞滿意后，轉(zhuǎn)入HE染色3.脫除福爾馬林色素(必要時)：(1)石蠟切片脫蠟至水洗(2)1%NaOH(1ml)與80%乙醇(99ml)混合液10min(3)流水沖洗5min(4)轉(zhuǎn)入HE染色4.嚴格執(zhí)行HE染色流程，用顯微鏡控制細胞核的蘇木素染色質(zhì)量。HE染片應(yīng)著色鮮艷，紅、藍分明，對比清晰。5.載玻片自二甲苯中取出后，應(yīng)立即用潔凈、光亮的蓋玻片和稠度適宜的中性樹膠濕封載玻片。封蓋處內(nèi)無氣泡，外無溢膠。封片時必須進行操作人員和局部環(huán)境的二甲苯污染防護。不應(yīng)將組織切片烤干或風(fēng)干后再行封片。6.必須在載玻片的一端牢貼標(biāo)簽。標(biāo)簽上應(yīng)印有病理科所在的醫(yī)院名稱。標(biāo)簽上應(yīng)清楚顯示有關(guān)的病理號及其亞號;標(biāo)簽上的病理號應(yīng)準(zhǔn)確無誤，無涂改。7.制片完成后，技術(shù)人員應(yīng)對切片與其相應(yīng)的病理學(xué)檢查記錄單或取材工作記錄單認真進行核對;確認無誤后，將制備好的切片連同相關(guān)的活檢申請單/活檢記錄單以及取材工作單等一并移交給有關(guān)的病理醫(yī)師;交接雙方經(jīng)核對無誤后，辦理移交簽字手續(xù)。8.石蠟切片-HE染色的優(yōu)良率(甲、乙級切片所占的比率)應(yīng)≥85%。石蠟切片-HE染色質(zhì)量的基本標(biāo)準(zhǔn)列于附表。9.制片工作一般應(yīng)在取材后2個工作日內(nèi)完成(不含進行脫鈣、脫脂等需要特殊處理的標(biāo)本)。10.制片過程出現(xiàn)意外情況時，技術(shù)室人員應(yīng)及時向病理醫(yī)師和科主任報告，設(shè)法予以補救。附表常規(guī)石蠟包埋-HE染色切片質(zhì)量的基本標(biāo)準(zhǔn)優(yōu)質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)滿分質(zhì)量缺陷減分⒈組織切面完整，10①組織稍不完整：減1～3分②不完整：減4～10分內(nèi)鏡咬檢、穿刺標(biāo)本切面數(shù)10③未達到規(guī)定面數(shù)：減5分⒉切片薄(3～5μm)，厚薄均勻10①切片厚(細胞重疊)，影響診斷：減6～10分;②厚薄不均勻：減3～5分⒊切片無刀痕、裂隙、顫痕10①刀痕、裂隙、顫痕，尚不影響診斷：減2分②有刀痕、裂隙、顫痕，影響診斷：減5分⒋切片平坦，無皺褶、折疊10①有皺褶或折疊，尚不影響診斷：各減2分②有皺褶折或折疊，影響診斷：各減5分⒌切片無污染10有污染：減10分⒍無氣泡(切片與載玻片間/10①有氣泡：減3分蓋片與切片、載玻片間)，②膠液外溢：減3分蓋片周圍無膠液外溢⒎透明度好10①透明度差：減1～3分②組織結(jié)構(gòu)模糊：減5～7分⒏細胞核與細胞漿染色對比清晰10①細胞核著色灰淡或過藍：減5分②紅(細胞漿)與藍(細胞核)對比不清晰：減5分⒐切片無松散，裱貼位置適當(dāng)10①切片松散：減5分②切片裱貼位置不當(dāng)：減5分⒑切片整潔，①切片不整潔：減3分標(biāo)簽端正粘牢，編號清晰10②標(biāo)簽粘貼不牢：減3分③編號不清晰：減4分合計100切片質(zhì)量分級標(biāo)準(zhǔn)：①甲級片：≥90分(優(yōu))②乙級片：75～89分(良)③丙級片：60～74分(基本合格)④丁級片：≤59分(不合格)㈣HE染色試劑的配制1.蘇木素染液(1)Harri蘇木素染液蘇木素1g無水乙醇10ml硫酸鋁鉀20g蒸餾水200ml氧化汞0.5g冰醋酸8ml先用無水乙醇溶解蘇木素，用蒸餾水加熱溶解硫酸鋁鉀;然后將該兩液合并煮沸，加入氧化汞，繼續(xù)加熱和攪拌溶液至深紫色，隨即用冰水冷卻，恢復(fù)至室溫后過濾備用。使用前加入冰醋酸并混勻、過濾。(2)Gill改良蘇木素液蘇木素2g無水乙醇250ml硫酸鋁鉀17g蒸餾水750ml碘酸鈉0.2g冰醋酸20ml先用無水乙醇溶解蘇木素，用蒸餾水溶解硫酸鋁鉀;然后將該兩液混合，再依次加入碘酸鈉和冰醋酸。使用前過濾。(3)Mayer改良蘇木素液A液：蘇木素2g無水乙醇40mlB液：硫酸鋁鉀100g蒸餾水600ml將蘇木素溶于無水乙醇中(A液);稍加熱，使硫酸鋁鉀溶于蒸餾水中(B液)。將A液與B液混合后煮沸2min，再用蒸餾水補足至600ml，加入400mg碘化鈉充分混勻。染液呈紫紅色。2.鹽酸-乙醇分化液濃鹽酸1ml70%乙醇99ml3.伊紅液(1)0.25～0.5%伊紅Y水溶液伊紅Y0.25～0.5g蒸餾水100ml冰醋酸1滴(2)0.5%伊紅Y-氯化鈣水溶液伊紅Y0.5g蒸餾水100ml無水氯化鈣0.5g(3)0.25～0.5%伊紅Y-乙醇溶液。伊紅Y0.25~0.5g80%乙醇100ml4.石炭酸-二甲苯混合液石炭酸1份二甲苯3份第二節(jié)細胞學(xué)診斷檢材的制備技術(shù)一、細胞涂片、組織印片和壓片的制備(一)涂片質(zhì)量的基本要求1.將檢材涂布于載玻片的右(或左)2/3處，另1/3部位粘貼標(biāo)簽。2.單向涂布檢材，避免細胞變形。3.均勻涂布檢材，涂片厚薄適當(dāng)。4.紅細胞過多的涂片，可酌情進行溶解紅細胞處理。(二)涂片方法1.涂抹法：用棉簽或針頭將標(biāo)本單向、均勻地涂抹于載玻片上。2.拉片法：將一滴檢材置于一張載玻片上，再用另一張載玻片疊加其上并予輕壓，再將該兩張載玻片朝反向拉動，從而獲得兩張涂片。3.推片法：將一滴檢液置于載玻片的右端，再用另一張窄邊光滑的載玻片作為推片，并以與滴液載玻片成40°夾角、自右向左勻力推動檢液，形成涂片。(三)痰涂片的制作1.送檢的痰液應(yīng)是由肺內(nèi)咳出，最好是清晨空腹時自肺內(nèi)深咳出的痰液。2.核查無誤的收驗痰液，應(yīng)立即制作涂片(通常為2～3張)。3.用細簽或無鉤鑷子挑取痰液置于載玻片上，并左右往復(fù)薄涂，隨即投入固定液中。4.痰液中呈現(xiàn)下列性狀的成分可能含有癌細胞，應(yīng)注意挑取制作涂片：①血絲;②灰白色痰絲(形如白色細線，微細螺旋狀，牽引時可伸長);③透明痰液(可拉成較長細絲)。[及時在細胞學(xué)檢查申請單上記錄痰液性狀]5.檢查痰液中的腫瘤細胞，一般應(yīng)連續(xù)送檢3次。(四)黏膜、皮膚表面刮取(刷取、拉取)物和分泌物的涂片的制作1.陰道排出物、子宮頸刮取物涂片：通常由婦產(chǎn)科醫(yī)師將已制作、固定后的涂片送交病理科檢查。[注意由子宮頸外口上皮移行帶刮取細胞涂片]2.支氣管鏡、胃鏡等內(nèi)腔鏡的黏膜刷取物涂片(黏膜刷片)：刷片通常由內(nèi)腔鏡醫(yī)師制作、固定后送交病理科檢查。3.食管、胃拉網(wǎng)涂片：由食管拉出的套網(wǎng)氣囊適量放氣后，將氣囊套網(wǎng)在載玻片滾動涂片，尤應(yīng)將套囊上血絲、灰白色物制作涂片;涂片通常由有關(guān)臨床醫(yī)師將已制作、固定后的刷片送交病理科檢查。套網(wǎng)中的小塊組織可用來制作石蠟包埋切片。4.眼、耳、鼻、咽、口腔、皮膚等處病變(潰瘍性病變等)的分泌物涂片。(五)液體涂片的制作液體標(biāo)本(檢材)包括乳頭溢液、胸水、腹水、尿液、胃液、腦脊液、穿刺液、沖洗液、灌注液等。除乳頭溢液外，其他液體檢材一般均應(yīng)先行離心(2000r/min，10～20min)后，取其沉淀物制作涂片;液體檢材也可用細胞涂片離心機(cytospin)直接制作細胞涂片。制作好的涂片應(yīng)立即固定和染色。[及時在細胞學(xué)檢查申請單上記錄液體標(biāo)本的性狀和數(shù)量]液體標(biāo)本的離心沉淀物較多時，將制作涂片后剩余的沉淀物固定于4%中性甲醛中1h，然后用檫鏡紙或綢布將其包裹，制作石蠟包埋切片。1.乳頭溢液：直接滴于載玻片上制作涂片。(1)患者乳腺觸及腫物時：用手指自腫物遠方沿乳腺導(dǎo)管引流方向輕力按模擠壓，獲取溢液，宜取中段溢液和血性溢液涂片。(2)患者乳腺未觸及腫物時：可自乳暈周圍向乳腺外周輕力按模擠壓，獲取溢液。2.胸水和腹水(1)由患者體內(nèi)抽取的胸水或腹水應(yīng)盡快送交病理科驗收，檢液量以200～500ml為宜。因故(例如遠途)延時送達時，需在標(biāo)本中加入40%的甲醛(加入量為送檢胸水、腹水量的1/5)，或加入等量的50%乙醇-生理鹽水。(2)胸水、腹水的離心：采取容器底部的液體10ml(包括可能存在的沉淀物)，移入離心管內(nèi)進行離心。(3)離心后，傾去全部上清液，將離心管底部含有沉淀物的液體搖勻并用吸管吸出適量，滴注于載玻片上，制作涂片。3.尿液(1)制作方法同胸、腹水。(2)尿液含有膠狀物時，應(yīng)先將其除去。清除方法：用0.5ml/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)尿液Ph至6.0;離心后，傾去上清液，再向沉淀物中加入95%乙醇5～10ml/L(固定細胞)，靜置5min后加入蒸餾水并輕搖(溶去膠狀物);再次離心后，取沉淀物制作涂片。檢查尿液中的腫瘤細胞，一般應(yīng)連續(xù)送檢3次。4.胃液、胃沖洗液：制作方法同胸、腹水。5.腦脊液(1)制作方法同胸、腹水。(2)腦脊液內(nèi)細胞一般較少，可用微孔濾膜過濾法、沉淀法或纖維捕捉法收集細胞，制作涂片。6.沖洗液、灌洗液、穿刺液涂片的制作：參見上述的胸水、腹水項。二、腫物細針穿刺物涂片的制備(一)實施細針穿刺術(shù)前的準(zhǔn)備工作1.實施細針穿刺術(shù)的病理醫(yī)師應(yīng)先了解患者臨床情況，向患者和/或患者授權(quán)人說明實施穿刺術(shù)的意義、局限性和其他相關(guān)問題等，取得患者和/或患方的知情和理解，并簽署由各醫(yī)院制訂的《申請實施細針穿刺術(shù)細胞病理學(xué)診斷患方知情同意書》。2.合格的手術(shù)操作環(huán)境。3.必備的適用手術(shù)器械和其他相關(guān)設(shè)施。(二)腫物穿刺術(shù)的操作要點：1.確認腫物部位并估計其大小、與皮表距離和質(zhì)地(實/囊性、硬度等)，以指導(dǎo)穿刺的方向、深度和用力程度。2.必須嚴格實行無菌操作。3.根據(jù)腫物大小及其血供情況選擇適用型號的穿刺用針頭。穿刺用針頭的外徑為0.6～0.9mm，安置在2ml或10ml的一次性空注射器上。4.針吸法穿刺術(shù)操作要點(1)進行穿刺前，先將安裝了穿刺用針頭的空注射器管芯外拉2cm;然后，用手固定腫物，將安裝在空注射器上的穿刺用針頭刺入腫物(注射器內(nèi)無空氣)。(2)迅速上下提插注射器管芯10～20次(其間變換針頭方向3～4次)，遂使腫物不同部位的多較內(nèi)容吸進入針頭和注射器內(nèi)。(3)將注射器與針頭分離(管內(nèi)負壓因而解除);隨后，再將該注射器與仍插于腫物內(nèi)的針頭相接，拔出針頭，穿刺結(jié)束。(4)迅速推動注射器的管芯，盡快地將位于穿刺針頭內(nèi)的少量吸出物排射在2～3張清潔的載玻片上，進行涂片。5.涂片方法：用針頭將載玻片上的吸出物輕輕均勻撥開，或用推片法朝一個方向展開(不可雙向往返推移)。6.吸出物過少時，可用向離心管內(nèi)沖洗穿刺針頭;再將沖洗液離心，然后取其沉淀物涂片[參見上述一(五)項“液體涂片的制作”]。7.吸出物較多時，可適量50%乙醇-生理鹽水液將涂片后注射器和針頭內(nèi)剩余的吸出物沖洗至離心管中，離心后，取其沉淀物制作常規(guī)石蠟包埋切片。8.吸出物中含有細小組織塊時，應(yīng)將其制作常規(guī)石蠟包埋切片。9.內(nèi)臟腫物穿刺時，必須在影象學(xué)檢查的引導(dǎo)下用較長細針進行穿刺。10.穿刺操作完成后，即在細胞病理學(xué)檢查單上書寫穿刺記錄。三、組織印片、壓片的制備(一)組織印片：1.用鋒利刀片剖開剛切取的新鮮腫瘤組織或淋巴結(jié)等，然后用清潔載玻片輕壓于組織剖面處，將組織表面的細胞成分印在玻片上。用稍微加溫的載玻片制備印片時，可印得較多細胞。2.制作淋巴結(jié)印片前，應(yīng)先用濾紙吸去淋巴結(jié)切面上的血液、組織液。(二)壓片：1.選取微小薄片組織平鋪于一張載玻片上，再用另一張載玻片疊加其上并予輕壓。2.腦組織質(zhì)軟，易于制作壓片;稍硬的組織需切成細碎薄片制作壓片。四、涂片的固定(一)用于HE染色和巴氏染色的涂片必須濕固定，即涂片后立即進行固定。乳頭溢液涂片和液體標(biāo)本離心沉淀物涂片，應(yīng)待涂膜潮干(即周膜稍干而其中央?yún)^(qū)域未干)時進行固定。用于瑞氏染色、May-Grünwald姬姆薩染色和免疫細胞化學(xué)染色的涂片，必須干固定，即待涂片稍干后再進行固定。(二)固定液1.乙醇-冰醋酸液：95%乙醇∶冰醋酸=99∶1。常用。2.乙醇-乙醚液：95%乙醇49.5ml,乙醚49.5ml,冰醋酸1ml。較常用。3.甲醇：滴加在干燥涂片上，用于瑞氏染色、May-Grünwald姬姆薩染色和免疫細胞化學(xué)染色。4.丙酮：適用于酶類染色。5.Carnoy液：由無水乙醇、氯仿、冰醋酸按6:3:1比例混成，適用于顯示核酸、糖原、黏液染色。涂片在Carnoy液固定3～5min后，應(yīng)移入95%乙醇中繼續(xù)固定。6.對于液體標(biāo)本的離心沉淀物、食管拉網(wǎng)獲取的小塊組織或吸出物中的細小組織塊等，固定于4%中性甲醛液中1h，然后制作常規(guī)石蠟包埋切片。(三)固定方法1.浸入法：(1)將稍為干燥(不能完全干燥)的涂片直接浸泡于固定液內(nèi)至少15～30min。(2)因細胞容易脫落，宜以一個盛有固定液的容器只固定一例標(biāo)本的涂片;一個容器固定多例涂片時，有可能造成的腫瘤細胞交叉污染。(3)必要時可將標(biāo)本涂在硅化載玻片上，以防脫落。(4)固定液重復(fù)使用時，應(yīng)先用濾紙過濾。(5)95%乙醇固定液多次重復(fù)使用時，需測定其濃度比重，乙醇濃度低于90%時應(yīng)予棄用。2.滴加法：將固定液滴加于平放的干燥涂片上，應(yīng)避免因固定液揮發(fā)造成沉淀。(四)固定后未染色涂片的保存或郵寄：涂片固定15min后取出，立即滴加數(shù)滴甘油于涂膜上。對該涂片進行染色前，應(yīng)先將其置于95%乙醇中溶去甘油。五、涂片的染色最常用于細胞病理學(xué)涂片檢查的是蘇木素-伊紅(HE)染色和巴氏染色。一些特殊染色、組織化學(xué)染色和免疫組織化學(xué)染色也用于細胞病理學(xué)的涂片檢查(參見第4章第一、二節(jié))。(一)蘇木素-伊紅(HE)染色(參見本章第一節(jié)的“六”項)。(二)巴氏(Papanicolaou)染色巴氏染色時，細胞透明度好，細胞結(jié)構(gòu)清晰，色彩豐富而鮮艷，主要用于婦科細胞學(xué)涂片、痰涂片和富含鱗狀上皮細胞的涂片檢查。1.試劑配制(1)Harri蘇木素液(參見本章第一節(jié)的“六”項)(2)鹽酸-乙醇液濃鹽酸1ml70%乙醇99ml(3)橙黃G6液橙黃G60.5g蒸餾水5ml無水乙醇95ml磷鎢酸0.015g先將橙黃G溶于蒸餾水中，再加入無水乙醇，然后加入磷鎢酸。(4)EA36染液①EA36儲備液A液：亮綠0.5g，溶于5ml蒸餾水中，溶解后加入無水乙醇至100ml。B液：伊紅0.5g，溶于5ml蒸餾水中，溶解后加入無水乙醇至100ml。C液：俾士麥棕0.5g，溶于5ml蒸餾水中，溶解后加入無水乙醇至100ml。②EA36工作液EA36儲備液的A液45mlEA36儲備液的B液45mlEA36儲備液的C液10ml磷鎢酸0.2g碳酸鋰飽和水溶液1滴2.染色程序(1)將已經(jīng)固定的涂片置于80%乙醇中2min。(2)蒸餾水洗2min。(3)蘇木素液染核10～12min，自來水洗。(4)鹽酸-乙醇液分化約20～30s，至涂片呈淡橙紅色。(5)流水沖洗10～15min，蒸餾水洗。(6)依次用80%、95%乙醇脫水，各2min。(7)橙黃G6液染色3～5min。(8)95%乙醇洗2～3次，洗去多余染液。(9)EA36工作液染色3～5min。(10)95%乙醇洗2～3次，洗去多余染液。(11)無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。3.染色結(jié)果：細胞核呈深藍色，核仁呈紅色;不同分化類型的鱗狀上皮細胞，其胞漿顏色各異：角化細胞呈粉紅色，不全角化細胞呈橙黃色，角化前細胞呈淡藍或淡綠色;紅細胞呈橙紅或鮮紅色，白細胞的胞漿呈淡藍綠色;粘液呈淡藍或粉紅色。(三)瑞氏(Wright)染色瑞氏染色一般用于血液涂片，也可用于檢查腫瘤細胞。1.試劑配制(1)瑞氏染液瑞氏染料1g甲醇600ml將瑞氏染料放入研缽內(nèi)，加入適量甲醇與之混合研磨，使染料逐漸溶解。將溶解的染液傾入另一玻璃瓶內(nèi)，然后再加入適量甲醇繼續(xù)研磨;未溶解的染料如此反復(fù)多次，直至染料完全溶解、甲醇用完為止。染液避光保存?zhèn)溆谩?2)磷酸鹽緩沖液無水磷酸氫二鈉6.5g磷酸二氫鈉4g蒸餾水1000mlpH：6.5～7.02.染色程序(1)涂片自然干燥。(2)滴加瑞氏液染色1min。(2)滴加等量的磷酸緩沖液，輕輕搖蕩玻片或用洗耳膠球在玻片上輕輕吹氣，使兩液體混合均勻，持續(xù)10～15min。(4)流水洗去染液。(5)涂片風(fēng)干后，二甲苯透明，中性樹膠封片。3.染色結(jié)果：胞核呈紫紅色，胞漿呈紫藍色，粘液呈粉紅色或淡藍色。(四)May-Grünwald-姬姆薩(Giemsa)染色May-Grünwald-姬姆薩染色適用于造血系統(tǒng)的細胞涂片和鑒別惡型淋巴瘤的類型。May-Grünwald原液和姬姆薩原液配制繁瑣，可直接購買。1.試劑配制(1)May-Grünwald工作液May-Grünwald原液1份蒸餾水6～10份使用前配制。(2)姬姆薩工作液姬姆薩原液1份蒸餾水6～10份使用前配制。2.染色程序(1)涂片自然干燥，蒸餾水洗1～2min。(2)May-Grünwald工作液染15～30min。(3)自來水沖洗，洗去載玻片上的染液，蒸餾水稍洗。(4)姬姆薩工作液染15～30min。(5)自來水沖洗，洗去載玻片上的染液。(6)涂片風(fēng)干后，二甲苯透明，中性樹膠封片。3.染色結(jié)果：胞核呈紫紅色，胞漿和核仁呈藍紫色。(五)Rakoff染色Rakoff染色用于陰道細胞學(xué)涂片快速測定雌激素水平。1.試劑配制(1)5%淡綠水溶液83ml(2)1%伊紅水溶液17ml將兩液混合后使用。2.染色程序(1)用細胞刷沿陰道側(cè)壁刷取黏膜鱗狀上皮細胞，放入裝有1~2ml生理鹽水的試管內(nèi)。(2)在試管內(nèi)滴入3滴Rakoff染液，用細胞刷在染液中輕搖混合。(3)將1~2滴混合液滴于載玻片上，制成涂片。(4)待涂片干燥后，用中性樹膠封片。染色結(jié)果：鱗狀上皮細胞的嗜酸性和嗜堿性胞漿區(qū)分明顯。角化前細胞的核呈網(wǎng)狀，角化細胞的固縮核呈基本不著色的空泡狀。(六)猩紅-固綠染色猩紅-固綠染色用于顯示性染色體。1.試劑配制(1)猩紅染液水溶性比布里西猩紅1.0g磷鎢酸0.3g冰醋酸5.0ml50%酒精100ml(2)固綠染液:固綠0.5g磷鉬酸0.3g磷鎢酸0.3g冰醋酸5.0ml50%乙醇100ml2.染色步驟(1)涂片經(jīng)95%乙醇固定后，置于70%乙醇中2min。(2)猩紅染液中5min。(3)50%乙醇中漂清多余染液。(4)固綠染液中分化2~5h。每小時在顯微鏡下觀察胞漿和網(wǎng)狀核膜是否呈現(xiàn)綠色;如果綠色滿意，立即取出涂片(一般約需4h)。固縮核呈鮮紅色。(5)50%乙醇中5min。(6)依次置于70%、95%和無水乙醇中各2min。(7)置于二甲苯溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中透明，各2min。(8)中性樹膠封片。染色結(jié)果：胞核呈淡綠色;性染色質(zhì)呈粉紅色、V字形或貼著于細胞膜呈三角形。在性染色質(zhì)周圍可見空泡。(七)Fouchet染色Fouchet染色用于顯示膽色素。1.染液配制Fouchet染液A液：25%三氯醋酸水溶液B液：10%三氯化鐵水溶液A、B液皆小量新鮮配制為宜。使用時，取A、B液各30ml混勻(當(dāng)天使用)。2.染色步驟(1)涂片經(jīng)95%酒精固定后，置于蒸鎦水中漂洗。(2)Fouchet液中染5min。(3)蒸鎦水Ⅰ、Ⅱ中各1min。(4)苦味品紅溶液中染5min。(5)95%乙醇Ⅰ、Ⅱ中漂洗。(6)無水乙醇Ⅰ、Ⅱ中脫水。(7)二甲苯Ⅰ、Ⅱ中透明，中性樹膠封片。3.染色結(jié)果：膽色素呈橄欖綠色，膠原纖維呈紅色，涂片背景呈黃色。(八)硫酸亞鐵染色硫酸亞鐵染色用于顯示黑色素。1.試劑配制(1)2.5%硫酸亞鐵水溶液(2)鐵氰化鉀醋酸液鐵氰化鉀1g蒸餾水99ml冰醋酸1ml(3)1%冰醋酸水溶液(4)核固紅液[參見第4章第一節(jié)的八(三)項(愛先藍法)]2.染色程序(1)涂片經(jīng)95%酒精固定后，置于蒸鎦水中漂洗1~2min。(2)2.5%硫酸亞鐵溶液中1h。(3)蒸鎦水Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中漂洗，各1min。(4)鐵氰化鉀醋酸液中30min。(5)1%冰醋酸液中1min。(6)蒸鎦水漂洗。(7)核固紅液中染1~2min。(8)蒸鎦水漂洗。(9)依次95%乙醇、無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。3.染色結(jié)果：黑色素呈深綠或深藍色，涂片背景呈紅色或粉紅色。(九)快速硝酸銀染色快速硝酸銀染色用于顯示卡氏肺囊蟲和真菌。1.試劑配制(1)硝酸銀烏洛托品常備液：3%烏洛托品溶液100ml與5%的硝酸銀溶液5ml充分混合。工作液：常備液25ml、蒸鎦水25ml與5%硼酸鈉2ml充分混合。(2)固綠常備液：固綠0.2g充分溶解于0.2%冰醋酸液100ml中。工作液：常備液10ml與蒸鎦水40ml混合(3)5%鉻酸溶液1%亞硫酸氫鈉溶液0.2%氯化金溶液2%硫代硫酸鈉溶液2.染色步驟(1)涂片經(jīng)95%乙醇固定后，置于蒸鎦水中漂洗1min。(2)5%鉻酸溶液(43℃水浴)中2min。(3)5%鉻酸溶液(58℃水浴)中15min。(4)自來水漂洗。(5)1%亞硫酸氫鈉溶液中30s。(6)自來水沖洗15s。(7)蒸鎦水Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ漂洗各1min。(8)硝酸銀工作液(43℃水浴)中2min。(9)硝酸銀工作液(58℃水浴)中23min。(10)蒸鎦水Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ漂洗。(11)0.2%氯化金溶液中30s。(12)蒸鎦水Ⅰ、Ⅱ漂洗。(13)2%硫代硫酸鈉溶液中1min。(14)自來水沖洗15s。(15)固綠工作液中染30s。(16)自來水沖洗15s。(17)蒸鎦水Ⅰ、Ⅱ漂洗。(18)95%酒精、無水酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。3.染色結(jié)果：卡氏肺囊蟲和真菌皆呈黑色，形狀清晰;糖原和黏蛋白呈玫瑰色或灰色;涂片背景呈淡綠色。(十)高碘酸-無色品紅(PAS)染色PAS染色用于顯示多糖(糖原及黏蛋白等)。第三節(jié)病理學(xué)攝影技術(shù)一、概述(一)病理醫(yī)師根據(jù)病理學(xué)診斷、教學(xué)和研究的需要確定病理學(xué)攝影的內(nèi)容，進行客觀、準(zhǔn)確的圖像記錄。(二)病理學(xué)攝影的客體包括：①患者體表病征，②大體標(biāo)本(手術(shù)切除和尸檢標(biāo)本的肉眼病變)，③組織學(xué)切片(光學(xué)顯微鏡下病變)，④超薄切片(透射電子顯微鏡下超微病變)，⑤冷凍蝕刻標(biāo)本(掃描電子顯微鏡下超微病變)，⑥細胞培養(yǎng)標(biāo)本，⑦細胞和分子細胞遺傳學(xué)檢測結(jié)果，⑧尸檢過程，⑨動物實驗標(biāo)本和⑩文字、圖像資料翻拍等。二、普通攝影(一)普通攝影是應(yīng)用普通照相機拍攝客體的圖像，包括患者體表病征，大體標(biāo)本的肉眼病變，尸檢過程，動物實驗標(biāo)本和文字、圖像資料等。攝影時應(yīng)注意病征或病變顯示、光照、角度等，適度調(diào)節(jié)距離、光圈、速度。(二)患者體表病征攝影1.需征得患者或患方有關(guān)人員同意。2.應(yīng)遮蓋患者的面容和隱私部位。(三)大體標(biāo)本攝影1.于標(biāo)本下面鋪墊色澤反差鮮明、協(xié)調(diào)的平整背景(紙或布)，并需置放標(biāo)尺和相關(guān)標(biāo)本的病理號，必要時添加箭頭等符號標(biāo)志指示重點部位。2.因照相機固定于翻拍機上，宜選用較慢的快門速度，以增加景深。(四)尸檢過程攝影1.宜用28～135mm變焦鏡頭的135相機進行攝影。2.重要病變的原位攝影：應(yīng)包括局部肉眼病變特征(“近拍”)及其與毗鄰結(jié)構(gòu)的解剖關(guān)系(“全景”)，突出重要病變，兼顧顯示全貌。3.離體標(biāo)本攝影[參見上文：“(二)大體標(biāo)本攝影”](五)文字、圖像資料翻拍1.應(yīng)用翻拍機進行攝影。2.在翻拍相機的兩側(cè)一般至少安裝2～4盞100W燈光，與照明直線呈45o角，以使光線均勻。攝影條件可用測光表確定。(六)底片的選擇1.黑白攝影：擴印照片者，可用ASA100速度底片;制作幻燈片者可用ASA25～50速度底片。2.彩色攝影：(1)用日光型彩色底片攝影時，需用雷登80系列平衡濾色片把色溫調(diào)到5600oK狀態(tài);用燈光照射者，無需平衡濾色片。(2)用燈光型彩色底片在日光下攝影時，需用平衡濾色片把色溫調(diào)到3200oK狀態(tài)。三、光學(xué)顯微鏡(光鏡)攝影(一)光鏡顯微攝影是應(yīng)用顯微照相機拍攝通過光學(xué)顯微鏡放大40～1000倍的客體圖像。(二)攝影用顯微鏡性能要求1.具有攝影目鏡筒。2.能通過目鏡筒對圖像進行對焦。3.具有光鏡選擇移動桿。4.物鏡具有分辨率良好平視場象。5.聚光鏡具有孔徑光闌和調(diào)節(jié)光軸中心的機構(gòu)。6.具有視場光闌。7.光源亮度足夠，電壓可以調(diào)節(jié)。8.具有插入濾色鏡的槽口。(三)顯微攝影的基本裝置1.具有自動輸片機構(gòu)的35mm照相機背。2.具有對不同光照條件進行光路調(diào)節(jié)的調(diào)節(jié)桿。3.具有能對不同標(biāo)本面積進行自動測光的裝置。4.具有與顯微鏡相連接的接圈、平場消色差物鏡(Splan，Dplan)和聚光鏡。5.具有顯微攝影控制臺。目前較常用的有日產(chǎn)OlympusPM-10及PM-20等顯微攝影裝置。常用參數(shù)項目包括：①快門按鈕(EXPOSE)，②底片類型選擇鍵(FORMAT)，③感光度旋鈕(ASA/ISO)，④倒易律失效的補償旋鈕(RECIPROCITY)，⑤曝光增減旋鈕(EXPOSUREADJ)，⑥快門速度調(diào)節(jié)旋鈕(MODE/EXPOSURETIME)，⑦卷片按鈕(OFF/MINDING)，⑧停片進片按鈕(NOWINDING)，⑨自動曝光鎖按鈕(AEOCK)，⑩時間回憶按鈕(TIMERECALL)。(四)顯微攝影要點1.顯微照相機必須安放穩(wěn)定，具有一定防震性，室內(nèi)光線應(yīng)暗些以避免散射光進入目鏡。2.選擇適當(dāng)?shù)牟噬蚝诎椎灼b入照相機身(暗盒)。拍攝常規(guī)HE染色、特殊染色、免疫組化染色切片的病變，宜用感光度ASA為100的彩色或黑白底片;拍攝培養(yǎng)細胞和免疫熒光染色標(biāo)本，宜用感光度ASA為400的彩色或黑白底片。3.調(diào)節(jié)照明和光照(1)打開電源，調(diào)節(jié)電壓(約在9伏)。(2)視場光闌收縮到取景框邊緣外。(3)孔徑光闌調(diào)到物鏡孔徑數(shù)值的60%～80%，例如孔徑為0.25的10×物鏡，聚光鏡上光闌應(yīng)調(diào)到：0.25×60%～80%=0.15～0.2。(4)光通路調(diào)節(jié)①常規(guī)攝影：先將視野與照明合軸、再將聚光鏡調(diào)中，使光線同時調(diào)到①觀察目鏡和②取景目鏡的視野之中，以便于邊觀察邊曝光攝影。如圖像分布均勻，將曝光增減旋鈕(EXPOSUREADJ)調(diào)至“1”處。②暗視野、熒光和偏振光攝影：將光線100%調(diào)到取景目鏡的視野之中，用調(diào)焦鏡觀察視野中的標(biāo)本圖像，進行攝影。如圖像分布不均勻，應(yīng)將曝光增減旋鈕調(diào)于0.25～4之間。4.調(diào)節(jié)和校準(zhǔn)取景目鏡于標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)：旋轉(zhuǎn)調(diào)焦鏡鏡筒上的圓環(huán)，使取景框中央的雙十字線達到最清晰。5.將切片等標(biāo)本放置在載物臺上，先用觀察目鏡選定攝影圖像，再用取景目鏡調(diào)整攝影圖像，并轉(zhuǎn)動微調(diào)旋鈕，同時使圖像與取景框中的雙十字線像達到最清晰。6.用彩色底片攝影時，必須用色溫計調(diào)節(jié)色溫：①將光通路100%到達色溫計上(由調(diào)焦鏡中看不到光線);②觀察色溫指示表，用平衡濾色鏡(使用日光型底片時用雷登80系列)和燈光亮度將色溫調(diào)至最佳色溫點(日光型底片的色溫點為5600K左右，燈光型底片的色溫點定為3200K左右)7.用黑白底片攝影時，必須按下列對應(yīng)關(guān)系選擇濾色片以提高圖像反差和清晰度：標(biāo)本顏色紅橙黃綠深藍濾色鏡藍、綠藍、綠藍紅、藍深綠、橙8.檢查光線可達到底片的位置，確定正確的曝光時間和進行曝光;或用自動攝影控制臺上的按鍵曝光。9.記錄圖像的攝影日期、攝影編號、樣品編號、放大倍數(shù)、內(nèi)容、攝影條件和備注等。10.將已全部攝影過的底片退回底片暗盒內(nèi)，取出底片并進行暗室沖洗等后期處理。四、電子顯微鏡(電鏡)攝影(一)透射電鏡攝影1.檢查電鏡工作狀態(tài)，確認樣本無漂移現(xiàn)象，選擇好曝光條件。2.調(diào)節(jié)好燈絲像，消正像散。3.選擇視野，確定放大倍數(shù)。4.調(diào)整物鏡光闌：樣品反差較強時，使用較大的物鏡光闌孔，直至反差適中為止;反差小時，宜用較小的光闌孔。5.樣本聚焦在低倍電鏡(<1500倍)圖像時，可采用搖擺聚焦法用肉眼定位;樣品聚焦在高倍電鏡(>1500倍)圖像時，除用肉眼觀察定位外，還需采用系列拍照法：于確定焦點后，用細調(diào)鈕聚焦，增加物鏡電流，每調(diào)動一級最小鈕拍攝一張底片，總計拍攝4～5張，從中選擇最佳底片。6.放平熒光屏，傳送底片使之進入攝影位置。7.調(diào)定曝光亮度和速度，然后啟動快門進行曝光;曝光結(jié)束后，將底片送入儲存盒內(nèi)。將底片全部攝影的儲存盒取出，進行暗室沖洗等后期處理。8.用于透射電鏡攝影的底片一般為色盲片(對紅光不感光)，曝光時間為2～4s，ASA[中文?]為8～25s。(二)掃描電鏡攝影1.檢查電鏡工作狀態(tài)(1)加速電壓強度的選擇：取決于樣品的性質(zhì)、圖像反差和放大倍率。高倍觀察時一般需要較高的加速電壓，低倍觀察時需要較低的加速電壓。(2)聚光鏡電流的選擇：在保證圖像亮度和反差要求前提下，盡可能加大聚光鏡電流，以提高照片分辨力，加大景深。(3)物鏡光闌孔的選擇：對于表面結(jié)構(gòu)高低差異大的樣本可用較小的光闌孔，以獲較大景深;低倍鏡下觀察時，可選用較大光闌孔，以增加視野內(nèi)的信號強度。(4)選擇攝影掃描速度。(5)視野選擇：與透射電鏡相同。2.確定曝光時間。在掃描電鏡照相機處于光關(guān)?F8或F11情況下，照片的曝光時間在50～100s之間。3.樣品的聚焦程度主要依靠操作人員的肉眼觀察。拍攝較低放大倍數(shù)(<1000倍)的圖像，以調(diào)節(jié)粗聚焦鈕為主;拍攝較高放大倍數(shù)(>1000倍)圖像，應(yīng)先調(diào)節(jié)粗聚焦鈕，再調(diào)節(jié)細聚焦鈕。4.圖像消像散：①先調(diào)節(jié)X方向旋鈕，消除X方向的像散;②再調(diào)節(jié)Y方向旋鈕，消除Y方向的像散;③最后再調(diào)節(jié)細聚焦鈕，直到圖像最清晰為止。5.調(diào)節(jié)高度和反差：掃描電鏡一般裝有亮度和反差自動調(diào)節(jié)按鈕，按動該鈕即可得到反差適當(dāng)?shù)膱D像。6.拍攝：將照相機中的底片調(diào)至攝影位置，按動面板上的攝影快門鈕，熒光屏上便由上而下自動掃描圖像;掃描結(jié)束后，即完成一幅照片拍攝。7.底片選擇：掃描電鏡裝有120或135照相機，故一般選擇感光速度為ASA100的120或135膠卷，;裝有Polaroid后背相機的掃描電鏡，可進行一次成像。8.記錄圖像的攝影日期、攝影編號、樣本編號、放大倍數(shù)、內(nèi)容、攝影條件和備注等。五、暗室技術(shù)(一)暗室技術(shù)用于：①普通攝影、顯微鏡攝影和電鏡攝影底片的沖洗，及其照片的洗印和放大;②幻燈片的制作等。(二)攝影底片的沖洗操作程序①于完全黑暗中取出全色底片(色盲片或電鏡底片可在紅燈下取出)→②將底片卷入螺旋形的槽內(nèi)或顯影架上→③清水濕潤2min→④顯影3～12min(20℃)→⑤定影10～20min(20℃)→⑥水洗30min→⑦涼干底片→⑧分類裝入底片袋內(nèi)，并做好記錄。(三)試劑配制1.顯影液：有多種配方，組成成分大同小異。下列的D‐11配方兼用于沖洗底片和照片的洗印和放大顯影：水(50℃)500ml米吐爾1.0g無水亞硫酸鈉75g對苯二酚9.0g無水碳酸鈉25g溴化鉀5g加水至1000ml沖洗電鏡底片、色盲片和制做幻燈片、顯影照片等，需要極強反差，可用以上配方的原液顯影。普通攝影用的全色底片對反差要求不很高，可將原液用清水稀釋成1:2～1:4的工作液。2.停影液水750ml28%醋酸48ml加水至1000ml3.定影液：較常用下列的F‐5酸性堅膜定影液水(50℃)600ml硫代硫酸鈉240g無水亞硫酸鈉15g28%醋酸48ml硼砂(結(jié)晶)7.5g硫酸鋁鉀15g加水至1000ml(四)照片的洗印和放大洗印和放大照片一般使用黑白放大相紙。這類相紙根據(jù)反差分為特軟性、軟性、中性、硬性和特硬性等5種，即0、1、2、3、4號相紙。較常用者為3號相紙。1.洗?。涸谟∠嘞渲胁僮?一般裝有自動定時曝光控制器)，主要用于制做透射電鏡攝影的照片。已經(jīng)曝光的像紙進入沖洗操作程序(同底片的沖洗程序)。2.放大：在放大機上操作，主要用于制做顯微鏡攝影的照片。(1)操作程序①放大鏡頭焦距的選擇參見下表：底片規(guī)格135120120120120(16張)(12張)(10張)(8張)負片負片負片底片尺寸(mm×mm)24×3645×6060×5060×7060×9080×10590×120108×125鏡頭焦距(mm)507575～8080～9090～105135150175②裝入底片：將底片的乳劑面向下，目測聚焦，使放大的圖像結(jié)構(gòu)清晰。③選擇相紙：常用3號放大紙。④確定鏡頭光圈和曝光時間：對于正常反差的底片，將鏡頭光圈縮小到f/5.6至f/8之間，曝光時間控制在8～20s為宜。⑤將曝光后放大紙進入顯影、定影程序中。六、數(shù)碼攝影技術(shù)數(shù)碼攝影通常包括：①拍攝、②下載(將所拍攝的照片由數(shù)碼相機下載到電腦中)、③修飾(加工處理等后期制作)和④分享(將經(jīng)過修飾的照片輸出，例如打印等)4個步驟。(一)選擇適當(dāng)?shù)恼掌|(zhì)量要求數(shù)碼相機的照片質(zhì)量(解像度)分為①精細、②正常、③經(jīng)濟等檔次。圖像質(zhì)量越好，每張照片占用的存儲空間越大，在相同內(nèi)存的情況下，解存儲的照片數(shù)量越小。因此，在拍攝之前，應(yīng)先根據(jù)需要，設(shè)定對于照片的質(zhì)量要求，即設(shè)定壓縮比。設(shè)定壓縮比的原則是：①對照片質(zhì)量要求越低，壓縮比可越高;②只在監(jiān)視器或電視機上觀察圖像而不打印時，壓縮比可高些，可選擇“正?！鄙踔痢敖?jīng)濟”檔拍攝儲存量小的圖像。③需要打印照片(尤其欲獲大幅彩色照片)時，壓縮比越低越好，應(yīng)選擇“精細”檔，最好選擇不壓縮的拍攝存儲方式。(二)力求曝光準(zhǔn)確1.數(shù)碼相機的感光度最低為ISO60，最高為ISO6400，多在ISO100左右。ISO額定值較低時，解像度高、色調(diào)范圍寬和反差低;ISO額定值較高時，解像度低、色調(diào)范圍寬和反差高。2.選擇感光度的原則：(1)檢查光線是否足夠。(2)盡量用較低的感光度拍攝。(3)曝光時間不要過長。照度低時，應(yīng)盡量利用閃光拍攝。避免進行高感光度的長時間曝光。(4)曝光準(zhǔn)確與否決定于對照片質(zhì)量的要求。(三)注意對焦條件。(四)注意用光。(五)準(zhǔn)確使用快門和光圈：宜用自動模式(Auto)拍攝。使用手動相機或?qū)⒆詣酉鄼C設(shè)置于手動模式時，需要隨時進行調(diào)整。(六)正確設(shè)定白平衡：拍攝前設(shè)定自動白平衡，或是將白平衡調(diào)整設(shè)定在與拍攝光照條件一致的檔上。(七)正確使用存儲媒介：向數(shù)碼相機內(nèi)插入移動式存儲卡時，一定要到位;從相機中取出存儲卡時，要防止滑落到堅硬的物面上，以免不能讀取照片的某些數(shù)據(jù)，甚至損壞存儲卡。(八)勿距攝影客體過遠：適當(dāng)拍攝距離為5～15尺。拍攝小物體、文件等時，應(yīng)啟動數(shù)碼相機的近攝功能。第五部分內(nèi)窺鏡技術(shù)操作規(guī)范一、上消化道內(nèi)鏡檢查上消化道內(nèi)鏡能清晰地觀察食管、胃、十二指腸壺腹至降段的粘膜形態(tài)及病變，如有病變可作活體組織病理學(xué)和細胞學(xué)檢查以確定診斷。【適應(yīng)證】1.有上消化道癥狀，包括上腹不適、脹、痛、燒心及反酸、吞咽不適、梗噎、噯氣、呃逆及不明原因食欲不振、體重下降、貧血等。2.上消化道鋇餐造影檢查不能確定病變或癥狀與鋇餐檢查結(jié)果不符者。3.原因不明的急(慢)性上消化道出血或須做內(nèi)鏡止血治療者。4.須隨訪的病變，如潰瘍病、萎縮性胃炎、癌前病變等。5.高危人群(食管癌、胃癌高發(fā)區(qū))的普查。6.須做內(nèi)鏡治療者?！窘勺C】1.食管、胃、十二指腸急性穿孔。2.嚴重心、肺、腎、腦功能不全及多臟器功能衰竭者。3.精神病及意識明顯障礙不能合作者。【術(shù)前準(zhǔn)備】1.器材內(nèi)鏡、光源主機、活檢鉗、細胞刷、必要的各種治療器械、表面麻醉劑、各種急救藥品(備用)以及內(nèi)鏡消毒設(shè)備。2.技術(shù)準(zhǔn)備(1)了解病史、檢查目的、特殊要求、其他檢查情況、有無內(nèi)鏡檢查禁忌證、有無藥物過敏及急、慢性傳染病等。(2)向患者講明檢查目的及配合檢查須注意的事項。(3)術(shù)前禁食6～8h。已做鋇餐檢查者須待鋇劑排空后再做胃鏡檢查。幽門梗阻患者應(yīng)禁食2～3d，必要時術(shù)前洗胃。最好排空大小便。(4)咽部麻醉：檢查前15min用含2%～4%利多卡因的膠漿(內(nèi)有祛泡劑)或普魯卡因噴霧或口含，有麻醉藥過敏史者可不用麻醉。(5)不必常規(guī)應(yīng)用鎮(zhèn)靜劑、解痙劑，對個別精神緊張或胃腸蠕動強者可在檢查前15rnin肌內(nèi)注射阿托品?；颊邨l件許可時可行無痛胃鏡檢查。(6)術(shù)前常規(guī)檢查各項器材是否齊備?！静僮鞣椒俺绦颉?.患者體位(1)患者取左側(cè)臥位，頭部略向前傾，雙腿屈曲。(2)如患者有活動假牙宜取出，松解領(lǐng)口和褲帶，輕輕咬住牙墊。2.插鏡目前均使用單手法：術(shù)者面向患者，左手持內(nèi)鏡操縱部，右手在距離鏡端20cm處持鏡，使鏡面對準(zhǔn)患者舌根部，將鏡端自牙墊中插至咽后壁，左手調(diào)節(jié)旋鈕方向，使之順利到達咽喉部。.囑患者做吞咽動作，順勢輕柔地插人食管。切忌用暴力硬插。雙手法(現(xiàn)已基本不用)3.胃鏡檢查次序插鏡后，內(nèi)鏡直視下從食管上端開始循腔進鏡，依次觀察食管、賁門、胃體、胃竇、幽門、十二指腸。在退鏡時依次從十二指腸、胃竇、胃角(低位翻轉(zhuǎn))、胃體、胃底貴門(高位翻轉(zhuǎn))、食管退出。依次順序全面觀察，應(yīng)用旋轉(zhuǎn)鏡身，屈曲鏡端等方法，觀察上消化道全部，如戮膜色澤、光滑度、貓液、蠕動及內(nèi)腔的形狀等。如發(fā)現(xiàn)病變應(yīng)確定其性質(zhì)、范圍及部位，并詳細記錄。并進行攝影、活檢及細胞學(xué)取材。4.攝影現(xiàn)在攝影可通過計算機的視頻采集程序來完成，只需踩下腳踏板即可完成病變部位的攝影工作。攝影應(yīng)在觀察完畢、活檢前進行。攝影時應(yīng)保持視野清楚，注意將病變.目標(biāo)的特征從不同方向顯示，并使病變得到可顯示部位的標(biāo)志背景的襯托。5.活體組織檢查良、惡性局灶性病變應(yīng)取4塊以上的粘膜，立即放人4%甲醛液(10%福爾馬林)固定，并貼標(biāo)簽避免錯誤，多個部位活檢時，須在標(biāo)簽上注明活檢部位。彌散性病變的粘膜應(yīng)按食管、胃分瓶固定。須做快速尿素酶試驗者應(yīng)在幽門前區(qū)取1塊以上標(biāo)本，立即放入試劑盒內(nèi)測試。6.細胞學(xué)取材應(yīng)在活檢后，檢查結(jié)束前進行。插入細胞刷，在病變及其周圍輕輕擦拭。刷后應(yīng)將刷子退至活檢孔前端，然后隨內(nèi)鏡一同拔出，做2～4張涂片。涂片結(jié)束后立即放在95%乙醇中固定送檢。檢查結(jié)束前應(yīng)抽吸胃內(nèi)氣體，同時退鏡?！咀⒁馐马棥?.檢查結(jié)束后注意患者全身情況，盡管上消化道內(nèi)鏡檢查是比較安全的，仍應(yīng)仔細觀察有無并發(fā)癥發(fā)生。2.書寫或電腦打印報告，并向患者解釋檢查結(jié)果。3.1h以后才允許進食，可進食溫的流質(zhì)至半流質(zhì)。4.活體組織檢查一般1周后取報告?！静l(fā)癥】1.咽部感染咽部病變，可因咽部損傷繼發(fā)感染，甚至發(fā)生咽部蜂窩織炎或咽后壁膿腫，應(yīng)予休息及抗生素治療。2.食管穿孔為嚴重甚至致死性并發(fā)癥，尤其并發(fā)縱隔炎者，須抗生素治療、手術(shù)縫合或引流治療。3.胃穿孔不如食管穿孔嚴重，須抗生素及手術(shù)縫合治療。4.出血因粘膜損傷或活檢時取組織太深、撕拉過度所致。出血量不多時，多能自行停止，如出血過多，應(yīng)內(nèi)鏡下止血。5.心血管意外可因咽喉迷走神經(jīng)反射引起，有個別心搏停止病例。根據(jù)當(dāng)時心臟情況，應(yīng)予以相應(yīng)的處理，包括吸氧、抗心律失常藥物、復(fù)蘇術(shù)等。6.顳下頜關(guān)節(jié)脫位患者因用力咬牙墊而惡心時，易發(fā)生顳下頜關(guān)節(jié)異常運動引起脫位，可采用手法復(fù)位。二、結(jié)腸鏡檢查結(jié)腸鏡檢查是診斷和治療大腸疾病的安全、有效、可靠、簡便的方法之一，不但可明確鋇劑灌腸X線檢查未能明確的病變，而且能取活檢做病理檢查，并對某些大腸疾病進行治療。廣泛開展此項檢查，可提高早期大腸癌的發(fā)現(xiàn)率，還能對癌前期病變和大腸息肉及時治療。【適應(yīng)證】1.原因不明的下消化道出血;2.原因不明的慢性腹瀉、便秘、腹痛、腹脹;3.鋇劑灌腸發(fā)現(xiàn)有異常;4.不能排除大腸或末端回腸的腫物;5.原因不明的低位腸梗阻;6.某些炎癥性腸病須做鑒別和確定累及范圍及程度;7.大腸某些良性病變?yōu)槌鈵盒宰?8.大腸息肉和癌診斷已明確，為了除外其他部位有無伴發(fā)性病變;9.行結(jié)腸鏡下治療;10.大腸某些疾病藥物治療的隨訪;11.大腸癌手術(shù)后，大腸息肉摘除后隨訪;12.大腸腫瘤的普查?！窘勺C】1.疑有大腸穿孔、腹膜炎;2.嚴重心、肺、腎、肝及精神疾病;3.多次開腹手術(shù)或有腸粘連者，應(yīng)慎行結(jié)腸鏡檢查;4.妊娠期可能會導(dǎo)致流產(chǎn)或早產(chǎn);5.大腸炎癥性疾病急性活動期為相對禁忌證;6.高熱、衰弱、嚴重腹痛、低血壓者，最好待病情穩(wěn)定后再行結(jié)腸鏡檢查;7.不合作者及腸道準(zhǔn)備不充分者為相對禁忌證?！拘g(shù)前準(zhǔn)備】.1.收集病史，介紹“患者須知”，爭取患者配合;2.檢查前3d少渣飲食，檢查前1d流質(zhì)飲食，檢查日上午禁食。檢查前晚瀉藥清腸或清潔灌腸。現(xiàn)在有更簡便的清腸方法，可根據(jù)不同要求按說明書使用。3.準(zhǔn)備好結(jié)腸鏡、冷光源、括檢鉗、注射針、圈套器、高頻電發(fā)生器、細胞刷、吸引器、潤滑油等?！静僮鞣椒俺绦颉糠蛛p人操作或單人操作法。一、雙人操作法：1.患者取左側(cè)臥位，常規(guī)做肛門指檢，除外肛門狹窄和直腸腫物。2.循腔進鏡是結(jié)腸鏡操作的基本原則，即視野中見到腸腔才能插鏡，否則要退拉一下再找腔。3.進鏡中常有幾個急彎腸段，如乙狀結(jié)腸、降結(jié)腸交界處，脾曲、肝曲;找腸腔如有困難，可根據(jù)見到的腸腔走行方向行滑行插人，一般滑行插人2}cm左右即現(xiàn)腸腔;如滑進很長距離仍不見腸腔，應(yīng)該退鏡另找方向再插鏡。4.插鏡時應(yīng)該無明顯阻力，若有劇烈疼痛，切忌盲目滑進和暴力插鏡。5.在通過急彎腸段后，有時雖見到腸腔但仍不能進鏡，相反有時會退鏡，這時要退鏡并鉤拉取直鏡身、縮短腸管，使結(jié)腸變直，銳角變鈍角，再通過。若插人仍有困難，可改變患者體位或腹壁加壓，避免傳導(dǎo)支點和阻力的產(chǎn)生。6.整個插人過程要盡量少注氣多吸氣。7.一定要在視野中見到回盲瓣和闌尾口才能認為鏡端已抵達盲腸，插入成功。8.必要時可通過回盲瓣插人回腸末端20～40cm。9.結(jié)腸鏡觀察和治療應(yīng)在插人內(nèi)鏡時就開始，但重點應(yīng)在抵達盲腸后退鏡時進行，應(yīng)按先近端后遠端的順序進行。10.見到陽性病變應(yīng)取活檢組織2～4塊，立即放人4%甲醛(10%福爾馬林溶液)，并貼好標(biāo)簽。二、單人操作法：(一)操作的基本姿勢患者基本上采取左側(cè)臥位，原則上檢查醫(yī)生站在其身后。將內(nèi)鏡監(jiān)視器擺放在便于術(shù)者觀看的位置。通常放在患者的頭部上方。仍可使用傳統(tǒng)的雙人操作法的位置。為了便于檢查，應(yīng)使用操作空間較大的檢查臺。左手放在與胸平行的高度握住內(nèi)鏡的操作部，右手握住距離肛門20～30cm處的內(nèi)鏡鏡身軟管。(二)縮短腸管與取直鏡身在內(nèi)鏡插入過程中，保持內(nèi)鏡鏡身呈相對直線狀態(tài)，避免使腸管伸展，在縮短腸管的同時推進內(nèi)鏡，這是結(jié)腸鏡得以順利插入的基本要領(lǐng)。如果能夠保持內(nèi)鏡鏡身的直線狀態(tài)，就可以直接將手部動作傳遞到內(nèi)鏡的前端而無須任何多余動作。一般來說，這種邊保持直線鏡身和縮短腸管，邊插入鏡身軟管的“鏡身取直縮短腸管法”，是可能完全控制內(nèi)鏡的大腸。在彎曲處適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)腸腔內(nèi)氣體量(氣體要少!)和退鏡操作，易使角度直線化(銳角轉(zhuǎn)鈍角)。在結(jié)腸鏡插入時，彎曲的消除方法是操作成功的重要因素之一。在彎曲處，按照鏡身取直縮短法的原則，將伸展的腸管縮短到最短程度，并保持鏡身的直線狀態(tài)。二.單人操作法的插入技巧適當(dāng)保持腸管壁與內(nèi)鏡前端之間的距離極為重要。應(yīng)保持一定的距離，應(yīng)緩慢退鏡至前端不退出的位置，保持足夠的距離，再慢慢地一點一點地推進內(nèi)鏡。當(dāng)穿過腸壁的皺褶后，向管腔走行的方向稍稍旋轉(zhuǎn)內(nèi)鏡，即可插入前方的腸管。如果內(nèi)鏡的前端觸到了腸管的內(nèi)壁，畫面則是全紅的一片，將無法辨認內(nèi)腔的位置。勉強插入，患者會感到疼痛難忍，甚至?xí)心c管穿孔的危險。操作過程中應(yīng)盡可能少地注入空氣，通過捕捉如皺褶的外形、粘膜表面的顏色等一些極細微的變化來辨別內(nèi)鏡的前進方向至為重要。三.操作注意事項在插入過中應(yīng)始終記送氣不要過量，送氣過量會使腸過度擴張，導(dǎo)致腸管彎曲的部位形成銳角，并且送氣過多會引起腸管擴張給患者帶來痛苦，致使腸管縮短操作困難。當(dāng)腸管急峻彎曲插入困難時，為了尋找腸腔而不斷送氣，常常會導(dǎo)致深部的腸管發(fā)生更為強烈的彎曲和扭曲。送氣過量會使患者的腸管象一只吹足了氣又被扭曲的氣球。最后使操作醫(yī)生陷入難以操作進鏡的地步。送氣量只要能達到使醫(yī)生從粘膜皺襞方向判斷出腸管的走向的程度即可。在操作不順利時，反倒應(yīng)該多使用空氣抽吸法和向后退鏡法，或者用手按壓腹部和變換患者體位的方法為好。但送氣量過少，對整個腸管的彎曲程度和正確的走向是難以判斷的?！咀⒁馐马棥?.檢查結(jié)束后觀察患者有無腹痛、腹脹、腹部壓痛，若無異常。10mi,n后即可離去。:2.若有腹痛、腹脹、肝濁音界消失，應(yīng)立即做腹部X線透視，如腸下有游離氣體即為消化道穿孔，應(yīng)立即外科手術(shù)。3.書寫報告單，應(yīng)詳細描述陽性病變的部位、范圍、大小、形狀等，并解釋檢查結(jié)果。【并發(fā)癥】1.穿孔發(fā)生率為0.11%～0.26%，最常見為乙狀結(jié)腸穿孔，結(jié)腸穿孔一旦確診應(yīng)立即手術(shù)。腹腔外穿孔一般不須手術(shù)，予以禁食補液，抗感染治療，1～2周后穿孔會自行愈合，腹膜后及皮下氣腫可自行吸收。2.出血發(fā)生率為0.07%，大部分經(jīng)鏡下止血和保守治療可獲痊愈。3.漿膜撕裂也稱不完全穿孔，較少見，一般不須特殊治療，會自行愈合。4.腸絞痛一般為檢查刺激所致，無特殊意義，能自行緩解。5.心血管意外結(jié)腸鏡檢查對心血管影響極其輕微，原有嚴重冠心病或心律失常者應(yīng)慎重施行。6.呼吸抑制大部分與術(shù)前應(yīng)用鎮(zhèn)靜或麻醉劑有關(guān)，一旦發(fā)生應(yīng)立即復(fù)蘇