土壤中分解尿素的細菌分離和計數(shù)PPT課件

1、.,1,課題2土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù),微生物的培養(yǎng)與應用,.,2,分離產生脲酶的細菌,尿素CO(NH2)2重要的農業(yè)氮肥。,只能被土壤中細菌分解為NH3才能被植物吸收利用CO(NH2)2+H2OCO2+2NH3,課題背景,.,3,課題目的,土壤中尿素分解菌的分離與計數(shù),從土壤中分離出能夠分解尿素的細菌,統(tǒng)計每克土樣中究竟含有多少這樣的細菌,.,4,思考：PCR技術要求使用耐高溫的DNA聚合酶，這種酶要能忍受93左右的高溫。如果請你來尋找這種耐高溫的酶，你會去哪里尋找？()A土壤中B海水中C熱泉中D冷庫中,C,如何尋找耐高溫的酶？尋找高溫環(huán)境；原理：熱泉70-80的高溫條件淘汰了絕大多

2、數(shù)的微生物，使得耐熱的Taq細菌脫穎而出。選出耐高溫細菌后，從耐高溫菌種中提取耐高溫酶。,.,5,1、自然界中目的菌株的刷選原理：,一、篩選菌株,2、實驗室中篩選微生物的原理：,（純且活的菌種）,在尋找目的菌株時，要根據(jù)它對生存環(huán)境的要求，到相應的環(huán)境中去找。,人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其他微生物生長。,.,6,KH2PO41.4gNaHPO42.1gMgSO4H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素1.0g瓊脂15.0g將上述物質溶解后，用蒸餾水定容到1000mL。,該培養(yǎng)基的配方中，為微生物的生長提供碳源和氮源的分別是什么物質？此配方能否篩選出分解

3、尿素的細菌？為什么？,?,碳源：葡萄糖、尿素,氮源：尿素,能。只有產生脲酶的細菌能利用尿素作為氮源而生存。,.,7,3、方法：,利用選擇培養(yǎng)基分離,選擇培養(yǎng)基：,允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基。,(1)在培養(yǎng)基中加入某種化學物質。,利用選擇培養(yǎng)基分離微生物的方法：,例如，加入青霉素可以分離出；加入高濃度的食鹽可以得到。,酵母菌和霉菌,金黃色葡萄球菌,這里的加入是在培養(yǎng)成分的基礎上加入。,.,8,(2)改變培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分。,例如，缺乏氮源時可以分離；尿素作為唯一氮源時，可以分離出石油作為唯一碳源時，可以分離出,固氮微生物,能消除石油污染的微生物,能分解尿素

4、的細菌,(3)改變微生物的培養(yǎng)條件。,例如，將培養(yǎng)基放在高溫環(huán)境中培養(yǎng)可以得到,耐高溫的微生物,.,9,本課題使用的培養(yǎng)基的配方如下：,請分析后回答：(1)在該培養(yǎng)基的配方中，為微生物的生長提供碳源和氮源的分別是_和_。(2)該培養(yǎng)基為_培養(yǎng)基(按物理狀態(tài)分)，理由是_。(3)想一想這種培養(yǎng)基對微生物是否具有選擇作用？如果具有，又是如何進行選擇的？_。,葡萄糖,尿素,固體,有凝固劑瓊脂,有選擇作用。此配方中尿素是唯一氮源，因此，只有能夠利用尿素的微生物才能夠生長,.,10,二、統(tǒng)計菌落數(shù)目,1、方法：,常用稀釋涂布平板法統(tǒng)計活菌的數(shù)目,原理：,當樣品的時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落來源于樣品稀釋

5、液中的。,為了保證結果準確，一般選擇菌落數(shù)在統(tǒng)計,通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約含有多少的活菌。,要求：,30300個菌落的平板,稀釋度足夠高,一個活菌,.,11,例：兩位同學用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細菌數(shù)。從對應稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下兩種統(tǒng)計結果。1、甲同學在該濃度下涂布了一個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)為230。2、乙同學在該濃度下涂布了A、B、C三個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別為21、212、256，該同學以這三個平板上菌落數(shù)的平均值163作為統(tǒng)計結果。你認為這兩位同學的作法正確嗎？如果有問題，錯在哪？,甲：沒有重復實驗（至少涂布3個平板）乙：A組結果誤差過大，不

6、應用于計算平均值,?,.,12,用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細菌數(shù)，在對應稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下幾種統(tǒng)計結果，正確的是()A涂布了一個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)是230B涂布了兩個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)是215和260，取平均值238C涂布了三個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別是21、212和256，取平均值163D涂布了三個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別是210、240和250，取平均值233,.,13,因為當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。因此統(tǒng)計結果一般用菌落數(shù)表示。,=（平均菌落數(shù)涂布的稀釋液體積）稀釋倍數(shù)。,缺點：,操作復雜，實驗結果有一定的誤差。,統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活

7、菌的實際數(shù)目低,每克樣品中的菌株數(shù)=（C/V)XMC:某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)；V:所用稀釋液的體積；M:稀釋倍數(shù)。,計算公式：,.,14,顯微鏡直接計數(shù),優(yōu)點：缺點：,計數(shù)方便，操作簡單,死菌、活菌都計算在內，統(tǒng)計結果比實際值偏大,（統(tǒng)計菌株數(shù)目）,.,15,1、產生標準形態(tài)菌落的細菌的最初數(shù)目和培養(yǎng)基分別是（）A一個細菌、液體培養(yǎng)基B許多細菌、液體培養(yǎng)基C一個細菌、固體培養(yǎng)基D許多細菌、固體培養(yǎng)基2、某同學在稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基上測得平板上的菌落數(shù)的平均值為215，那么每毫升樣品中菌落數(shù)是（涂布平板時所用稀釋液的體積為0.1ml）A2.15108B2.15109C215D21

8、.53、下列有關檢測土壤中細菌總數(shù)實驗操作的敘述中，不正確的是（）A用蒸餾水配制牛肉膏蛋白胨，高溫、高壓滅菌后道平板B取104、105、106倍土壤稀釋液和無菌水各0.1ml涂布不同平板C將實驗組和對照組平板倒置，37恒溫培養(yǎng)24h-48hD確定對照組無菌后，選擇菌落數(shù)在300以上的平板進行計數(shù)。,C,B,D,.,16,利用選擇培養(yǎng)基進行尿素分解菌的分離過程中，從對應稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，A、B兩同學分別得到以下兩種統(tǒng)計結果。1、A同學篩選出150個菌落。2、B同學篩選出50個菌落。B認為A的培養(yǎng)基被雜菌污染了，或培養(yǎng)基中混入了其他含氮物質，因而導致不能分解尿素的細菌也能在該培養(yǎng)基中生長

9、。A確認自己的操作無誤，但也拿不出能令人信服的證據(jù)。請你幫助A同學改進實驗，提供具有說明了的證據(jù)。,?,方案1：其他同學用A同學的土樣進行實驗。方案2：A同學以不接種的培養(yǎng)基作為空白對照。,.,17,2、增加實驗說服力的措施：,排除實驗組中非測試因素對實驗結果的影響，提高實驗結果的可信度。,設置重復：,排除偶然因素對實驗結果的影響。,在培養(yǎng)過程中同一稀釋度下應涂布至少3個平板，才能增強說服力和準確性,設置對照：,若對照的培養(yǎng)皿中無菌落生長，說明：,方法：,方法：,觀察培養(yǎng)物中是否有雜菌污染,如空白對照組,培養(yǎng)基未被雜菌感染,培養(yǎng)基混入其他雜菌,若實驗的培養(yǎng)基菌落數(shù)偏高或者菌落形態(tài)多樣，說明：,

10、.,18,若牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上的菌落數(shù)大于選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目，說明：,觀察選擇培養(yǎng)物是否具有選擇作用,如完全培養(yǎng)基對照組,選擇培養(yǎng)基具有篩選作用,.,19,距地表約38cm土壤層,三、實驗設計,1、實驗流程：,2、操作流程：,（1）土壤取樣,取樣原因：土壤要求：取樣部位：,土壤“微生物的天然培養(yǎng)基”，含有大量的微生物，數(shù)量最大，種類最多。,富含有機質，pH接近中性且潮濕。,.,20,測細菌數(shù)：測放線菌：測真菌數(shù)：,（2）樣品稀釋,稀釋原因：稀釋標準：稀釋倍數(shù)：,樣品的稀釋程度直接影響平板上生長的菌落數(shù)目,選用一定稀釋范圍的樣品液進行培養(yǎng)，保證獲得菌落數(shù)在30-300之間，便于計數(shù)。,一般用1

11、04、105、106稀釋液,一般用103、104、105稀釋液,一般用102、103、104稀釋液,思考：為什么分離不同的微生物要用不同的稀釋度？,土壤中各類微生物的數(shù)量不同如果是第一次做這個實驗，稀釋倍數(shù)的范圍可以放寬103-107.,.,21,1、關于土壤取樣的敘述，錯誤的是（）A土壤取樣，應選取肥沃、濕潤的土壤B先鏟去表層土3-8cm左右，再取樣C取樣用的小鐵鏟和信封在使用前不用滅菌D應在火焰旁稱取土壤2、下列關于“土壤中分解尿素的細菌的分離”實驗步驟排列正確的是土壤取樣稱取10g土壤加入盛有90ml無菌水的錐形瓶中吸取0.1ml進行平板涂布依次稀釋至101、102、103、104、10

12、5、106、107稀釋度ABCD,C,C,.,22,（三）微生物的培養(yǎng)與觀察1、接種：用適當?shù)南♂屢和坎计桨?、培養(yǎng)：細菌：3037，12d;放線菌:2528,57d;霉菌:2528,34d.3、觀察：a.每24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目b.以“穩(wěn)定菌落”為觀察對象,.,23,（四）鑒定：篩選后必鑒定鑒別培養(yǎng)基：不影響微生物的生存酚紅培養(yǎng)基：鑒定分解尿素的細菌。原理：脲酶催化尿素分解成氨培養(yǎng)基堿性增強酚紅變紅,.,24,為了調查某河流的水質狀況，某研究小組測定了該河流水樣中的細菌含量，并進行了細菌分離等工作?；卮鹣铝袉栴}：(1)該小組采用稀釋涂布平板法檢測水樣中細菌含量。在涂布接種前，隨機取若干滅菌后的空白平板先行培養(yǎng)了一段時間，這樣做的目的是；然后，將水樣稀釋100倍，在3個平板上用涂布法分別接入稀釋液；經適當培養(yǎng)后，3個平板上的菌落數(shù)分別為39、38和37，據(jù)此可得出每升水樣中的活菌數(shù)為。,.,25,(2)該小組采用平板劃線法分離水樣中的細菌，操作時