儀器分析-色譜法引論.ppt

1、色譜分析法 Chromatography,第一章 色譜法引論,一、概述 問題 問題1：什么是色譜法？ 問題2：為什么色譜法能將混合物分開？ 問題3：色譜法的分類？ 問題4：各種色譜法的應用范圍？,1、什么是色譜法？,茨維特的實驗 茨維特：俄國植物學家，主要從事植物色素的研究工作，在1906 年發(fā)表的文章中，首次提出了色譜的概念。,茨維特的實驗,碳酸鈣,石油醚,什么是色譜法？,Chromatography 色譜法是一種分離方法。 特點：有兩相，一是固定相（stationary phase），一是流動相（mobile phase），兩相作相向運動。 將色譜法用于分析中，則稱為色譜分析。 因此色譜分

2、析是一種分離、分析法。,2、色譜法分離原理,當流動相中所攜帶的混合物流過固定相時，就會和固定相發(fā)生作用(力的作用)。由于混合物中各組分在性質(zhì)和結構上有差異，與固定相發(fā)生作用的大小也有差異。因此在同一推動力作用下，不同組分在固定相中的滯留時間有長有短，從而按先后不同的次序從固定相中流出。,3、色譜法的分類,按流動相狀態(tài)的不同，可分為以下三類： 氣相色譜法 (Gas Chromatography, GC) 液相色譜法 (Liquid Chromatography，LC) 超臨界流體色譜 (Supercritical Fluid Chromatography，SFC),色譜分析儀器流程,流動相攜帶進

3、樣裝置引入的混合試樣進入色譜柱 混合試樣在色譜柱中進行分離 各組分依次進入檢測器檢測 檢測響應信號導入計算機 得到色譜圖,什么是氣相色譜法？,以氣體為流動相的色譜法 Gas Chromatogaphy，簡稱GC 按固定相狀態(tài)的不同可分為： 氣固色譜(GSC) 氣液色譜(GLC),應用范圍： 用于分離分析易汽化（在-190-500范圍內(nèi)有0.2-10mmHg的蒸氣壓的）穩(wěn)定、不易分解、不易反應的樣品，特別適合用于同系物、同分異構體的分離。,什么是液相色譜法？,以液體為流動相的色譜法 Liquid Chromatography，簡稱LC 應用范圍： 用于分離分析高沸點、熱不穩(wěn)定、離子型的樣品。,其

4、他分類方式,按固定相使用的形式可分為 柱色譜（column chromatography） 將固定相裝在色譜柱內(nèi) 紙色譜（Paper Chromatography） 用濾紙做固定相或固定相載體的色譜 薄層色譜（Thin Lay Chromatography） 固定相均勻涂在玻璃板或塑料板上,應用 TLC:,1 2 3 4 5 6 7 8 9,Bands Description 1 Pseudoginsenoside F11 2 American Ginseng 3 Ginsenoside Rg1 4 Ginsenoside Rf 5 Ginseng 6 Ginsenoside Rc 7 Gin

5、senoside Rb1 8 Notoginseng 9 Notoginsenoside R1,Identification of Ginseng, America ginseng and Notoginseng,二、色譜法基本理論,擬解決的問題 色譜相關術語 色譜法理論的概況 色譜中的動力學理論 色譜分離情況的評價方法 影響色譜分離的主要因素及條件選擇（從理論的角度加以判斷）,1、色譜相關術語,關于色譜峰 關于保留值 關于分配平衡,關于色譜峰的術語,峰,峰高,基線,峰寬,半峰寬,峰面積,標準偏差,關于色譜峰的術語,峰底寬、半峰寬及標準偏差三者的關系為：W=4，Wh/2=2.354 拖尾峰 伸

6、舌峰 鬼峰、假峰 畸峰 峰底 基線漂移 基線噪聲 譜帶擴張,關于保留值的術語,死時間（t0，tM）：無保留組分出峰時間 保留時間（tR）： 調(diào)整保留時間（tR）：,關于保留值的術語,死體積（V0，VM）： 保留體積（VR）： 調(diào)整保留體積（V R）：,關于保留值的術語,相對保留值（ri,s）： 相對保留值又稱為選擇性因子（） 在氣相色譜中，相對保留值的大小僅與固定相種類和柱溫有關。,關于保留值的術語,保留指數(shù)（I）：又叫Kovats，它規(guī)定正構烷烴的保留指數(shù)是其碳數(shù)的100倍，其它物質(zhì)的保留指數(shù)在實際色譜條件下測定。選取與被測物相鄰的兩種正構烷烴做參照系，其中一種碳數(shù)為Z，另一種為Z+1，被測

7、物的保留指數(shù)由下式計算：,關于分配平衡,分配系數(shù)K（distribution coefficient ）,關于分配平衡,分配比k：又稱為容量因子、容量比、分配容量，是指在一定溫度和壓力下，平衡狀態(tài)時組分在固定相中的量與在流動相中的量之比值。是衡量柱子對組分保留能力的重要參數(shù)。,關于分配平衡,相比： 色譜柱內(nèi)固定相和流動相體積之比 是柱型及結構的重要特征。,2、色譜基本理論概述,研究理論的目的 解決色譜峰的分離問題 三個色譜基本理論問題 色譜熱力學問題發(fā)展高選擇性色譜柱 色譜動力學問題發(fā)展高效能色譜柱 分離條件的最優(yōu)化問題分離條件優(yōu)化,3、色譜動力學理論,研究流出曲線展寬的本質(zhì)及曲線形狀變化的影

8、響因素 塔板理論 速率理論,塔板理論,塔板理論將色譜柱比作精餾塔，通過概率理論得到流出曲線方程：,塔板理論,當t=tR時，C=Cmax，峰高正比于進樣量W，是峰高定量的理論基礎。 當n越大，柱效越大，Cmax/W越大。即保留時間一定時，塔板數(shù)越多，峰越高。 Cmax反比于tR，tR小，Cmax大， 保留時間小的組分峰高且窄。tR大，Cmax小， 保留時間大的組分峰低且寬。,柱效,由流出曲線方程導出： H=L/n,柱效,n是峰相對展寬的量度 n是柱效的量度 n是常數(shù)時，Y與tR 成正比 n越大，h越小，表明組分在柱中達到的分配平衡次數(shù)越多，對分離越有利，但還不能預言各組分有被分離的可能性。,塔板

9、理論的貢獻,塔板理論有助于我們形象的理解色譜的分離過程。 導出色譜流出曲線方程，它符合高斯分布，與實驗現(xiàn)象相吻合。 導出理論塔板數(shù)的計算公式，作為柱效的評價指標。,塔板理論的局限,塔板高度H是一個抽象的物理量，它的色譜本質(zhì)是什么？它與哪些參變量有關，又怎樣影響峰的擴張？對實驗的指導意義有限。 不能解釋流速對理論塔板數(shù)的影響。 有些假設不合理，如沒有考慮縱向擴散對色譜分離的影響等。,4. 色譜相關術語,關于色譜峰 關于保留值 關于分配平衡,關于色譜峰的術語,峰,峰高,基線,峰寬,半峰寬,峰面積,標準偏差,峰底寬、半峰寬及標準偏差三者的關系為： W=4，Wh/2=2.354 拖尾峰 伸舌峰 鬼峰、

10、假峰 畸峰 峰底 基線漂移 基線噪聲 譜帶擴張,關于保留值的術語,死時間(tM): 無保留組分出峰時間 保留時間(tR): 調(diào)整保留時間(tR): 死體積(VM): 保留體積(VR): 調(diào)整保留體積(VR):,相對保留值(ri,s): 保留指數(shù)(I)：又叫Kovats，它規(guī)定正構烷烴的保留指數(shù)是其碳數(shù)的100倍，其它物質(zhì)的保留指數(shù)在實際色譜條件下測定。選取與被測物相鄰的兩種正構烷烴做參照系，其中一種碳數(shù)為Z，另一種為Z+1，被測物的保留指數(shù)由下式計算：,關于分配平衡,分配系數(shù)K (distribution coefficient ) 分配比k又稱為容量因子、容量比、分配容量，是指在一定溫度和壓

11、力下，平衡狀態(tài)時組分在固定相中的量與在流動相中的量之比值。是衡量柱子對組分保留能力的重要參數(shù)。,相比 色譜柱內(nèi)固定相和流動相體積之比 是柱型及結構的重要特征。,二、色譜分析法基本理論,研究理論的目的 解決色譜峰的分離問題 三個色譜基本理論問題 色譜熱力學問題發(fā)展高選擇性色譜柱 色譜動力學問題發(fā)展高效能色譜柱 分離條件的最優(yōu)化問題分離條件優(yōu)化,1、色譜動力學理論,研究流出曲線展寬的本質(zhì)及曲線形狀變化的影響因素 塔板理論 速率理論,（1）塔板理論,推導 塔板理論將色譜柱比作精餾塔，通過概率理論得到流出曲線方程：,為標準偏差,當t=tR時，C=Cmax，峰高正比于進樣量C0，是峰高定量的理論基礎。

12、當n越大，柱效越大，Cmax/ C0越大。即保留時間一定時，塔板數(shù)越多，峰越高。 Cmax反比于tR，tR小，Cmax大， 保留時間小的組分峰高且窄。tR大，Cmax小， 保留時間大的組分峰低且寬。,對色譜流出曲線方程的討論,柱效,由流出曲線方程導出： H=L/n n是峰相對展寬的量度 n是柱效的量度 n是常數(shù)時，Y與tR 成正比 n越大，h越小，表明組分在柱中達到的分配平衡次數(shù)越多，對分離越有利，但還不能預言各組分有被分離的可能性。,塔板理論的貢獻,塔板理論有助于我們形象的理解色譜的分離過程。 導出色譜流出曲線方程，它符合高斯分布，與實驗現(xiàn)象相吻合。 導出理論塔板數(shù)的計算公式，作為柱效的評價

13、指標。,塔板理論的局限,塔板高度H是一個抽象的物理量，它的色譜本質(zhì)是什么？它與哪些參變量有關，又怎樣影響峰的擴張？對實驗的指導意義有限。 不能解釋流速對理論塔板數(shù)的影響。 有些假設不合理，如沒有考慮縱向擴散對色譜分離的影響等。,速率理論,速率理論是1956年荷蘭學者Van Deemter等提出，因此又稱作范第姆特方程 運用流體分子規(guī)律研究色譜過程中產(chǎn)生色譜峰擴展的因素，導出了理論塔板高度與流動相線速度的關系，揭示了影響塔板高度的動力學因素,速率方程的導出,根據(jù)塔板計算公式： n=5.54(tR/Y1/2)2 速率理論討論的是色譜峰展寬原因，即影響塔板數(shù)n的因素，也就是影響塔板高度H的因素。 H

14、=A+B/u+Cu,渦流擴散項,A=2dp,渦流擴散項,均勻性因子,粒徑,渦流擴散項,渦流擴散項A：由不等路徑造成的色譜峰擴展。由于柱填料粒徑大小不同，粒度分布范圍不一致及填充的不均勻，形成寬窄、長短不同的路徑，因此流動相沿柱內(nèi)各路徑形成紊亂的渦流運動，有些溶質(zhì)分子沿較窄且直的路徑運行，以較快的速度通過色譜柱，發(fā)生分子超前，反之，有些分子發(fā)生滯后，從而使色譜峰產(chǎn)生擴散。,分子擴散項,B/u B=2Dg,彎曲因子,擴散系數(shù),分子擴散項,分子擴散項：由于分子的縱向擴散造成的色譜峰擴展。即由于試樣組分被載氣帶入色譜柱后，是以塞子的形式存在于色譜柱的很小一段空間中，由于在塞子前后存在濃度梯度，因此使運

15、動著的分子產(chǎn)生縱向擴散，引起色譜峰擴展,傳質(zhì)阻力項,氣相傳質(zhì)阻力項,氣相傳質(zhì)阻力項Cg：試樣組分從氣相移動到固定相表面的過程中，由于質(zhì)量交換過程需要一定時間（即傳質(zhì)阻力）而使分子有滯留傾向。在此過程中，部分組分分子隨流動相向前運動，發(fā)生分子超前，引起色譜峰擴展。,氣相傳質(zhì)阻力項表達式,Cgu Cg =,容量因子,液相傳質(zhì)阻力項,液相傳質(zhì)阻力項CL：試樣組分從固定相表面移動到固定相內(nèi)部的過程中，由于質(zhì)量交換過程需要一定時間（即傳質(zhì)阻力）而使分子有滯留傾向。在此過程中，部分組分分子先離開固定相表面，發(fā)生分子超前，引起色譜峰擴展。,液相傳質(zhì)阻力相表達式,CL u CL =,液膜厚度,液相擴散系數(shù),氣

16、相色譜中的速率方程,速率方程給我們的什么啟示,為柱型的研究和發(fā)展提供理論依據(jù) 為操作條件的選擇提供理論指導 為色譜柱的填充提供理論指導,對柱型研究和發(fā)展的影響,A=0? Golay1957年提出毛細管柱的概念（opentube） 毛細管柱A=0，H=B/u+Cu H，N，分離能力大大提高,對柱型研究和發(fā)展的影響,B=0? 溶質(zhì)在液體中的擴散系數(shù)DL10-5cm2/s 溶質(zhì)在氣體中的擴散系數(shù)Dg10-1cm2/s DL Dg 當采用液體作流動相時 B0 液體作流動相時可用更細的固定相，A HPLC柱效比GC要高23個數(shù)量級,操作條件對柱效的影響,載氣線速度（流速）的影響,最佳流速：u=(B/C)

17、1/2 實用最佳流速：比最佳流速更快 A與流速無關 B/u：當流速小時，對H的大小起主導作用 Cu：當流速大時，對H的大小起主導作用,容量因子k的影響,不同組分k不同，測出的柱效不同 在氣相傳質(zhì)阻力相中，k ，Cg 理論上說k越小柱效越高，實際不可取 在液相傳質(zhì)阻力相中，k ，Cl先， 后當k=1時，最大。 希望k在一個合適的范圍內(nèi)，通過改變柱溫，固定相，柱型參數(shù)等可實現(xiàn)。,柱溫的影響,間接影響、十分復雜 對k影響，對擴散系數(shù)影響，從而對柱效產(chǎn)生影響，但影響情況難以判斷,對色譜柱的填充提供理論指導,柱徑：根據(jù)速率方程，柱徑越小，柱效越高，但柱徑越小，固定相越難填充均勻。 柱長L：柱長增加，總塔

18、板數(shù)增加，但柱長增加，分離時間將增加。 固定相粒徑dp：根據(jù)速率方程，粒徑減小，A項減小，C項減小，柱效增加。但粒徑太小，不易填充，同時A項增大。,對色譜柱的填充提供理論指導,液膜厚度df：從柱效角度考慮，液膜越薄，柱效越高（根據(jù)速率方程），但允許的進樣量減小。固定液與擔體的配比一般在5:100-25:100之間，但現(xiàn)在更低配比的固定相也應用廣泛。 更重要的是：不同沸點的物質(zhì)，應采用不同配比的固定相。,影響譜帶擴張的其他因素,非線性分配色譜 載體表面活性吸附中心造成的拖尾 柱外效應 色譜柱外引起色譜峰擴展的因素：如進樣系統(tǒng)及進樣方式、系統(tǒng)連接管、檢測器死體積，檢測器響應時間常數(shù)等因素引起的譜帶

19、寬展。,速率理論方程式的偶合式,H=(1/A+1/Cgu)-1+B/u+Clu A= (1/A+1/Cgu)-1為偶合項 已被普遍接受,2. 色譜分離基本方程,對于常規(guī)分析工作，一般選用： 選擇性系數(shù)（相對保留值）與保留指數(shù)I來評價固定液 有效塔板數(shù)N有效來評價色譜柱與分離條件 以分離度R作為柱的總分離效能指標,（1）幾個概念選擇性系數(shù),定義與相對保留值(ri,s)基本相同 不同之處在于選擇性系數(shù)是兩個相鄰峰的調(diào)整保留值之比（后峰比前峰，1），而不是被測物與標準物質(zhì)的調(diào)整保留值之比（可小于1） 它是評價固定液選擇性的指標。選擇性系數(shù)越大，該柱對此相鄰峰的分離越好。,幾個概念有效塔板數(shù)N有效,在

20、氣相色譜中，通常用有效塔板數(shù)N有效和有效塔板高度H有效來評價柱子的分離效能，它扣除了死體積對分離的影響，更好地反映了柱子的實際分離效能。 柱效越高，該柱的分離能力越好。,幾個概念分離度R,R越大，說明兩組分分離得越好。 由于該定義綜合了色譜動力學和熱力學因素，可作為色譜柱的總分離效能指標。,(2)色譜分離基本方程（Purnell方程）,公式推導,（3）色譜分離基本方程的啟示,要改善物質(zhì)對的分離（提高R），即提高兩相鄰物質(zhì)的分離度，可以采取以下措施： 提高柱效N 提高選擇性系數(shù) 增大容量因子k,N的影響，如何提高N？,分離度R與理論塔板數(shù)N的平方根成正比關系，增加塔板數(shù)，有利于提高分離度。 增加

21、柱長可增加N，改善分離，但分析時間將大大延長，峰產(chǎn)生擴展。 減小塔板高度H： 根據(jù)速率方程的啟示制備一根性能優(yōu)良的色譜柱是十分重要的。 根據(jù)速率方程選擇合適的色譜條件同樣有效。,K的影響，如何改變k？,分離度與容量因子有關，容量因子越大，分離越好。 k 1 3 5 7 9 11 13 k/k+1 0.50 0.75 0.83 0.88 0.90 0.92 0.93 1.00 但當容量因子大于10，k/(k+1)的改變不大，而分析時間將大大延長。因此，k的最佳范圍是1100 程序升溫,具體的,汽化溫度,一般進樣方法下，汽化溫度比柱溫高30-70。 進樣量大時高一些好，保證瞬間汽化。 保證不可超過

22、試樣的分解溫度。 其它氣化溫度與具體進樣方式有關。,檢測器溫度,一般大于或等于柱溫，具體與檢測器種類有關。,進樣量,液體試樣一般進樣量0.1-5l。 氣體試樣一般進樣量為0.1-10ml。 具體視柱類型，固定液含量（不能超過柱容量） 、進樣方式、檢測器的靈敏度和線性范圍等確定。,流動相（載氣）種類,流動相的種類要視檢測器種類確定。 常用的有氫氣（熱導用）、氮氣（氫火焰用）、氦氣（均可用，但價格較高）。 氫氣和氦氣適合于快速分析。 氮氣做載氣峰型較好，柱效較高。,三、色譜定性與定量方法,人參藥材的HPLC圖譜,5,1,人參皂苷標準品的HPLC色譜圖,Rg1,Rb1,Re,丙二?；藚⒃碥誖b1,

23、面積歸一：Rg1=1.0%, Rb1=3.5% 外標法：Rg1=0.2%, Rb1=0.5%,（1） 色譜定性分析,利用保留值及其規(guī)律定性 各物質(zhì)在一定的色譜條件下均有確定不變的保留值，因此保留值可作為定性指標。 利用純物對照定性 利用文獻值對照定性,純物質(zhì)對照定性,實現(xiàn)方法 利用保留時間和保留體積定性,用相對保留值定性 用已知物增加峰高法定性,應用范圍：適用于簡單混合物，對該樣品已有了解并具有純物質(zhì)的情況。 優(yōu)點：應用簡便，不需要其他儀器。 缺點：定性結果的可信度不高。 提高可信度的方法：雙柱、雙體系定性,文獻值對照定性分析 （GC）,實現(xiàn)方法 測定相對保留值ri,s 測定保留指數(shù)I 優(yōu)點：

24、無需純物質(zhì)；保留指數(shù)具有較好的重現(xiàn)性和精密度；只與固定相和柱溫有關。 缺點：對結構復雜的物質(zhì)，缺乏數(shù)據(jù)。 適用范圍：適用于簡單混合物，無需純物質(zhì)。,與其它儀器或化學方法聯(lián)合定性,離線聯(lián)用方式 化學法 儀器法 在線聯(lián)用方式 化學法 儀器法,離線聯(lián)用方式,收集方法：GC中一般采用液氮冷阱冷卻后收集 應用范圍：無標準物時，可對較為復雜的混合物進行定性分析 缺點：麻煩,在線聯(lián)用方式,用化學方法輔助定性 柱前反應：在色譜柱前裝上預處理柱，帶有某些官能團的化合物在預柱中發(fā)生物理化學變化，其色譜峰會消失或移動，與反應前色譜圖比較，可初步判斷試樣中含那些官能團。 柱后反應：在色譜柱后裝上型毛細管分流器，將各組

25、分導入官能團試劑反應管，利用官能團反應對組分進行定性。,與其它儀器聯(lián)用定性 混合物經(jīng)色譜分離后，將各組分直接由接口導入其它儀器中進行定性。常用的聯(lián)用方法有：GC-MS、GC-FTIR、LC-MS 其它儀器相當于色譜儀的檢測器。 使用范圍：復雜樣品的定性。 優(yōu)點：不需要標準物，定性結果可信度高，操作方便。 缺點：需要特殊儀器或設備。,GC-MS,（2）色譜定量分析,定量基礎 色譜定量分析是基于被測物質(zhì)的量與峰面積成正比。在一定色譜條件下有：,定量要解決的問題,峰面積的測量和計算 校正因子的測量與計算 色譜定量方法及其應用,峰面積的測量與計算,積分儀或色譜工作站 簡便、速度快，精度高，可達0.2-2%，對小峰及不對稱峰的結果準確，是色譜發(fā)展趨勢。 手動測量與計算,峰高乘半峰寬法：適于對稱峰 峰高乘峰底寬度法：適于矮寬峰 峰高乘平均峰寬法：適于不對稱峰 峰高乘保留值法：適于狹窄峰，快速簡便，常用于工廠控制分析。,重疊峰的測量,切線分峰 垂線分峰,連線分峰 計算機擬合分峰,校正因子的測量與計算,相對校正因子 由于絕對校正因子與儀器的靈敏度有關，又由于靈敏度與實驗條件相關，且每一檢測器的靈敏度都是不同的，它不容易測量準確，亦無通用性，所以實際工