HIV基因的復(fù)制和逆轉(zhuǎn)錄PPT課件

1、.,1,Doc.Huang,生化案例討論,.,2,問題討論？,HIV基因組的復(fù)制過程？（參考章節(jié)：DNA的生物合成、RNA的生物合成） 逆轉(zhuǎn)錄如何導(dǎo)致HIV基因突變？HIV基因突變的生物學(xué)意義？（參考章節(jié)：DNA的生物合成）,.,3,首先了解下：,HIV的基因組結(jié)構(gòu)及功能,.,4,.,5,一、 HIV的基因組結(jié)構(gòu)及功能,HIV基因組為單股正鏈RNA二倍體，每條RNA鏈長(zhǎng)約9.8kb，兩條鏈的5端借氫鍵形成二聚體。與其他逆轉(zhuǎn)錄病毒相同，HIV的基因結(jié)構(gòu)從5端到3端依次為5LTR-gag-pol-env-3LTR。5端有帽狀結(jié)構(gòu)m7G5ppp5GmpNp，3端有polyA序列。除三個(gè)編碼結(jié)構(gòu)蛋白的

2、基因gag、pol、env外，HIV還有較其他逆轉(zhuǎn)錄病毒更多的調(diào)節(jié)基因（regulatory gene）和附加基因(accessory gene)，其編碼的的調(diào)節(jié)蛋白在病毒的整個(gè)感染及復(fù)制過程中具有非常重要的作用，目前已發(fā)現(xiàn)至少有7種：tat、rev、nef、vpr、vpu、vpx和vif。,.,6,1長(zhǎng)未端重復(fù)序列：,HIV基因組兩端的長(zhǎng)未端重復(fù)序列（long terminal repeat, LTR）不編碼病毒產(chǎn)物，對(duì)于病毒基因表達(dá)的起始和調(diào)節(jié)至關(guān)重要，其上有許多細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，可分為調(diào)節(jié)單位、核心轉(zhuǎn)錄單位和反式激活效應(yīng)元件單位（TAR）三個(gè)不同的調(diào)控功能區(qū)。,.,7,2 Gag基

3、因：,gag基因能編碼約500個(gè)氨基酸組成的聚合前體蛋白，經(jīng)蛋白酶水解形成P17，P24核蛋白，使RNA不受外界核酸酶破壞。 gag基因編碼幾種病毒核心蛋白（衣殼蛋白）,.,8,3 Pol基因：,Pol基因編碼聚合酶前體蛋白，經(jīng)切割形成蛋白酶、整合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶H，均為病毒增殖所必需。 pol基因編碼3種酶：反轉(zhuǎn)錄酶、蛋白酶和整合酶,.,9,4 Env基因,env基因編碼約863個(gè)氨基酸的前體蛋白并糖基化成gp160，gp120和gp41。gp120含有中和抗原決定簇，已證明HIV中和抗原表位，在gp120 V3環(huán)上，V3環(huán)區(qū)是囊膜蛋白的重要功能區(qū)，在病毒與細(xì)胞融合中起重要作用。gp

4、120與跨膜蛋白gp41以非共價(jià)鍵相連。gp41與靶細(xì)胞融合，促使病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。實(shí)驗(yàn)表明gp41亦有較強(qiáng)抗原性，能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體反應(yīng)。 env基因編碼插入病毒外膜磷脂雙層中的糖蛋白。,.,10,其他調(diào)節(jié)基因和附加基因,5TaT 基因編碼蛋白可與LTR結(jié)合，以增加病毒所有基因轉(zhuǎn)錄率，也能在轉(zhuǎn)錄后促進(jìn)病毒mRNA的翻譯。 6Rev基因產(chǎn)物是一種順式激活因子，能對(duì)env和gag中順式作用抑制序去抑制作用，增強(qiáng)gag和env基因的表達(dá)，以合成相應(yīng)的病毒結(jié)構(gòu)蛋白。 7Nef基因編碼蛋白P27對(duì)HIV基因的表達(dá)有負(fù)調(diào)控作用，以推遲病毒復(fù)制。該蛋白作用于HIv cDNA的LTR，抑制整合的病毒轉(zhuǎn)錄?？赡苁荋

5、IV在體內(nèi)維持持續(xù)感集體所必需。,.,11,其他調(diào)節(jié)基因和附加基因,8Vif基因?qū)IV并非必不可少，但可能影響游離HIV感染性、病毒體的產(chǎn)生和體內(nèi)傳播。 9VPU基因?yàn)镠IV-1所特有，對(duì)HIV的有效復(fù)制及病毒體的裝配與成熟不可少。 10Vpr基因編碼蛋白是一種弱的轉(zhuǎn)錄激活物，在體內(nèi)繁殖周期中起一定作用。,.,12,二、,DNA的反轉(zhuǎn)錄合成 （Reverse transcription）,.,13,中心法則：,.,14,逆轉(zhuǎn)錄病毒和逆轉(zhuǎn)錄酶,.,15,逆轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象,.,16,反轉(zhuǎn)錄病毒： RNA病毒，含有反轉(zhuǎn)錄酶 反轉(zhuǎn)錄：在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下以RNA為模板合成DNA的過程。 反

6、轉(zhuǎn)錄酶：以RNA為模板指導(dǎo)三磷酸脫氧核苷酸合成互補(bǔ)DNA（cDNA）的酶,.,17,1、反轉(zhuǎn)錄酶以tRNA為引物合成雙鏈cDNA,RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性； DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性； RNAse H的活性（是指它能夠從53和35兩個(gè)方向水解DNA-RNA雜合分子中的RNA）。 然而：反轉(zhuǎn)錄酶中不具有35外切酶活性，因此沒有校正功能,反轉(zhuǎn)錄酶有3種酶的活性：,.,18,反轉(zhuǎn)錄酶的結(jié)構(gòu),.,19,2、反轉(zhuǎn)錄病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的主要活動(dòng),（一）反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA,（二）雙鏈cDNA插入宿主染色體形成原病毒,原病毒或前病毒：存在于真核染色體中和反轉(zhuǎn)錄病毒RNA基因組相對(duì)應(yīng)的雙鏈DNA序列。

7、,.,20,反轉(zhuǎn)錄病毒RNA基因組和原病毒,.,21,反轉(zhuǎn)錄病毒RNA基因組轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈cDNA的途徑,.,22,問題4：,HIV基因組的復(fù)制過程？ HIV的復(fù)制.swf,.,23,gag基因編碼幾種病毒核心蛋白（衣殼蛋白）; pol基因編碼3種酶：反轉(zhuǎn)錄酶、蛋白酶和整合酶; env基因編碼插入病毒外膜磷脂雙層中的糖蛋白。,3、原病毒DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生病毒RNA,具有自我復(fù)制能力的反轉(zhuǎn)錄病毒基因組含有3個(gè)基因：,.,24,直接翻譯產(chǎn)生多蛋白Gag和Gag-Pol。 含有包裝信號(hào)，因此構(gòu)成完整的病毒基因組。 大約一半初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)過剪接加工形成gag-pol mRNA和env mRNA。,原病毒初級(jí)轉(zhuǎn)

8、錄產(chǎn)物有3種重要功能：,.,25,初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物多蛋白Gag-Pol，經(jīng)過蛋白酶水解，可產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄酶、蛋白酶和整合酶。 多蛋白Gag經(jīng)過加工，生成4種病毒衣殼蛋白。 env基因編碼的Env蛋白，經(jīng)過加工以后插入病毒外膜磷脂雙層。 這些病毒蛋白和病毒RNA基因組可以迅速組裝成許多新的反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。,4、病毒RNA經(jīng)翻譯和包裝形成反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒,.,26,簡(jiǎn)單地重溫下HIV感染的過程,.,27,1、吸附及穿入,HIV-1感染人體后，病毒選擇性的吸附于靶細(xì)胞的CD 4受體上，病毒包膜發(fā)生構(gòu)象改變，外膜糖蛋白gp120的V3區(qū)與宿主細(xì)胞的CCR5或CXCR4結(jié)合，引起跨膜糖蛋白gp41區(qū)段HIV-1感

9、染人體后，病毒選擇性的吸附于靶細(xì)胞的CD 4受體上，病毒包膜發(fā)生構(gòu)象改變，外膜糖蛋白gp120的V3區(qū)與宿主細(xì)胞的CCR5或CXCR4結(jié)合，引起跨膜糖蛋白gp41區(qū)段與靶細(xì)胞膜上的融合結(jié) 構(gòu)域發(fā)生融合，使病毒核衣殼穿入宿主細(xì)胞。 與靶細(xì)胞膜上的融合結(jié) 構(gòu)域發(fā)生融合，使病毒核衣殼穿入宿主細(xì)胞。,.,28,2、脫衣殼和逆轉(zhuǎn)錄,病毒進(jìn)入細(xì)胞后包裹在病毒衣殼內(nèi)的病毒RNA，在與親環(huán)素結(jié)合的衣殼蛋白p24的輔助下出胞。這一過程對(duì)環(huán)孢菌素A敏感。緊接著病毒RNA利用自身逆轉(zhuǎn)酶的RNA依賴的DNA聚合酶和RNA酶活性進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，最后合成病毒基因組的雙鏈DNA分子(cDNA)。,.,29,3、cDNA變?yōu)镈N

10、A,環(huán)化cDNA在環(huán)化酶的作用下形成以共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合的雙鏈環(huán)狀DNA分子。其中非共價(jià)結(jié)合的環(huán)狀DNA是整合到宿主染色體上的形式，抗病毒藥對(duì)此無效。大多數(shù)新合成的病毒DNA以游離、非整合的共價(jià)結(jié)合的環(huán)狀DNA形式保留在細(xì)胞漿內(nèi)，它沒有轉(zhuǎn)錄作用，但有致病理變化作用，抗病毒藥對(duì)以這種形式存在的病毒有效， 可使病毒載量下降。,.,30,4、轉(zhuǎn)錄出正鏈RNA,cDNA插入細(xì)胞基因組成為前病毒，然后以前病毒為模板，轉(zhuǎn)錄出正鏈RNA，即為病毒基因組。,.,31,問題5：,逆轉(zhuǎn)錄如何導(dǎo)致HIV基因突變？ HIV基因突變的生物學(xué)意義？,.,32,一、多種因素通過不同形式可引起DNA損傷,堿基開環(huán)和糖苷鍵斷裂引

11、起堿基丟失 輻射或氧化損傷等引起堿基改變 化學(xué)因素可引起核苷酸插入或缺失 輻射和化學(xué)損傷可引起DNA鏈斷裂 物理和化學(xué)因素可引起DNA鏈間或鏈內(nèi)交聯(lián),.,33,二、DNA損傷的結(jié)果:,其一，導(dǎo)致復(fù)制或轉(zhuǎn)錄障礙 其二，導(dǎo)致復(fù)制后產(chǎn)生基因突變,.,34,遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變而引起的遺傳信息改變，均可稱為突變。,在復(fù)制過程中發(fā)生的DNA突變稱為DNA損傷(DNA damage)。,從分子水平來看，突變就是DNA分子上堿基的改變。,三、突變：,.,35,四、突變的意義,（一）突變是進(jìn)化、分化的分子基礎(chǔ) （二）突變導(dǎo)致基因型改變 （三）突變導(dǎo)致死亡 （四）突變是某些疾病的發(fā)病基礎(chǔ),.,36,五、HIV的高

12、突變率：,HIV的突變率極高，基因組的點(diǎn)突變每天都可發(fā)生，導(dǎo)致HIV頻發(fā)表位突變。 HIV為逆轉(zhuǎn)錄病毒，反轉(zhuǎn)錄酶中不具有35外切酶活性，因此沒有校正功能，DNA損傷修復(fù)能力較差，所以由反轉(zhuǎn)錄酶催化合成的DNA出錯(cuò)率比較高，因而HIV的變異頻率非常高，每一輪復(fù)制都會(huì)引入約10個(gè)堿基的錯(cuò)誤。,.,37,六、HIV基因突變的生物學(xué)意義,高的變異頻率使世界不同地區(qū)甚至同一感染個(gè)體不同時(shí)期HIV的基因組都有較大差異，即產(chǎn)生許多HIV的亞型 。,.,38,HIV的亞型及分布,根據(jù)HIV gag和env區(qū)的基因序列，目前HIV-1可分為M、N和O三個(gè)進(jìn)化組，兩個(gè)進(jìn)化組之間序列的異質(zhì)性超過45%。依據(jù)env區(qū)序列，M組又可分為A-J 10個(gè)亞型，亞型之間序列的異質(zhì)性為30%。A和D亞型主要見于中非；B亞型見于北美、歐洲