信號(hào)通路研究思路

1、.為了證明一種藥物通過(guò)抑制P38表達(dá)發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的作用，需要以下內(nèi)容為了證明你的藥物通過(guò)抑制P38表達(dá)發(fā)揮了保護(hù)作用，首先要證明P38表達(dá)增加導(dǎo)致?lián)p傷。其次，證明你的藥有保護(hù)作用。另外，證明你的藥能抑制P38表達(dá)。最后，證明你的藥通過(guò)抑制P38表達(dá)發(fā)揮了保護(hù)作用。首先，證明P38表達(dá)增加會(huì)損傷。在這里需要建立損傷模型。 如介紹，如果鈣離子能引起P38mapk的上升，某些損傷能導(dǎo)致P38mapk的上升，則建立了損傷模型。 此時(shí)，如果對(duì)P38mapk進(jìn)行RNA干涉使表達(dá)降低，再次損傷刺激，此時(shí)不損傷刺激，可以說(shuō)P38mapk變高會(huì)導(dǎo)致?lián)p傷。這里最好不要用P38的抑制劑SB處理。 這是因?yàn)樵撘种苿┦?/p>

2、P38活性的抑制劑，不是表達(dá)量，而是抑制P38的磷酸化。如果說(shuō)明的問(wèn)題是p38磷酸化水平增加引起的損傷，建議使用抑制劑。 也可以使用Dominant-negative。 抑制劑實(shí)驗(yàn)證實(shí)該藥不影響P38表達(dá)，影響活性。 首先，應(yīng)該考慮抑制劑的選擇。 目前藥物的作用機(jī)制不是抑制靶的表達(dá)，而是抑制靶的激活。 如果將RNAi應(yīng)用于此，很有可能會(huì)錯(cuò)過(guò)這個(gè)機(jī)制，增加實(shí)驗(yàn)步驟。 (請(qǐng)參見(jiàn)。)其次，證明你的藥有保護(hù)作用。當(dāng)然，先用你的藥處理，然后再傷害刺激。 這個(gè)時(shí)候如果不傷害刺激的話，可以說(shuō)你的藥有保護(hù)作用吧。另外證明你的藥能抑制p28表達(dá)。用你的藥先處理后，傷害刺激，測(cè)定P38表達(dá)，如果給藥組對(duì)無(wú)給藥組P

3、38的表達(dá)下降，可以說(shuō)你的藥能抑制P38的表達(dá)。最后，證明你的藥通過(guò)抑制P38表達(dá)發(fā)揮了保護(hù)作用。這個(gè)步驟看起來(lái)不需要，其實(shí)是最重要的步驟，但國(guó)內(nèi)文章經(jīng)常忽略這個(gè)重要步驟。這里建議用RNA干擾p18表達(dá)，用你的藥物處理，進(jìn)行損傷刺激。 如果給藥組和給藥組的損傷程度一致的話，可以說(shuō)你的藥物是為了抑制p18表達(dá)而發(fā)揮了保護(hù)作用的。抑制劑也有限度，“致命”的情況，主要原因是抑制劑沒(méi)有特異性。 雖然說(shuō)是使用抑制劑時(shí)有什么特異的抑制劑，但是真的是特異的嗎？其實(shí)很多情況下，作者為了寫(xiě)文章夸大了抑制劑的特異性。 細(xì)胞內(nèi)的無(wú)數(shù)信號(hào)路徑?jīng)]有人能確保抑制劑作用于目標(biāo)分子時(shí)不影響其他的信號(hào)路徑。 其實(shí)無(wú)論是什么樣的

4、抑制劑，為什么對(duì)劑量的要求都相對(duì)嚴(yán)格？因?yàn)闈舛纫桓撸筒恢罆?huì)干擾其他哪個(gè)信號(hào)通路，經(jīng)常發(fā)生不清楚的現(xiàn)象。PI3K的抑制劑LY294002和wortmannin可以抑制PI3K相關(guān)的激酶，而LY294002的濃度達(dá)到200M，抑制DNA依存性的蛋白激酶(DNA-PK )； wortmannin常被用于抑制濃度超過(guò)3M時(shí)運(yùn)動(dòng)失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張基因突變(ATM )和DNA-PK。 相反，MEK1/2的抑制劑U0126和pd98989859、P38MAPK的抑制劑SB203580是好的。 因此，研究者一般使用LY294002時(shí)采用20M，使用wortmannin時(shí)采用0.2M，使其他效果最小化。 有

5、些學(xué)者將兩種抑制劑并用進(jìn)行了比較，難道不是也有考慮到這一點(diǎn)的原因嗎？但是，從嚴(yán)格的角度來(lái)說(shuō)特異性的話，RNAi也不能說(shuō)是絕對(duì)特異性的。 由于RNAi的機(jī)制還有很多尚未完全明確，所以只能說(shuō)特異性很高。 研究人員中RNAi處理后，在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用Western同時(shí)測(cè)定該蛋白質(zhì)所屬家族其他成員的表達(dá)量變化，測(cè)定其特異性和選擇性，表嚴(yán)格。 舉個(gè)例子吧。例如，對(duì)Survivin進(jìn)行RNAi后，最好同時(shí)檢測(cè)出XIAP、cIAP1/2等蛋白質(zhì)。 當(dāng)然，對(duì)基因的siRNA的構(gòu)建已經(jīng)成熟，如果以前人文章檢查的特異性為基礎(chǔ)，就應(yīng)該另論，所以要注意科研態(tài)度嚴(yán)格的lwjssry兄弟，如果siRNA序列沒(méi)有好的文獻(xiàn)應(yīng)用基礎(chǔ)

6、，也許就應(yīng)該考慮這個(gè)問(wèn)題。找到暫時(shí)訴說(shuō)相關(guān)內(nèi)容的06年的文獻(xiàn)，影響因素有3點(diǎn)多，把其內(nèi)容剪切下來(lái)作為lwjssry兄弟參考吧信號(hào)通路具有細(xì)胞特異性和條件特異性，即同一信號(hào)通路在不同細(xì)胞間或同一細(xì)胞在不同條件下的作用機(jī)制可能不同。細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路之間存在復(fù)雜的相互作用，真的很難證明哪個(gè)分子是別的分子。 本人最近研究了一個(gè)信號(hào)系統(tǒng)的兩個(gè)信號(hào)分子，a和b。 a在細(xì)胞質(zhì)里，b在細(xì)胞核里。 傳統(tǒng)的研究證明a是b的上游信號(hào)路徑之一。 我們的研究想證明在某個(gè)病理過(guò)程中a和b作為一個(gè)系統(tǒng)起作用。 我們首先應(yīng)用了提高這個(gè)系統(tǒng)的藥物干預(yù)，發(fā)現(xiàn)a上升的同時(shí)b也上升，這不能說(shuō)明任何問(wèn)題。 幸運(yùn)的是，因?yàn)閍分子現(xiàn)在具有

7、特異性的阻斷劑，所以阻斷了a分子的活性化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)b分子的活性化也受到了抑制。 由此初步推測(cè)a和b在某些病理過(guò)程中可能作為一個(gè)系統(tǒng)發(fā)揮作用。 但是，只能證明a是b的必要條件。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的原因有：某個(gè)機(jī)制起著什么樣的作用，該機(jī)制與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，有什么樣的關(guān)系，什么樣的原因引起了該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的表達(dá)，表達(dá)后的下游基因如何變化最好在中間出現(xiàn)基因，或與抑制劑和激動(dòng)劑有關(guān)，看看是否與上游下游的變化預(yù)期結(jié)果有關(guān)。 如果單純地進(jìn)行信號(hào)傳達(dá)沒(méi)有任何意義的話，就像前面所說(shuō)的那樣，信號(hào)的開(kāi)始/最終發(fā)揮作用！“真的很難證明哪個(gè)分子是其他分子的滿足條件”。 最近正在進(jìn)行證明a作用于b的實(shí)驗(yàn)。 首先用外來(lái)物處理細(xì)胞，通過(guò)we

8、tern blot，a和b都增加，b的量在a后增加。 因此，用抑制劑抑制a，用siRNA進(jìn)行A knockdown，b的表達(dá)量也下降了。 但是，這只能證明a和b是相關(guān)的，不能證明a是直接作用于b還是間接作用。 b的變化是a信號(hào)knockdown引起的，還是a信號(hào)knockdown以后的，細(xì)胞可以為了補(bǔ)償這個(gè)信號(hào)的不足而補(bǔ)充促進(jìn)c信號(hào)，c信號(hào)可以改變b信號(hào)。 最近，我在考慮用Co-IP證明a和b結(jié)合，也許可以證明a和b的直接關(guān)系。研究分子間在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的滿足條件與研究數(shù)學(xué)中的滿足條件不同，細(xì)胞中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上往往存在反饋機(jī)制。 即使x是上游信號(hào)，y是下游信號(hào)，如果改變y信號(hào)，則x信號(hào)也會(huì)由于反

9、饋機(jī)構(gòu)而改變。 因此，考慮到生物體內(nèi)的信號(hào)分子間的充分條件，就變得復(fù)雜，需要慎重且慎重地得出結(jié)論。信號(hào)分子的循環(huán)效應(yīng)普遍存在個(gè)人認(rèn)為，研究a分子和某個(gè)信號(hào)途徑，更具體地說(shuō)，得分應(yīng)該成為兩種情況1 .以前不知道a分子是該信號(hào)路徑的成分，但在這種情況下，必須證明a分子是該信號(hào)路徑的成分。 此時(shí)的研究是上述的研究?jī)?nèi)容。2、已知a分子是信號(hào)路徑的成分，但現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)一種現(xiàn)象與該路徑有關(guān)，現(xiàn)在必須證明a分子是參與該信號(hào)路徑的重要分子。 1“創(chuàng)造信號(hào)路徑”，別人沒(méi)有研究過(guò)a和b的相互作用，但被發(fā)現(xiàn)，證明了它是創(chuàng)造。 準(zhǔn)確地說(shuō)應(yīng)該是“發(fā)現(xiàn)”。 因?yàn)樾盘?hào)路徑是客觀存在的，所以只是被發(fā)現(xiàn)了，用“創(chuàng)造”這個(gè)詞來(lái)比較形

10、象。 這種研究獨(dú)創(chuàng)、困難，在研究時(shí)經(jīng)常用免疫共沉淀法建立一堆與某個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)合的蛋白質(zhì)，通過(guò)質(zhì)量分析進(jìn)行鑒定，進(jìn)一步證明兩者的相互作用，有助于充分證明必要條件。 單純地進(jìn)行這樣的研究沒(méi)有目的性和研究的意義，所以通?；谝环N現(xiàn)象，說(shuō)明作為自己“創(chuàng)造”的信號(hào)途徑的現(xiàn)象，也就是以下所述的第二模式。2“利用信號(hào)通路”利用別人或自己“創(chuàng)造”的信號(hào)通路來(lái)說(shuō)明某些特定現(xiàn)象，如某些藥物、某些毒物、壓力、某些放射線等，在這些刺激下，特定的信號(hào)通路對(duì)某些細(xì)胞發(fā)揮控制作用。在第一類中，在充分必要的條件下證實(shí)a分子和b分子的作用。在第二類中，在充分必要的條件下證實(shí)a現(xiàn)象與b信號(hào)路徑的關(guān)系?？次墨I(xiàn)是最基礎(chǔ)的訓(xùn)練，看文獻(xiàn)，

11、一是看構(gòu)想，二是學(xué)習(xí)技術(shù)和邏輯思考。 想法告訴我們?yōu)槭裁匆觯夹g(shù)和邏輯思考告訴我們?cè)趺醋?。表達(dá)a基因后，b基因的mRNA水平明顯增加，對(duì)應(yīng)b的蛋白水平也明顯增加，干擾a基因的表達(dá)時(shí)，b基因的mRNA水平明顯降低，對(duì)應(yīng)b的蛋白水平也明顯降低。 投稿、拒絕投稿，主要原因是審查者建議，應(yīng)該明確a如何控制b的表現(xiàn)。 老師，a控制b可能是什么方法？需要什么實(shí)驗(yàn)？a和b是脂質(zhì)代謝中的酶基因，在細(xì)胞質(zhì)和核內(nèi)表達(dá)?；卮穑?、下一步要弄清b基因mRNA變化的原因是什么，在轉(zhuǎn)錄水平上影響了RNA的穩(wěn)定性。2、假設(shè)a和b直接相關(guān)(假設(shè)a影響b的轉(zhuǎn)錄)，一般要進(jìn)行兩個(gè)實(shí)驗(yàn)： Luciferase reporter

12、assay和CHIP assay？ 可以只做一個(gè)CHIP實(shí)驗(yàn)嗎？其中l(wèi)uciferaserendererassay是為了驗(yàn)證a蛋白是否能與b基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合嗎？ a蛋白如果不是轉(zhuǎn)錄因子就不能與b基因的Promoter區(qū)域結(jié)合嗎？ 另外，如何知道a蛋白是轉(zhuǎn)錄因子？ 回答這個(gè)問(wèn)題：但是，如果找?guī)灼狫BC上的文章的話，JBC上這種語(yǔ)調(diào)的文章很多，精讀35篇，弄清其大綱，你就有自信了。 打開(kāi)jbc網(wǎng)站，啊，每年都有Gene Regulation板。 根據(jù)JBC的報(bào)道，a控制了b基因，很多是通過(guò)第三方，例如轉(zhuǎn)錄因子來(lái)實(shí)現(xiàn)的。 我以前重新推出自己的Real-time PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了a基因，轉(zhuǎn)錄因子c的mRNA水平顯著增加，干擾了a基因的表達(dá)，轉(zhuǎn)錄因子c的mRNA水平顯著降低。 目前，這種現(xiàn)象還沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道。 后期，將通過(guò)Luciferase reporter assay和CHIP assay驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子c是否與b基因起作用。 我想問(wèn)的問(wèn)題是，除了a基因控制轉(zhuǎn)錄因子c，前期的實(shí)時(shí)PCR實(shí)驗(yàn)(當(dāng)然還需要追加一個(gè)Western Blot實(shí)驗(yàn))以外，還有其他實(shí)驗(yàn)。讀者需要知道a基因如何控制轉(zhuǎn)錄因子c 簡(jiǎn)單： a基因通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子c控制基因b，兩個(gè)階段都表明a影響c，c影響b嗎？ 看了你的目標(biāo)雜志，如果是JBC這樣的偏頗的機(jī)制，你會(huì)說(shuō)清楚的3、a影響b的mR