信號通路研究思路

1、.為了證明一種藥物通過抑制P38表達發(fā)揮保護細胞的作用，需要以下內(nèi)容為了證明你的藥物通過抑制P38表達發(fā)揮了保護作用，首先要證明P38表達增加導致?lián)p傷。其次，證明你的藥有保護作用。另外，證明你的藥能抑制P38表達。最后，證明你的藥通過抑制P38表達發(fā)揮了保護作用。首先，證明P38表達增加會損傷。在這里需要建立損傷模型。 如介紹，如果鈣離子能引起P38mapk的上升，某些損傷能導致P38mapk的上升，則建立了損傷模型。 此時，如果對P38mapk進行RNA干涉使表達降低，再次損傷刺激，此時不損傷刺激，可以說P38mapk變高會導致?lián)p傷。這里最好不要用P38的抑制劑SB處理。 這是因為該抑制劑是

2、P38活性的抑制劑，不是表達量，而是抑制P38的磷酸化。如果說明的問題是p38磷酸化水平增加引起的損傷，建議使用抑制劑。 也可以使用Dominant-negative。 抑制劑實驗證實該藥不影響P38表達，影響活性。 首先，應該考慮抑制劑的選擇。 目前藥物的作用機制不是抑制靶的表達，而是抑制靶的激活。 如果將RNAi應用于此，很有可能會錯過這個機制，增加實驗步驟。 (請參見。)其次，證明你的藥有保護作用。當然，先用你的藥處理，然后再傷害刺激。 這個時候如果不傷害刺激的話，可以說你的藥有保護作用吧。另外證明你的藥能抑制p28表達。用你的藥先處理后，傷害刺激，測定P38表達，如果給藥組對無給藥組P

3、38的表達下降，可以說你的藥能抑制P38的表達。最后，證明你的藥通過抑制P38表達發(fā)揮了保護作用。這個步驟看起來不需要，其實是最重要的步驟，但國內(nèi)文章經(jīng)常忽略這個重要步驟。這里建議用RNA干擾p18表達，用你的藥物處理，進行損傷刺激。 如果給藥組和給藥組的損傷程度一致的話，可以說你的藥物是為了抑制p18表達而發(fā)揮了保護作用的。抑制劑也有限度，“致命”的情況，主要原因是抑制劑沒有特異性。 雖然說是使用抑制劑時有什么特異的抑制劑，但是真的是特異的嗎？其實很多情況下，作者為了寫文章夸大了抑制劑的特異性。 細胞內(nèi)的無數(shù)信號路徑?jīng)]有人能確保抑制劑作用于目標分子時不影響其他的信號路徑。 其實無論是什么樣的

4、抑制劑，為什么對劑量的要求都相對嚴格？因為濃度一高，就不知道會干擾其他哪個信號通路，經(jīng)常發(fā)生不清楚的現(xiàn)象。PI3K的抑制劑LY294002和wortmannin可以抑制PI3K相關(guān)的激酶，而LY294002的濃度達到200M，抑制DNA依存性的蛋白激酶(DNA-PK )； wortmannin常被用于抑制濃度超過3M時運動失調(diào)性毛細血管擴張基因突變(ATM )和DNA-PK。 相反，MEK1/2的抑制劑U0126和pd98989859、P38MAPK的抑制劑SB203580是好的。 因此，研究者一般使用LY294002時采用20M，使用wortmannin時采用0.2M，使其他效果最小化。 有

5、些學者將兩種抑制劑并用進行了比較，難道不是也有考慮到這一點的原因嗎？但是，從嚴格的角度來說特異性的話，RNAi也不能說是絕對特異性的。 由于RNAi的機制還有很多尚未完全明確，所以只能說特異性很高。 研究人員中RNAi處理后，在實驗中應用Western同時測定該蛋白質(zhì)所屬家族其他成員的表達量變化，測定其特異性和選擇性，表嚴格。 舉個例子吧。例如，對Survivin進行RNAi后，最好同時檢測出XIAP、cIAP1/2等蛋白質(zhì)。 當然，對基因的siRNA的構(gòu)建已經(jīng)成熟，如果以前人文章檢查的特異性為基礎(chǔ)，就應該另論，所以要注意科研態(tài)度嚴格的lwjssry兄弟，如果siRNA序列沒有好的文獻應用基礎(chǔ)

6、，也許就應該考慮這個問題。找到暫時訴說相關(guān)內(nèi)容的06年的文獻，影響因素有3點多，把其內(nèi)容剪切下來作為lwjssry兄弟參考吧信號通路具有細胞特異性和條件特異性，即同一信號通路在不同細胞間或同一細胞在不同條件下的作用機制可能不同。細胞內(nèi)的信號通路之間存在復雜的相互作用，真的很難證明哪個分子是別的分子。 本人最近研究了一個信號系統(tǒng)的兩個信號分子，a和b。 a在細胞質(zhì)里，b在細胞核里。 傳統(tǒng)的研究證明a是b的上游信號路徑之一。 我們的研究想證明在某個病理過程中a和b作為一個系統(tǒng)起作用。 我們首先應用了提高這個系統(tǒng)的藥物干預，發(fā)現(xiàn)a上升的同時b也上升，這不能說明任何問題。 幸運的是，因為a分子現(xiàn)在具有

7、特異性的阻斷劑，所以阻斷了a分子的活性化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)b分子的活性化也受到了抑制。 由此初步推測a和b在某些病理過程中可能作為一個系統(tǒng)發(fā)揮作用。 但是，只能證明a是b的必要條件。信號轉(zhuǎn)導的原因有：某個機制起著什么樣的作用，該機制與信號轉(zhuǎn)導有關(guān)，有什么樣的關(guān)系，什么樣的原因引起了該信號轉(zhuǎn)導的表達，表達后的下游基因如何變化最好在中間出現(xiàn)基因，或與抑制劑和激動劑有關(guān)，看看是否與上游下游的變化預期結(jié)果有關(guān)。 如果單純地進行信號傳達沒有任何意義的話，就像前面所說的那樣，信號的開始/最終發(fā)揮作用！“真的很難證明哪個分子是其他分子的滿足條件”。 最近正在進行證明a作用于b的實驗。 首先用外來物處理細胞，通過we

8、tern blot，a和b都增加，b的量在a后增加。 因此，用抑制劑抑制a，用siRNA進行A knockdown，b的表達量也下降了。 但是，這只能證明a和b是相關(guān)的，不能證明a是直接作用于b還是間接作用。 b的變化是a信號knockdown引起的，還是a信號knockdown以后的，細胞可以為了補償這個信號的不足而補充促進c信號，c信號可以改變b信號。 最近，我在考慮用Co-IP證明a和b結(jié)合，也許可以證明a和b的直接關(guān)系。研究分子間在信號轉(zhuǎn)導中的滿足條件與研究數(shù)學中的滿足條件不同，細胞中的信號轉(zhuǎn)導通路上往往存在反饋機制。 即使x是上游信號，y是下游信號，如果改變y信號，則x信號也會由于反

9、饋機構(gòu)而改變。 因此，考慮到生物體內(nèi)的信號分子間的充分條件，就變得復雜，需要慎重且慎重地得出結(jié)論。信號分子的循環(huán)效應普遍存在個人認為，研究a分子和某個信號途徑，更具體地說，得分應該成為兩種情況1 .以前不知道a分子是該信號路徑的成分，但在這種情況下，必須證明a分子是該信號路徑的成分。 此時的研究是上述的研究內(nèi)容。2、已知a分子是信號路徑的成分，但現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)一種現(xiàn)象與該路徑有關(guān)，現(xiàn)在必須證明a分子是參與該信號路徑的重要分子。 1“創(chuàng)造信號路徑”，別人沒有研究過a和b的相互作用，但被發(fā)現(xiàn)，證明了它是創(chuàng)造。 準確地說應該是“發(fā)現(xiàn)”。 因為信號路徑是客觀存在的，所以只是被發(fā)現(xiàn)了，用“創(chuàng)造”這個詞來比較形

10、象。 這種研究獨創(chuàng)、困難，在研究時經(jīng)常用免疫共沉淀法建立一堆與某個蛋白質(zhì)結(jié)合的蛋白質(zhì)，通過質(zhì)量分析進行鑒定，進一步證明兩者的相互作用，有助于充分證明必要條件。 單純地進行這樣的研究沒有目的性和研究的意義，所以通常基于一種現(xiàn)象，說明作為自己“創(chuàng)造”的信號途徑的現(xiàn)象，也就是以下所述的第二模式。2“利用信號通路”利用別人或自己“創(chuàng)造”的信號通路來說明某些特定現(xiàn)象，如某些藥物、某些毒物、壓力、某些放射線等，在這些刺激下，特定的信號通路對某些細胞發(fā)揮控制作用。在第一類中，在充分必要的條件下證實a分子和b分子的作用。在第二類中，在充分必要的條件下證實a現(xiàn)象與b信號路徑的關(guān)系。看文獻是最基礎(chǔ)的訓練，看文獻，

11、一是看構(gòu)想，二是學習技術(shù)和邏輯思考。 想法告訴我們?yōu)槭裁匆?，技術(shù)和邏輯思考告訴我們怎么做。表達a基因后，b基因的mRNA水平明顯增加，對應b的蛋白水平也明顯增加，干擾a基因的表達時，b基因的mRNA水平明顯降低，對應b的蛋白水平也明顯降低。 投稿、拒絕投稿，主要原因是審查者建議，應該明確a如何控制b的表現(xiàn)。 老師，a控制b可能是什么方法？需要什么實驗？a和b是脂質(zhì)代謝中的酶基因，在細胞質(zhì)和核內(nèi)表達?；卮穑?、下一步要弄清b基因mRNA變化的原因是什么，在轉(zhuǎn)錄水平上影響了RNA的穩(wěn)定性。2、假設(shè)a和b直接相關(guān)(假設(shè)a影響b的轉(zhuǎn)錄)，一般要進行兩個實驗： Luciferase reporter

12、assay和CHIP assay？ 可以只做一個CHIP實驗嗎？其中l(wèi)uciferaserendererassay是為了驗證a蛋白是否能與b基因的啟動子區(qū)域結(jié)合嗎？ a蛋白如果不是轉(zhuǎn)錄因子就不能與b基因的Promoter區(qū)域結(jié)合嗎？ 另外，如何知道a蛋白是轉(zhuǎn)錄因子？ 回答這個問題：但是，如果找?guī)灼狫BC上的文章的話，JBC上這種語調(diào)的文章很多，精讀35篇，弄清其大綱，你就有自信了。 打開jbc網(wǎng)站，啊，每年都有Gene Regulation板。 根據(jù)JBC的報道，a控制了b基因，很多是通過第三方，例如轉(zhuǎn)錄因子來實現(xiàn)的。 我以前重新推出自己的Real-time PCR實驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了a基因，轉(zhuǎn)錄因子c的mRNA水平顯著增加，干擾了a基因的表達，轉(zhuǎn)錄因子c的mRNA水平顯著降低。 目前，這種現(xiàn)象還沒有文獻報道。 后期，將通過Luciferase reporter assay和CHIP assay驗證轉(zhuǎn)錄因子c是否與b基因起作用。 我想問的問題是，除了a基因控制轉(zhuǎn)錄因子c，前期的實時PCR實驗(當然還需要追加一個Western Blot實驗)以外，還有其他實驗。讀者需要知道a基因如何控制轉(zhuǎn)錄因子c 簡單： a基因通過轉(zhuǎn)錄因子c控制基因b，兩個階段都表明a影響c，c影響b嗎？ 看了你的目標雜志，如果是JBC這樣的偏頗的機制，你會說清楚的3、a影響b的mR