CAD電霧式檢測器應(yīng)用文集

1、CAD電霧式檢測器 應(yīng)用文集 中藥及天然產(chǎn)物 化藥 生化藥物 藥用輔料 食品與化工 其他 前 言 液相色譜儀常用檢測器主要分為選擇性檢測器和通用型檢測器，其中選擇性檢測器包括紫外 / 可見光吸 收檢測器（UVD）、二極管陣列檢測器（DAD）、熒光檢測器（FLD）等，通用型檢測器主要指示差折光檢 測器（RI）、蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）、質(zhì)譜檢測器（MS）等。紫外吸收檢測器是目前液相色譜儀中應(yīng) 用最廣泛的檢測器，它靈敏度高，線性范圍寬，但要求被檢測樣品組分有紫外吸收或衍生后有紫外吸收，屬 于選擇性檢測器；二極管陣列檢測器是紫外檢測器的一個分支，是一種光學(xué)多通道檢測器，它可以對每個洗 脫組分進行

2、光譜掃描，經(jīng)計算機處理后，得到光譜和色譜結(jié)合的三維圖譜；熒光檢測器同樣屬于選擇性檢測 器，其靈敏度在目前常用液相色譜儀檢測器中是最高的，但要求目標化合物受激發(fā)光作用后，能產(chǎn)生發(fā)射光， 主要適用于能激發(fā)熒光的化合物或衍生后能激發(fā)熒光的化合物。通用型檢測器中，示差折光檢測器是一種早 期的測定無生色基團化合物的檢測器，只要被測組分與洗脫液的折光指數(shù)有差別就可使用，其靈敏度較低， 對溫度變化敏感，并與梯度洗脫不相容；蒸發(fā)光散射檢測器，是 20 世紀 80 年代才研發(fā)生產(chǎn)出來的，主要用 于檢測揮發(fā)性低于流動相的樣品，而不需要樣品含有發(fā)色基團，它的響應(yīng)值與樣品的質(zhì)量成正比，靈敏度比 示差折光檢測器高，對溫

3、度變化不敏感，基線穩(wěn)定，可用于梯度洗脫，但由于靈敏度和重現(xiàn)性差，使得其應(yīng) 用受到影響；質(zhì)譜檢測器是另一種通用型檢測器，在靈敏度、選擇性、通用性及化合物的分子量和結(jié)構(gòu)信息 的提供等方面都有突出的優(yōu)點，但它的昂貴操作費用和復(fù)雜性限制了它的推廣應(yīng)用。 近年來，一款新型的檢測器 - 電霧式檢測器（CAD）在液相色譜分析中得到了較好的應(yīng)用，它屬于通用 型檢測器，是一種新型原理的、高靈敏度、重現(xiàn)性較好的檢測器，它基于霧化檢測器的原理，洗脫液經(jīng)霧化 后形成顆粒，經(jīng)過漂移管干燥后與帶電氮氣碰撞，使得目標化合物帶上正電荷，最后，通過靜電計測量電荷 的量，該測量值與目標化合物的質(zhì)量成一定比例關(guān)系。電霧式檢測器基于

4、獨特的新型設(shè)計原理，解決了其他 檢測器設(shè)計與原理上的一些局限性，它的檢測技術(shù)完全不依賴于化合物的分子結(jié)構(gòu)，達到了通用性目的，能 對大多數(shù)化合物提供一致響應(yīng)性，同時能達到較高的靈敏度和低檢測極限，很容易檢測到納克數(shù)量級的化合 物，并且與液相色譜分離系統(tǒng)聯(lián)用，其重現(xiàn)性、穩(wěn)定性很好，因此能準確的用于定量分析或半定量分析，能 檢測到大部分非揮發(fā)性和半揮發(fā)性的有機物。該電霧式檢測器自 2004 年 10 月一經(jīng)推出，就相繼獲得了儀器 行業(yè)的最高榮譽， 獲2005年P(guān)ITTCON “撰稿人” 銀獎和素有 “發(fā)明領(lǐng)域的諾貝爾獎” 2005年 “R 1217(26):4347-54. 4 Ping Sun,

5、Xiande Wang. Lori Alquier, etc,. Determination of relative response factors of impurities in paclitaxel with high performance liquid chromatography equipped with ultraviolet and charged aerosol detectors Maryanoff Journal of Chromatography A, 2008, 1177(1):87-91. 5 M. Pistorino, B.A. Pfeifer, Anal.

6、Bioanal. Chem. 390 (2008)，1189. 6 Christopher Crafts, Bruce Bailey, Marc Plante. Use of Charged Aerosol Detection as an Orthogonal Quantification Technique for Drug Metabolites in Safety Testing (MIST), webdocs/110510-PO-HPLC-Drug-Metabolites-21Nov2011-LPN2953-01.pdf 7 高維 , 方平飛 , 李煥 , 等 . HPLC-CAD 法

7、測定鹽酸乙胺丁醇片中鹽酸乙胺丁醇的含量，中南藥學(xué)， 2009, 5: 338- 340. 8 PETER W, STEFAN W, LESLIE A. HPLC Determinations of Enantiomeric Ratios, CHIRALITY 19:59 (2007). 9 Christopher Crafts, Bruce Bailey, Marc Plante, etc,. Evaluation of Methods for the Simultaneous Analysis of Cations and Anions Using HPLC with Charged Aer

8、osol Detection and a Zwitterionic Stationary Phase, Journal of Chromatographic Science, Volume 47, Number 7 August 2009, 534-539. 10 Brian Forsatz, Nicholas H. HPLC with Charged Aerosol Detection for Pharmaceutical Cleaning Validation, LCGC North America, September 2007. 11 T.J. Ward, R.F. Hamilton

9、Jr., R.W. Dixon, M. Paulsen, C.D. Simpson, Atmos. Environ.40 (2006) 7005. 12 Shinsuke Inagaki, Jun Zhe Min, Toshimasa Toyooka. Direct detection method of oligosaccharides by high- performance liquid chromatography with charged aerosol detection，Biomed. Chromatogr. 21: 338342 (2007). 13 Roy W. Dixon

10、W, Gregor B,. Determination of levoglucosan in atmospheric aerosols using high performance liquid chromatography with aerosol charge detection，Journal of Chromatography A, 1109 (2006) 214221. 14 Dawen Kou, Gerald Maniusa, Shangdong Zhana. Size exclusion chromatography with Corona charged aerosol det

11、ector for the analysis of polyethylene glycol polymer.Journal of Chromatography A, Volume 1216, Issue 28, 10 July 2009, Pages 5424-5428. 15 Kayori Takahashi, Shinichi Kinugasa, Masaaki Senda, etc. Quantitative comparison of a corona-charged 應(yīng)用文集 9 aerosol detector and an evaporative light-scattering

12、 detector for the analysis of a synthetic polymer by supercritical fl uid chromatography, Journal of Chromatography A, Volume 1193, Issues 1-2, 6 June 2008, Pages 151-155. 16 Tanja Vehovec, Ales Obreza. Review of operating principle and applications of the charged aerosol detector, Journal of Chroma

13、tography A, 1217 (2010) 15491556. 17 曹海龍 , 朱豫 , 李曙光 , 等 . 高效液相色譜法 - 電霧式檢測器測定釀酒酵母發(fā)酵液中甘油的含量，分 析儀器，2009, 12(1): 27- 29. 10 第二章 電霧式檢測器（CAD）與 CP、BP、USP 相關(guān)的 分析方法 應(yīng)用文集 11 2.1 銀杏制劑中銀杏內(nèi)酯的測定 方法簡介： 銀杏內(nèi)酯化合物屬于萜類化合物，由倍半萜內(nèi)酯和二萜內(nèi)酯組成，是銀杏葉中一類重要的活性成分。對 于銀杏內(nèi)酯的分析，因其紫外吸收弱，多采用 HPLC-ELSD 方法（見圖 3）。中國藥典 2010 版方法中流動相 采用非常規(guī)溶劑正丙

14、醇-四氫呋喃-水， 但正丙醇的沸點接近100， 揮發(fā)性差， 容易導(dǎo)致CAD檢測器噪音增加。 本實驗改進了此方法，采用HPLC-CAD方法，流動相是常規(guī)反相色譜溶劑甲醇和水，改善了上述缺點（圖4）。 分析條件： 分析柱：Acclaim 120 C18，5m 4.6150mm (P/N: 059148) 柱溫：35 CAD 檢測條件：霧化溫度：35 流動相：A：甲醇；B：水，梯度條件見表 1 流速：0.8 mL/min 表 1 改進后的梯度條件 時間 (min) A(%)B(%） 02773 103070 153565 223565 圖 3 采用藥典流動相銀杏內(nèi)酯 ELSD 色譜圖（5L）圖 4

15、采用甲醇 - 水流動相銀杏內(nèi)酯在 CAD 檢測器上 色譜圖（1L） 表 2 CAD 與 ELSD 檢測銀杏內(nèi)酯靈敏度比較 檢測器峰名信噪比（S/N）檢測器峰名信噪比（S/N） CAD銀杏內(nèi)酯 C864.1ELSD銀杏內(nèi)酯 C111.2 白果內(nèi)酯448.0白果內(nèi)酯191.7 銀杏內(nèi)酯 A767.5銀杏內(nèi)酯 A166.9 銀杏內(nèi)酯 B694.8銀杏內(nèi)酯 B96.1 方法結(jié)論： 本試驗優(yōu)化了中國藥典 2010 版中測定銀杏制劑中銀杏內(nèi)酯含量色譜條件，并采用 CAD 測定了其含量， 可獲得比 ELSD 檢測器更好的靈敏度、重現(xiàn)性，并且降低了銀杏內(nèi)酯對照品的需求量，大大降低銀杏制劑中 測定色譜條件的復(fù)雜

16、性， 提高了方法的適用性， 降低了檢測成本。 在信噪比方面， 相同濃度標準進樣相同體積， 分別在 CAD 檢測器和 ELSD 檢測器上比較，結(jié)果顯示，CAD 檢測的靈敏度至少比 ELSD 高 2 倍（見表 2）。 因此，對于藥品中雜質(zhì)檢測，CAD 檢測可獲得更好的靈敏度。 參考文獻來源：2012-APP-RLC-035- 液相色譜 - 電噴霧檢測器測定銀杏制劑中銀杏內(nèi)酯（內(nèi)部資料） 0.05.010.015.020.025.030.035.038.0 -5.0 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 45.0 對照品 1 mV min 銀杏內(nèi)酯C 白果內(nèi)酯 銀杏內(nèi)酯A 銀杏內(nèi)酯B 0.

17、02.04.06.08.010.012.014.016.018.020.022.025.0 -2.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 STD_1.0 pA min 銀杏內(nèi)酯C 白果內(nèi)酯 銀杏內(nèi)酯A 銀杏內(nèi)酯B 12 0.874 1.244 3.278 pA 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 分鐘 0.001.002.003.004.005.006.007.008.00 馬度米星銨 0.874 1.244 3.278 pA 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.0

18、0 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 分鐘 0.001.002.003.004.005.006.007.008.00 pA -0.20 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 分鐘 0.001.002.003.004.005.006.007.008.00 馬度米星銨 2.2 快速液相色譜結(jié)合 CAD 檢測器測定獸藥中的馬度米星銨 方法簡介： 中國獸藥典2010 版采用高效液相色譜 - 蒸發(fā)光散射檢測器 (HPLC-ELSD)，甲醇 -0. 02 mol/L 醋酸銨 溶液為流動相，常規(guī) C18 色譜柱

19、對馬度米星銨進行測定。本實驗采用 UPLC-CAD 檢測器對馬度米星銨進行 測定，實驗結(jié)果表明馬度米星銨在 CAD 檢測器上有較好的響應(yīng)，進樣精密度、穩(wěn)定性都較好，其中靈敏度 和穩(wěn)定性較獸藥典中蒸發(fā)光散射檢測器方法相比具有明顯優(yōu)勢， 同時分析時間大大縮短。 并且CAD操作簡單， 設(shè)置參數(shù)少，穩(wěn)定性較好，受環(huán)境影響因素少。該檢測器完全可以滿足馬度米星銨的測定。 分析條件： 分析柱：Waters BEH C18, 1.7m 2.1100mm 柱溫：30 進樣量：3L CAD 檢測條件：氮氣壓力 35.0psi 流動相：甲醇 - 0.02 mol/L 醋酸銨（85:15） 流速：0.3mL/min

20、參考文獻來源：2012-APP-RLC-006- HPLC-CAD 法檢測馬度米星銨（內(nèi)部資料） 2.3 膽汁（豬、羊、牛）中膽汁酸的 CAD 表征與膽汁酸差異性比較分析 方法簡介： 本方法采用 CAD 檢測器，以膽汁水解后常見的六種膽汁酸成分，運用 HPLC 方法分析了豬膽粉、羊膽 圖 5 樣品測定譜圖圖 6 檢出限測定譜圖（濃度 10ppm，進樣 2L，s/n 6.94） 粉與牛膽粉的差別，中國藥典 2010 版方法中為紫外 192nm 測定，為末端吸收，靈敏度低，雜質(zhì)對主成分 干擾較大。采用 CAD 檢測分離度和靈敏度均較高，為 豬膽粉的質(zhì)量控制、膽粉的來源鑒別提供了一種有效 的方法。

21、分析柱：Acclaim Surfactant, 5um 4.6150mm 柱溫：35 電霧式檢測器（CAD） ：型號：Corona Ultra 霧化溫度：35，采集頻率：5Hz 進樣量：5L 流動相及梯度條件見表 3，標準品測定譜圖見圖 7 表 3 流動相及梯度條件 時間 (min) CH3CN (%) 0.5%HAc (%) 流速 （mL/min） 045550.9 2745550.9 27.190100.9 3590100.9 35.145550.9 4545550.9 應(yīng)用文集 13 結(jié)果參考： 動物膽粉中含有的膽汁酸都不具有紫外吸收的生色團，因此只能在低波長檢測。低波長檢測的缺點是干

22、擾大、噪音高、漂移嚴重，這類化合物的檢測恰恰是 CAD 這類質(zhì)量型檢測器的優(yōu)勢。因此選擇 CAD 檢測器 進行檢測可以獲得比紫外檢測器更好的靈敏度（如圖 7）。 將樣品注入液相色譜儀，以比較各種來源膽粉之間膽汁酸的差異（圖 8）。 方法結(jié)論： 本方法采用CAD檢測器能夠?qū)δ懼岢煞秩〉渺`敏度較高的檢測， 與紫外檢測器相比有較明顯的優(yōu)勢。 本方法所采用的 Acclaim Surfactant 色譜柱是一種硅膠基質(zhì)的帶有專利鍵合相的色譜柱，在相同條件下分析酸 性物質(zhì)可取得比常規(guī) C18 更佳的分離與峰形。 參考文獻來源：2012-APP-RLC-023 膽汁（豬、羊、牛）中膽汁酸的 CAD 特征的

23、表征與膽汁酸差異 性比較分析（LC-CAD）（The CAD instrument is for trial purposes to asses its suitability for routine use in USP laboratories.） 2.4 藥用輔料中脂肪酸分析 方法簡介： 混合脂肪酸是一種常見藥用輔料，作為栓劑等制劑的載體，其應(yīng)用符合醫(yī)藥“低毒、高效”的基本發(fā)展 原則和民眾醫(yī)療保健的意愿，近年來發(fā)展較快。脂肪酸紫外吸收弱，用傳統(tǒng) UV 方法無法檢測，本實驗采用 HPLC-CAD 方法檢測輔料中的常見脂肪酸取得了較好的分析結(jié)果。 分析條件： 色譜柱：PRP-1,7m 4.1

24、250mm (Hamilton) 流動相：乙腈 - 四氫呋喃 -60mM 醋酸溶液 =60:5:35, 15min 內(nèi)變化到 90:10:0 流速：1.0mL/min 柱溫：45 進樣量：25L 電霧式檢測器（CAD）：型號：Corona Ultra；霧化溫度：15 圖 7 六種膽汁酸 UV 與 CAD 檢測比較圖 （1、UV210nm 色譜圖；2、CAD 色譜圖） 圖 8 不同來源膽粉色譜圖 （1 對照品；2 豬膽粉；3 羊膽粉；4 牛膽粉） 0.02.55.07.510.012.515.017.520.022.525.0 27.0 -20 50 100 150 200 膽酸混標 CAD_1

25、 UV_VIS_1 mAU min 2 1 WVL:210 nm 0.02.55.07.510.012.515.017.520.022.525.027.0 -20 50 100 150 220 膽酸混標 Sample_ 豬膽水解 Sample_ 羊膽水解 Sample_ 牛膽水解 pA min 4 3 2 1 1 2 3 4 5 6 7 STD_ STD_膽酸混標 STD_膽酸混標 2 1 1 2 3 4 14 結(jié)果參考： 圖 9 輔料中脂肪酸分析圖譜 表 4 輔料中脂肪酸分析結(jié)果 供試品中組分名稱 保留時間 min 峰面積 pA*min 塔板數(shù) Plates 分離度 Resolution 拖

26、尾因子 USP Tf 月桂酸Lauric Acid6.4630.886130708.111.11 肉豆蔻酸Myristic Acid8.50010.771151536.861.06 棕櫚酸Plasmatic Acid10.59722.388159891.811.09 油酸Oleatic Acid11.21322.478167943.911.07 硬脂酸Stearic Acid12.54320.81822488n.a.1.05 方法結(jié)論： 本方法使用 CAD 檢測器結(jié)合 Hamilton 的一款色譜柱，對多種脂肪酸同時進行分析，分離度高，色譜峰 形好，有較高實用價值。 參考文獻來源： 2013-

27、APP-LC-039 CAD 檢測器分析藥用輔料中的脂肪酸（The CAD instrument is for trial purposes to asses its suitability for routine use in USP laboratories.） 0.0 -2.0 0 20 CurrentpA 40 60 80 100 120 2.55.07.5 Lauric Acid Myristic Acid Plasmatic Acid Oleatic Acid Stearic Acid CAD_1 10.012.5 時間min 15.017.520.022.525.0 應(yīng)用文集 1

28、5 第三章 電霧式檢測器（CAD）應(yīng)用實例介紹 16 第一節(jié) CAD 在中藥及天然產(chǎn)物分析中的應(yīng)用 3.1.1 三七藥材液相色譜指紋圖譜的建立 方法簡介： 指紋圖譜對中藥的質(zhì)量控制具有整體性、客觀性的特點。目前對三七藥材及其制劑的指紋圖譜研究已有 大量的報道，方法大多為 HPLC-UV，少數(shù)為 HPLC-ELSD。UV 檢測器適用于有紫外吸收的化合物的檢測， 但對皂苷等只有末端吸收的化合物的檢測不理想，并且在梯度洗脫時容易造成基線漂移。雖然 ELSD 對皂苷、 糖等化合物的檢測靈敏度高于 UV，但對低含量成分檢測時重復(fù)性較差。本文利用 HPLC 電霧式檢測器聯(lián)用 技術(shù)，建立了三七藥材指紋圖譜的

29、簡單、可靠的分析方法。 分析條件： 分析柱：Agilent Zorbax Eclipse XDB C18, 5 m 4.6250 mm 柱溫：30 CAD 檢測條件： 氮氣壓力 35.0psi；輸出范圍：100pA 流動相：A：水；B：乙腈；梯度條件見表 5 進樣量：10 L 流速 1.0 mL/min 結(jié)果參考： 1）檢測器比較 在同一色譜條件下 , 比較了 UV、ELSD 和 CAD 三種檢 測器，從檢測限和定量限的比較結(jié)果（表 6）可知，CAD 檢 表 5 梯度條件 時間乙腈 % 019 4019 4531 6531 7545 8519 表 6 三種檢測器靈敏度比較 Compd.UVEL

30、SDCAD LOD/gLOQ/gLOD/gLOQ/gLOD/gLOQ/g N-R10.030.130.040.130.050.16 G-Rg10.040.280.080.160.030.13 G-Re0.020.630.190.750.150.41 G-Rb10.050.300.050.170.010.05 G-Rg20.120.450.150.820.020.05 G-Rh10.130.450.180.480.120.04 G-Rd1.834.600.080.300.020.15 測器基線平穩(wěn)，靈敏度較高，可以獲得大信息量的 HPLC 圖譜，更加適用于三七藥材指紋圖譜的分析。 2）方法學(xué)參考

31、 將供試品溶液按照已經(jīng)建立的 HPLC 分析條件 , 連續(xù)進樣 6 次，記錄各色譜峰相對保留時間及其 RSD 值。 應(yīng)用文集 17 結(jié)果表明 CAD 檢測器 RSD 值在 0.01% 0.92% 之間，儀器精密度符合要求。另外，分別考察了同一批次樣 品及同一樣品放置不同時間的保留時間 RSD 值，結(jié)果均表明重復(fù)性良好。 方法結(jié)論： 通過比較 CAD 與 ELSD、UV 三種檢測器及色譜條件優(yōu)化，建立了靈敏、準確、穩(wěn)定的 HPLC-CAD 聯(lián) 用分析三七藥材的指紋圖譜方法 ( 見圖 10)。通過對 20 批不同產(chǎn)地和批次的藥材分析，建立了采自云南、廣 西等不同產(chǎn)地三七藥材的指紋圖譜，為三七及其它

32、含有弱或無紫外吸收成分的藥材的質(zhì)量控制和分析研究提 供了新的參考。 圖 10 三七藥材指紋譜圖 3: Notoginsenoside R1; 4: Ginsenoside Rg1; 5: Ginsenoside Re; 14: Ginsenoside Rb1 ; 15: Ginsenoside Rg2 ; 16: Ginsenoside Rh1 ; 17: Ginsenoside Rd 參考文獻來源：白長財 , 柴興云 , 王海龍 , 等 . 中國藥科大學(xué)學(xué)報 2009, 40 (1) : 54 - 58 3.1.2 電噴霧檢測器測定人參皂苷的性能評價 方法簡介： 本方法建立了利用 HPLC

33、電霧式檢測器聯(lián)用技術(shù)，檢測 7 種常見的人參皂苷化合物的方法。同時，將該 方法與其他兩種方法 ELSD 和 UV 就靈敏度、線性、準確性方面分別進行了比較。 分析條件： 分析柱：Agilent Zorbax Extend C18, 5 m 4.6 250 mm 柱溫：20 CAD 檢測條件：霧化室溫度 30； N2：35 psi DAD：203 nm ELSD：漂移管溫度 40；N2：36 psi 流動相：A： 水；B：乙腈；梯度見表 7 進樣量：10 L 流速：1.0 mL/min 表 7 梯度條件 時間（min）乙腈 % 018 2722 3026 6539 7518 圖 11 7 種人參

34、皂苷的結(jié)構(gòu)示意圖 t/min 102030405060708090 19 18 17 16 15 14 12 1113 10 8 9 7 6 5 4 3 21 0 18 表 8 三種檢測器測定 7 個皂苷的 LOD 與 LOQ 比較 分析物測試范 圍 (mg/mL) Rg1 (0.0158-0.63) Re (0.015-0.60) Rb1 (0.0136-0.546) Rc (0.0164-0.654) Rb2 (0.0136-0.546) Rb3 (0.0147-0.588) Rd (0.0169-0.675) CAD* r20.99950.99910.99850.99840.99750.

35、99910.9993 a0.88580.87110.91260.89280.89920.89690.8831 b4.37764.44854.52034.49344.52484.55554.528 LOD(ng)9.646.5713.915.011.311.610.9 LOQ(ng)24.117.534.840.125.520.918.2 ELSD r20.99830.99870.99900.99750.99790.99880.9988 a1.27631.2861.31321.32451.29521.24911.3186 b4.13084.25924.2394.24254.2674.33534.

36、461 LOD(ng)60.243.846.458.447.238.624.2 LOQ(ng)144.6102.2116.0150.3113.496.572.6 UV r20.99980.99980.99990.99960.99950.99960.9996 a2464.925522047.22079.52119.72437.82617.2 b3.09231.79751.85292.26071.88872.69910.6305 LOD(ng)62.343.836.067.085.057.954.4 LOQ(ng)124.6119.0108.0101.0128.0133.0142.0 圖 12 人

37、參皂苷標準譜圖 (a). CAD, (b). ELSD, (c).UV 1: Rg1, 2: Re, 3: Rb1, 4 : Rc, 5: Rb2, 6: Rb3, 7: Rd * The logarithm of the peak areas (y) and the logarithm of the corresponding concentration of the analyte (x) Time(min) 2030405060100 0 200 400 600 mAUa 1 2 Response(mAU) Time(min) 2030405060100 200 100 300 400

38、500 600 mAUb Response(mAU) Time(min) 2030405060100 100 75 50 25 0 125 mAUc Response(mAU) 34 5 6 7 應(yīng)用文集 19 方法結(jié)論： 通過對三種檢測器 LOQ 和 LOD 的比較， CAD 具有最佳的靈敏度。而對于 Rg1 和 Re, CAD 可以檢測的 最低濃度比 ELSD 和 UV 低六倍以上。 對日內(nèi)和日間重現(xiàn)性進行考察，CAD 日內(nèi)以及日間重現(xiàn)性 RSD 均 2.94%，而 ELSD 則 3.99%，CAD 表現(xiàn)出更好的響應(yīng)穩(wěn)定性。對樣品加標回收實驗表明，CAD 對 7 種人參皂苷的回收率在 96

39、.9103%，且 RSD99.9:0.199.9:0.199.9:0.199.2:0.899.9:0.1 295.0:0.595.9:4.195.0:0.596.5:3.596.7:3.3 390.0:1091:998.1:1.992.1:7.991.4:8.6 480:2081:1990.7:9.380.6:19.480.6:19.4 570:3071.5:28.581.4:18.671.6:28.470.7:29.3 660:4061.8:38.269.4:30.662.5:37.560.4:39.6 750:5048:5250.8:49.250.5:49.549.1:50.9 840:6

40、041.3:58.737.9:62.142.3:57.741.3:58.7 930:7030.8:69.223.4:76.632.3:67.731.4:68.6 1020:8020.3:79.711.7:88.322.1:77.920.4:79.6 1110:909.8:90.24.1:95.912.2:87.89.5:90.5 125:955:950.3:99.72.6:97.44.6:95.4 130.1:99.90.1:99.90.1:99.90.8:99.20.1:99.9 0.00 0.00 12.00 24.00 Response(mV) 48.00 1 23 4 5 6 C B

41、A 36.00 60.00 1-Placebo/diluent 2-Gentamicin C1a 3-Gentamicin C2 4-Gentamicin C2a 5-Gentamicin C2b 6-Gentamicin C1 3.006.009.0012.0015.0018.00 Retention Time(Minutes) 21.0024.0027.0030.0033.00 26 68104 Minutes 2 40 60 80 100 36 32 246810 40 44 48 Response Gabapentin Lamotrigine Gabapentin Lamotrigin

42、e Topiramate Topiramate 5,5 Diphenylhydantoin 5,5 Diphenyl hydantoin 為了考察造成 ELSD 這種差異性的原因，對 ELSD 的線性規(guī)律進行了考察，發(fā)現(xiàn) ELSD 的響應(yīng)信號與化 合物濃度之間呈現(xiàn)雙指數(shù)關(guān)系，即：通過這個公式，可以對 ELSD 中 er 值進行校正。雖然校正后的 er 更加 真實的反映對映體比率，但是數(shù)據(jù)處理非常繁瑣，且不適用于批量樣品。 CAD 檢測器雖然同 ELSD 類似，也是一種通用型檢測器，但 CAD 對同一化合物表現(xiàn)出更佳的線性及更 寬的動態(tài)范圍，如圖 22 所示。用 CAD 檢測器檢測 (R)-5

43、和 (S) -5 的對映體比率，均與 UV 的結(jié)果類似，且 有時比 UV 更加精確。 圖 22 (R)-5 在各檢測器上的線性 方法結(jié)論： 通過對 ELSD、UV 和 CAD 檢測器的對比，發(fā)現(xiàn)在所有情況下，CAD 和 UV 的檢測結(jié)果保持一致，并 且和實際值最為接近，而 ELSD 線性的影響，很容易造成檢測結(jié)果的偏差。因此，CAD 檢測器由于其檢測 準確性、易于操作，而且是一種通用型檢測器，尤其是化合物沒有或者僅有弱 UV 反映的情況下，非常適用 于對映體純度的檢測。 參考文獻來源：PETER WIPF, STEFAN WERNER, LESLIE A. TWINING, et al. CH

44、IRALITY 19:5-9 (2007) 3.2.5 電噴霧檢測器測定抗驚厥類藥物 方法簡介： 本方法采用 CAD 檢測器對 4 種抗暈蕨類藥物進行了測定，結(jié)果顯示 CAD 均表現(xiàn)出了高靈敏度和準確性 （圖 23），動態(tài)范圍從 ng 級到 g 級。 分析條件： 分析柱：MCM column, 5 m 4.6150 mm 流動相：30% 乙腈 /70%25mmol/L 醋酸銨，pH5.0 柱溫：室溫 CAD 檢測條件： N2：35 psi 進樣量：10 L 流速：1.0ml/min 圖 23 4 種藥物分析重復(fù)進樣 5 針重復(fù)性（200 ng）（RSD 1.12.8%）（小圖為 10 ng 進

45、樣） 應(yīng)用文集 27 參考文獻來源：AN 70-6705 Anticonvulsants-1（內(nèi)部資料） 3.2.6 對乙酰氨基酚純度測定 方法簡介： 本方法采用 CAD 檢測器對對乙酰氨基酚中的葡萄糖雜質(zhì)進行了測定。固定對乙酰氨基酚的濃度 100g，可以對其中 0.005%1% 的葡萄糖雜質(zhì)進行準確測定（圖 24）。 分析條件： 分析柱：MCM column, 5 m 4.6150 mm 柱溫：室溫 CAD 檢測條件：霧化室溫度 30； N2：35 psi 流動相：A：90:9:1 (v/v/v) 水 : 甲醇 : 醋酸，B：乙腈；A：B=90:10 進樣量：10 L 流速：1.5mL/mi

46、n 圖 24 0.005% 水平雜質(zhì)測定譜圖 方法結(jié)論： CAD 檢測器為非揮發(fā)分析物提供了一種通用性檢測器，具有很寬的動態(tài)響應(yīng)范圍、靈敏度高、精密度好。 由于操作簡單，分析可靠，在 HPLC 分析領(lǐng)域中占有明顯的優(yōu)勢。 參考文獻來源：AN 70-6716 Impurity_Testing-2（內(nèi)部資料） 3.2.7 活性藥物成分（APIs）中陰陽對離子的同時測定 方法簡介： 臨床醫(yī)療中使用的大約 50以上藥物都是以藥物分子的鹽給藥，鹽的形式可以改善活性藥物成分（API） 的生物和理化性質(zhì)，包括水溶性、吸濕性、pH 值、溶解率、化學(xué)穩(wěn)定性、結(jié)晶形式和力學(xué)性能等。最常見 的藥物的反離子包括：氯、

47、鈉、硫酸根、乙酸根、磷酸、鉀、馬來酸鹽、鈣、檸檬酸鹽、溴化物，硝酸鹽、 銨鹽、甲苯磺酸酯、磷酸鹽、酒石酸鹽和亞乙基二胺。常規(guī)檢測時，需要結(jié)合采用幾種不同的的方法才能實 現(xiàn)藥物活性成分及其多種對離子的準確分析。最新創(chuàng)新型的混合模式色譜柱技術(shù)和通用檢測技術(shù)的能夠?qū)崿F(xiàn) API 成分及其多種無機、有機對離子的同時快速、靈敏分析。 特色的 Acclaim Trinity P1 色譜柱結(jié)合了陽離子交換、陰離子交換和反相色譜三種功能，可以實現(xiàn)一針進 樣，陰陽離子和脂溶性 APIs 的同時分離。聯(lián)用通用型檢測器 CAD，克服了不同物質(zhì)同時分析檢測器選擇的 難題。 Response Solvent Void 5

48、ng (on column) Glucose 100g (on column) Acetaminophen Minutes Range=1pARange=500pA 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 0.00.40.81.21.62.02.42.83.23.64.0 28 分析條件： 分析柱：Acclaim Trinity P1, 3 m 3.050mm 柱溫：30 CAD 檢測條件：霧化溫度 30 檢測波長：210nm，254nm 流動相：A 乙腈 , B 去離子水 , C 0.2 mol/L 醋酸銨 , pH4.0；梯度條件見表 15 流速：0.5 mL/min 進樣量：2

49、L 表 15 梯度條件 時間 (min) B（%）C（%） -10355 0355 2355 7090 15090 Sample Raw Area (pA*min) RSD (n=5) Calculated Chloride (w/w) Diclofenac Standard0.023113.01%0.03% Diclofenac+0.1%CL0.10692.390.14% Diclofenac+0.15%CL0.13181.49%0.17% 圖 25 雙氯芬酸鈉樣品及加標譜圖 1. 鈉離子；2. 氯離子；3. 雙氯芬酸 A：雙氯芬酸鈉樣品；B：0.1%(w/w) 氯 離子加標；C：0.15%

50、(w/w) 氯離子加標 圖 26 16 種對離子同時分離譜圖 陽離子：1. 普魯卡因; 2. 維生素; 3. 緩血酸銨; 4.鈉 離子 ; 5. 鉀離子 ; 6. 葡甲胺 陰離子： 7. 甲磺酸 ; 8. 馬來酸鹽 ; 9. 氯化物 ; 10. 溴化物 ; 11. 碘化物 ; 12. 磷酸鹽 ; 13. 蘋果酸鹽 ; 14. 酒石酸鹽 ; 15. 檸檬酸鹽 ; 16. 硫酸鹽 方法結(jié)論： Trinity P1 是一種混合機制色譜柱，能夠同時分析活性藥物成分中對離子成分。在等度條件乙腈 /120 mmol/L 醋酸銨 (75:25) pH = 4.8 下，即可實現(xiàn)雙氯芬酸鈉樣品中氯離子、鈉離子和

51、主成分的良好分離（圖 24），樣品加標結(jié)果顯示方法準確。而對于常見的 16 種藥物反離子成分（圖 26），Trinity P1 均可實現(xiàn)其基 線分離并準確、高靈敏度檢測。 參考文獻來源：Christopher Crafts, Marc Plante, Bruce Bailey, et al. 87447-PO-IICS-API-Counterion-CAD-18. Oct2010-LPN2610-01 表 16 雙氯芬酸鈉樣品及加標測定結(jié)果 0.01 -5.0 0.0 pA 10.5 1 2 3 A B C 0.501.001.502.002.503.003.504.004.505.00 Mi

52、nutes 1 2 4 5 6 7 8 9 1011 12 13 14 15 16 3 0 0 mV 400 3691215 Minutes 應(yīng)用文集 29 第三節(jié) CAD 在生化藥物中的分析應(yīng)用 3.3.1 釀酒酵母發(fā)酵液中甘油含量的測定 方法簡介： 甘油是釀酒酵母發(fā)酵過程中重要的發(fā)酵產(chǎn)物之一。目前，甘油的測定方法主要有化學(xué)法、酶法、熱重 - 差熱分析法、氣相色譜法和高效液相色譜法 (HPLC) 等。其中，高效液相色譜法由于測定準確、靈敏度高、 精密度好、分析成本相對較低、樣品預(yù)處理簡單等優(yōu)點，在甘油測定方面有著非常廣泛的應(yīng)用。本文利用配 備電霧式檢測器的 HPLC 系統(tǒng)，創(chuàng)建了測定釀酒酵母

53、發(fā)酵液中甘油的方法。 分析條件： 分析柱：Shodex Asahipak NH2P-504E, 4.6250 mm 柱溫：25 CAD 檢測條件： 氮氣壓力 35.0psi；輸出范圍：100pA 流動相：乙腈 - 水 (75:25，v/v) 進樣量：10 L 流速：1.0 mL/min 圖 27 甘油標準品譜圖圖 28 發(fā)酵液樣品譜圖 方法結(jié)論： 采用 HPLC-CAD 檢測甘油，與采用示差折光檢測器相比 ，具有更高的靈敏度；與柱前衍生化 HPLC 法 相比，無需對樣品進行衍生化處理，操作步驟簡單。用此法測定釀酒酵母發(fā)酵液實際樣品，有較高的靈敏度 和較好的重現(xiàn)性，完全符合實際檢測工作的需要。

54、參考文獻來源：曹海龍，朱豫，李曙光，等 . 分析儀器，2009. 1: 27 - 29 3.3.2 脂質(zhì)體中磷脂含量的測定 方法簡介： CAD 可實際應(yīng)用于任何非揮發(fā)或半揮發(fā)化合物，包括藥物、脂類、碳水化合物、多肽、藥物分子支架、 類固醇、蛋白質(zhì)、聚合物等。磷脂和膽固醇是脂質(zhì)體主要成分，其穩(wěn)定性直接影響脂質(zhì)體藥物的包封率和滲 漏率及脂質(zhì)體在體內(nèi)的行為。目前，磷脂分析多采用 HPLC-ELSD 法，其特點是散射光的對數(shù)響應(yīng)值與組分 的質(zhì)量的對數(shù)成線性關(guān)系，但此對數(shù)關(guān)系變異性較大，其靈敏度較低，最低檢出限在 50-100ng 之間。CAD 3.0 2.0 1.0 0.0 0.01.02.03.04

55、.05.0 甘油 甘油 時間（min） 信號響應(yīng)（A） 6.0 4.0 2.0 0.0 信號響應(yīng)（A） 0.02.04.06.08.010.0 時間（min） 30 表 17 梯度條件 時間（min）B（%） 090 2.5100 12100 12.190 1590 檢測器作為一種通用型檢測器，在磷脂的分析檢測 方面顯示出了非凡的能力，文獻報道甘油三酯、膽固 醇等類脂物質(zhì)的最低檢出限達到了 1ng。本實驗采用 HPLC-CAD 聯(lián)用測定了空白脂質(zhì)體注射液及凍干粉 針劑中 DSPE-PEG, DSPG, MPPC, DPPC 的含量。 分析條件： 分析柱：Venusil XBP C8, 5 m

56、4.6250 mm CAD 檢測條件：氮氣壓力 35.0psi；輸出范圍： 200pA 流動相：A：水；B：甲醇；梯度條件見表 17 進樣量：10 L 流速：1.0 mL/min 柱溫：25 結(jié)果參考： 1）系統(tǒng)適用性 系統(tǒng)適用性試驗結(jié)果表明，空白脂質(zhì)體注射液中 各輔料和酸、堿、氧化、高溫、強光破壞試驗中產(chǎn)生 的雜質(zhì)均不影響 DSPE-PEG、DSPG、MPPC、DPPC 的檢測。酸、氧化、高溫、強光破壞試驗結(jié)果顯示 MPPC 的含量升高，見圖 29。 2）樣品測定 脂質(zhì)體樣品中的其他組分與磷脂能夠有效分離， 不影響磷脂的測定，其中 2. 70 min 的色譜峰為脂質(zhì) 體中加入凍干保護劑，在磷

57、脂分析的過程中可以同時 進行定量測定，見圖 30。實驗結(jié)果表明，脂質(zhì)體凍 干粉針樣品穩(wěn)定性明顯優(yōu)于注射液。 方法結(jié)論： 實驗表明，CAD 檢測器作為一種新型通用檢 測器，其性能完全適用于磷脂分析。本實驗建立的 HPLC-CAD 檢測法完全滿足磷脂的分析檢測要求， 為脂質(zhì)體制劑的磷脂成分分析檢測提供了一套完整的 方法，成為脂質(zhì)體制劑中磷脂的含量和降解產(chǎn)物檢測 的一種有效手段。 參考文獻來源：姜慶偉，楊瑞，梅興國 . 中國藥 學(xué)雜志，2007. 42(23）: 1794 - 1796 圖 29 系統(tǒng)適用性 HPLC 色譜圖 A：空白脂質(zhì)體注射液色譜圖；B：經(jīng)酸破壞后的色譜圖 1：二硬脂酰磷脂酰乙醇

58、胺 - 聚乙二醇（DSPE-PEG）； 2：二硬脂酰磷脂酰甘油（DSPG）；3：單棕櫚酰磷脂酰 膽堿（MPPC）；4：二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC） 圖 30 脂質(zhì)體樣品的 HPLC 色譜圖 1：加入凍干保護劑脂質(zhì)體；2：藥物 3.3.3 22 種氨基酸的同時直接檢測 方法簡介： 氨基酸是蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位，是動物體合成蛋白質(zhì)的原料來源，屬食品、飼料的營養(yǎng)成分，在醫(yī)學(xué) 上具有防病治病的作用，也可作為營養(yǎng)型化妝品的有效成分及合成藥物、表面活性劑、其他工業(yè)產(chǎn)品的化工 原料。因此，氨基酸分析是工業(yè)、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及生命科學(xué)研究中最重要的技術(shù)之一。但是由于多種氨基酸結(jié)構(gòu) 相似，且只有少數(shù)具備足夠的發(fā)色團，因此無衍生處理的氨基酸的分離和檢測非常困難。對于氨基酸的分析， 目前常用的靈敏、準確的檢測方法均需要使用衍生化試劑，從而增加了操作復(fù)雜性，比較耗時。本文采用 UHPLC，12min 即實現(xiàn)了 22 種氨基酸的良好分離，使用 CAD 作為檢測器，克服了氨基酸在常規(guī)紫外檢測器 0.03.36.7 1 2 3 4 A B 10.013.316.720.0 0.03.3 2 3 4 6.710.0 t/min t/min 13.316.720.0 0.0 1 2 3.36.710.0 t/min 13.316.720.0 應(yīng)用文集