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文檔簡介
1、,第三章 基因工程制藥,3.5 目的基因表達,合成目的基因產物包括轉錄、翻譯、加工等過程,首先使目的基因編碼序列在RNA聚合酶催化下轉錄成mRNA,mRNA與核糖體結合,由tRNA將氨基酸引入,按mRNA的遺傳信息翻譯為多肽。通常,新生多肽需經過翻譯后加工,如糖基化、磷酸化等才能成為有功能的蛋白。,Gene Vector Host cell DNA mRNA protein,tet四環(huán)素誘導產生的a-synuclein蛋白質,一. 宿主細胞的選擇,對宿主細胞的要求: 容易獲得較高濃度的細胞,能利用價廉易得原料,不產生內毒素、不致病,需氧低,發(fā)熱量低,適當的發(fā)酵溫度,易進行代謝調控,易進行DNA
2、重組技術操作,產物的產量、產率高,易進行分離純化等。 宿主細胞有兩類: 原核細胞表達體系(大腸桿菌、枯草芽孢桿 菌、鏈霉菌); 真核細胞表達體系(酵母、哺乳動物細胞),1.原核細胞表達體系,大腸桿菌(Eschertchia coli) 研究的比較多,技術成熟; 操作方便;成本低; 不存在翻譯后修飾作用,對蛋白質產物不能糖基化; 枯草芽孢桿菌 分泌能力強;具有若干種有價值的信號肽序列 鏈霉菌 分泌能力強,安全不致?。槐磉_的蛋白基本能正確折疊,不形成包涵體,EPO能否在本體系進行表達?,異源和同源蛋白在芽孢桿菌表達的實例,2.真核細胞表達體系,(1)酵母表達體系 eg.乙肝,干擾素等 主要優(yōu)點:
3、強啟動子可促使外源基因達到高效表達,如明 膠表達量可高達14.8g/L; 高密度培養(yǎng), 可使菌絲干重達到100g/L甚至 更高; 表達的蛋白可進行折疊和翻譯后修飾; 外分泌表達,雜蛋白較少,產物易純化。,外源基因在畢赤酵母表達的實例,(2)絲狀真菌,強分泌蛋白質的能力, 能正確進行翻譯后加工(剪切、糖基化), 曲霉被確認是安全菌株,有成熟的發(fā)酵和后處理工藝,2.真核細胞表達體系,(3)哺乳動物細胞,中國倉鼠卵巢細胞(CHO)和猴腎細胞(COS)使用最多 ; 優(yōu)點: 能識別和剪切外源基因中的內含子并加工為成熟的mRNA,產物類似或接近天然產物;表達產物分泌到細胞外,使產物純化更加容易。 缺點:
4、動物細胞生產周期長,培養(yǎng)條件苛刻等,二. 大腸桿菌中的基因表達,大腸桿菌應用最廣泛、最成功的表達體系,常常作為高效表達的首選體系,1.載體,載體的作用是把外源DNA帶進宿主細胞,并使之在細胞內建立穩(wěn)定的遺傳狀態(tài),在細胞內繁殖、傳代或進行表達。 載體主要有質粒、粘性末端質粒、噬菌體和病毒。 載體按照其用途可分為:克隆載體、表達載體、轉移載體、探針載體。,(1)表達載體需要具備的條件,1、能夠獨立復制,復制能力強,多用松弛型; 2、具有靈活的多克隆位點; 3、具有方便的篩選標記; 4、具有很強的啟動子,能為大腸桿菌的RNA 聚合酶識別; 5、具有很強的終止子; 6、mRNA必須具有翻譯的起始信號,
5、即起始密碼 AUG和SD序列; 7、一般具有阻遏子,使啟動子受到控制,表達載體的基本結構,(2)基因工程藥物常用的表達載體,pBV220(3.66kb)系統, pET系統,pBV220表達系統,pBV220系統組成: pUC8的多克隆位點、核糖體rrnB基因終止信號、pBR322第42453735位、pUC18第2066680位、 噬菌體cIts857抑制子基因及PR啟動子、pRC23的PL啟動子及SD序列,優(yōu)點: cIts857抑制子基因與PL啟動子同在,以便選用蛋白酶活低的宿主細胞,使表達產物不易降解; SD序列后面緊跟多克隆位點,便于插入帶起始ATG的外源基因,可表達非融合蛋白; 強的轉
6、錄終止信號可防止出現“通讀”現象, 質粒小,有利于增加其拷貝數及容量,可以插入較大片段的外源基因; PR與PL啟動子串聯,可以增強啟動作用。本系統為溫度誘導,外源基因表達量可達到細胞總蛋白的20%-30%, 包涵體形式存在, 不易被降解,均一性好。,pBG-2是pBV220系統衍生的便于產物純化的融合表達載體; 插入proteinG的IgG Fc結合區(qū)基因片段180個堿基對,下游是多克隆位點,引入了剪切融合蛋白的切點,具有與IgG結合的活性,可方便地在分離中用固定化的IgG進行親和層析,簡化了下游處理工藝。質粒中有目的基因融合位點及蛋白剪切位點,使目的基因產物純化后能恢復到天然狀態(tài)。,融合表達
7、質粒pBG-2的結構,pET系統,LB培養(yǎng)基或M9培養(yǎng)基中生長良好; 產物以包涵體形式存在于細胞內 外源基因最大表達量可占細胞總蛋白的50%。中試生產中,可以用乳糖代替IPTG作為誘導劑, 降低發(fā)酵成本; 新的PET系統帶有his標記, 標記與克隆位點之間有酶切割位點,使產物能方便地使用金屬整合物分離材料進行分離,一步達到高純度、高收率。,pRSET,2.影響目的基因在大腸桿菌中表達的因素,(1)外源基因的拷貝數:高拷貝的表達質粒 (2)外源基因的表達效率: 強啟動子 核糖體結合位點(RBS)有效性 SD序列和起始密碼ATG的間距 選擇偏愛的密碼子 (3)表達產物穩(wěn)定性,不易被降解 (4)細胞
8、的代謝負荷:防止表達產物的毒性 (5)優(yōu)化工程菌的培養(yǎng)條件,3.真核基因在Ecoli.中的表達形式,融合蛋白形式 非融合蛋白形式 分泌型表達 包涵體形式,(1) 以融合蛋白形式表達藥物基因,原核序列 + 真核序列(目的基因) N-短的原核多肽 + 真核蛋白(目的蛋白) -C,融合蛋白載體示意圖,融合蛋白進行位點特異性 裂解的方法,(1)化學裂解 可采用諸如溴化氰(Met)、BNPS-3-甲基吲哚(Trp)、羥胺(AsnGly)等試劑或低pH(AspPro)來進行融合蛋白的化學裂解。 (2)酶解 溫和;高度專一性。 有用的酶有:凝血酶、腸激酶、Xa因子、凝乳酶、膠原酶等。這些酶都具有較長的底物識
9、別序列(比如在凝乳酶中為7個氨基酸),從而降低了蛋白質中其他無關部位發(fā)生斷裂的可能性。 腸激酶和凝血酶應用最多,因為它們切割各自的識別序列的羧基端,就使帶有天然氨基端的被融合部分得以釋放。,以CNBr處理去除融合多肽示意圖,凝血因子Xa切割融合蛋白示意圖,GST融合表達載體 pGEX6p-3,GST純化 例,上清液加入1mL 50%的谷胱甘肽-瓊脂糖珠混懸液中,室溫下輕輕混勻超過2min。加50mL冰浴預冷的PBS液洗滌,混勻, 500g離心10s。用PBS液洗滌2次,用12mL冰冷的PBS重懸瓊脂糖珠,并移入一個1.5mL微量離心管中。 室溫下500g離心10s收集瓊脂糖珠,棄上清液。加1m
10、L GST洗脫緩沖液(50mmol/L TrisCl,pH8.0/ 5mmol/L還原型谷胱甘肽)洗脫融合蛋白?;靹?min,500g離心10s,收集上清液。重復洗脫二三次,經SDS-PAGE分析各分部收集的樣品。洗脫的蛋白質分成小份,加甘油10%貯存于-70。,(2) 藥物蛋白基因的非融合表達,表達非融合蛋白的操縱子: 細菌或噬菌體的啟動子一細菌的核糖體結合位點(SD序列)一真核基因的起始密碼子一結構基因一終止密碼。 要求:SD序列與翻譯起始密碼ATG之間的距離要合適 特點:非融合蛋白能夠較好地保持原來的蛋白活性;容易被蛋白酶破壞;非融合蛋白N末端帶有甲硫氨酸,可能引起人體免疫反應。,(3)
11、藥物蛋白基因的分泌型表達,細胞外膜蛋白、周質蛋白、內膜蛋白以帶有N-端信號肽的前體形式在細胞質中合成,隨后穿膜運送到周質或定位到內、外膜上。在穿膜的過程中,信號肽被信號肽酶切除。 信號肽 + 外源基因,蛋白質的分泌表達的優(yōu)點,A.信號肽被切除后生成的蛋白質的N-末端氨基酸殘基和天然的產物是一致的; B.周質空間中的蛋白酶的活性要比胞質中的低,這使所表達的蛋白能穩(wěn)定的存在于周質中; C.周質中只有少量的細菌蛋白,它們僅占細菌總蛋白的4%,使得重組蛋白更易純化; D.周質空間中提供了一個氧化的環(huán)境,更有利于二硫鍵的正確形成。,信號肽序列,信號肽:15-30個疏水Aa殘基組成,N-端的小段肽鏈是以帶
12、正電荷的賴氨酸和精氨酸為特征,隨后是以疏水Aa為主的肽段,在鄰近切割位點處常有幾個側鏈很短的氨基酸,如甘氨酸、丙氨酸等。 N端帶正電荷的一段:有助于新生肽鏈與帶負電荷的細胞質膜結合; 疏水肽段:能形成-螺旋結構,兩段螺旋以反平行的方式形成發(fā)夾結構之后,容易進入內膜的脂雙層; 鄰近切割位點的氨基酸:傾向于形成-折疊,這可能是信號肽酶所識別的結構。 信號肽后面的氨基酸:也影響蛋白質的穿膜和隨后的切割。,實現分泌表達的條件,合適的信號肽(堿性磷酸酶信號肽(phoA)、膜外周質蛋白信號肽(OmpA)、霍亂弧菌毒素B亞單位(CTXB)等); 培養(yǎng)條件:培養(yǎng)溫度影響著分泌的速度,分泌速度又與蛋白質的正確折
13、疊有關; 啟動子的強度和誘導劑的濃度也有影響; 目前普遍接受的觀點: 低溫,低強度的啟動子和較低濃度的誘導劑,可能實現分泌表達。 不同的菌種,分泌的效果也不同。,例:瘦素Leptin的分泌表達,當細胞在37培養(yǎng)時,在一定的IPTG濃度下,包涵體達Leptin總量的75-90%; 當在30培養(yǎng)時,大部分的Leptin則能以可溶的形式生成,可溶蛋白占總目的蛋白的85-92%,然而與37條件相比總目的蛋白的量卻減少了30-40%。 利用低濃度的IPTG誘導可提高可溶蛋白的含量。,包涵體是指在某些生長條件下,大腸桿菌能積累某些特殊的生物大分子(主要是蛋白質組成),它們在細胞內致密地聚集成沒有生物活性的
14、直徑約0.1-3.0m的固體顆粒,或被膜包裹或形成無膜裸露結構。 包涵體主要由蛋白質組成,其中大部分是克隆外源基因的表達產物。,(4)蛋白質的包涵體形式表達與蛋白質復性,包涵體形式表達 不可溶、無生物活性的包涵體必須經過變性、復性才能獲得天然結構、生物活性。 選擇一個合適的復性過程來實現正確的蛋白質折疊(protein folding),獲得生物活性,是基因工程的難點和熱點。,包涵體的優(yōu)勢 有利于防止蛋白酶對表達蛋白的降解 有利于表達產物的分離純化(通過高速離心即可將包涵體從細胞裂解物中分離出來) 減少對宿主菌的毒害,包涵體形成的原因,重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白,由于缺少真核生物中翻譯后修飾
15、所需的酶類,致使中間體大量積累,容易形成包涵體沉淀。 缺乏蛋白質折疊過程中需要的某些酶和輔助因子,或環(huán)境不適,無法形成正確的次級鍵等,也是原因之一。 表達量越高越容易形成包涵體??赡芤驗楹铣伤俣忍欤灾劣跊]有足夠的時間進行折疊,二硫鍵不能正確配對,過多的蛋白間可能存在非特異性結合,蛋白質無法達到足夠的溶解度等。,減少包涵體形成的策略,(1)降低重組菌的生長溫度。 (2)促進重組蛋白質可溶性表達的生長添加劑:高濃度的多醇類、蔗糖可以阻止分泌到周質的蛋白質的聚集反應。其它添加劑還有乙醇(誘導熱休克蛋白的表達)、低分子量的巰基或二硫化合物(改變細胞周質的還原態(tài),影響二硫鍵的形成)等。 (3)供給豐
16、富的培養(yǎng)基,創(chuàng)造最佳條件,如供 氧、pH。,包涵體蛋白的分離、純化,包涵體的形成不僅可獲得高表達、高純度的重組蛋白質,還可避免細胞水解酶對重組蛋白質的破壞。 由于包涵體是蛋白質聚集而成的致密顆粒,分離的第一步是對培養(yǎng)收集的細胞進行破碎,有效的方法是高壓勻漿結合溶菌酶處理,然后500020000g離心,可使大部分包涵體沉淀與可溶性蛋白分離。 包涵體沉淀需用去污劑(Triton X-100或脫氧膽酸鈉)和低濃度變性劑(2mol/L尿素或鹽酸胍)洗滌除去脂類和膜蛋白,否則會導致包涵體溶解和復性的過程中重組蛋白質的降解。,包涵體的溶解,用很強的變性劑,如8mol/L尿素、68mol/L鹽酸胍,通過離子
17、間的相互作用破壞包涵體蛋白間的氫鍵而增溶蛋白。 對于含有半胱氨酸的蛋白,在增溶時應加入還原劑(如巰基保護劑DTT、-ME)打開蛋白質中所有二硫鍵。,復性-蛋白質折疊,蛋白質折疊涉及兩種疏水作用,一是分子內的疏水相互作用,可促進蛋白質正確折疊;一是部分折疊的肽鏈分子間的疏水相互作用,會導致蛋白質聚集。聚集過程與復性過程相互競爭。 蛋白質的立體結構雖然由其氨基酸的順序決定,然而伸展肽鏈折疊為天然活性結構的過程還受到周圍環(huán)境,如溫度、pH值、離子強度等因素的影響。,復性方法,透析、超濾和稀釋復性法(最傳統也應用最普遍的蛋白質折疊復性方法) 透析法耗時長,易形成無活性蛋白質聚集體; 超濾法在膜上聚集變
18、性,易造成膜污染; 稀釋法處理量太大,不利于工業(yè)放大。,ULTRALAB SYSTEM,復性方法,添加促進劑的復性方法 A.共溶劑:如PEG6000 - 20000,阻止蛋白 質分子間的相互碰撞機會; B.去污劑及表面活性劑:如Triton X-100、磷脂等對蛋白質復性有促進作用,但它們能與蛋白質結合,很難去除;,復性方法,C.氧化-還原劑:如DTT等,通過促進不正確形成的二硫鍵快速交換反應,提高了正確配對的二硫鍵的產率;,復性方法,D.分子伴侶和折疊酶: 分子伴侶: 結合和穩(wěn)定另外一種蛋白質的不穩(wěn)定構象,促進新生多肽鏈的折疊、多聚體的裝配。 折疊酶: 二硫鍵異構酶(PDI)、脯氨酸異構酶等
19、。 這類蛋白在折疊復性后要除去,而且十分昂貴。,復性方法,E.單克隆抗體:待折疊復性的蛋白質的抗體可有效協助復性,但只限于此蛋白。 F.其它:甘油可以增加黏度,減少分子碰撞的機會,減少錯配以提高復性效率;適量的鹽濃度可以降低某些帶電基團間的斥力,有利于蛋白質的折疊。,復性方法,液相色譜(LC)復性法最有效的純化蛋白質的方法 液相色譜復性的優(yōu)點: 色譜固定相對變性蛋白質的吸附可明顯的減少變性蛋白質在脫離變性劑環(huán)境后的分子聚集,從而避免了沉淀的產生; 在蛋白質復性的同時,可使目標蛋白與雜蛋白分離,復性方法,疏水相互作用色譜(HIC)、離子交換色譜(IEC)、凝膠排阻色譜(SEC)、親和色譜(AFC
20、)已成功的對變性蛋白進行了復性。 在4種色譜法中,SEC的分離效果是LC中最差的,AFC使用范圍窄、所需時間長、價格昂貴,HIC是較為理想的方法。,三. 基因在酵母中的高效表達,兩個比較重要的酵母表達系統: 釀酒酵母表達系統 嗜甲醇酵母(巴氏畢赤酵母,Pichia pastoris)表達系統,1.釀酒酵母表達載體,a-因子分泌型表達載體,真核細胞表達載體示意圖,2.影響目的基因在酵母中表達的因素,(1)外源基因的拷貝數 (2)外源基因的表達效率 啟動子(組成型和誘導型啟動子) 分泌信號的效率 終止序列的影響 (3)外源蛋白的糖基化: 酵母細胞分泌的異源蛋白糖基化產物與天然產 物完全相同,是生產
21、醫(yī)用蛋白質的重要手段。 (4)宿主菌株的影響,四. 動物細胞中的基因表達,哺乳動物表達系統(CHO 細胞),(將在動物細胞制藥中講解),五.比較大腸桿菌、酵母和哺乳動物細胞 3類主要基因工程表達體系 表達體系 大腸桿菌 酵 母 哺乳動物細胞 產 物 多肽、蛋白質 多肽、蛋白質 完整糖基化蛋白 或融合蛋白質 或糖基化蛋白 產生部位 菌體內 菌體內或 分泌出細胞 分泌出細胞 培養(yǎng)方式 容易部分 容易可高產 較難、成本高 可獲高產 可高產 提 純 一般 菌體內稍復雜 簡單 產物活性 對原核者好 真核的接近天然 幾乎為天 真核者稍差 然產物 潛在危險性 不大 不大 需注意 有致癌因素,3.7 基因工程
22、菌的穩(wěn)定性及發(fā)酵,一.質粒不穩(wěn)定產生的原因 質粒分裂不穩(wěn)定:出現不含質粒子代菌 頻率:增加質??截悢?比生長速度:太高質??截悢档木L 得慢 質粒結構不穩(wěn)定:外源基因從質粒上丟失或突變,二.提高質粒穩(wěn)定性的方法,1.兩階段培養(yǎng)法: 37度長菌(復制); 42度誘導表達或IPTG/乳糖誘導表達。,菌體生長外源基因不表達菌體生長至一定濃度 誘導外源基因表達減小重組菌與質粒丟失菌的比生長速率的差異增加質粒穩(wěn)定性,2.培養(yǎng)基中加入選擇壓力: 在培養(yǎng)基中加入選擇壓力(抗生素)以抑制質粒丟失菌的生長 3.改變培養(yǎng)條件: 溫度、pH、溶解氧等條件 由于含質粒的菌對發(fā)酵環(huán)境反應慢于質粒丟失菌,間歇改變培養(yǎng)條件可改變兩種菌的比生長速率,從而提高質粒的穩(wěn)定性。,三. 基因工程菌發(fā)酵,基因工程菌的培養(yǎng)程序: 1.小型的搖瓶培養(yǎng)操作摸索工程菌生長的基
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