基因工程制藥-3-表達(dá)

1、,第三章 基因工程制藥,3.5 目的基因表達(dá),合成目的基因產(chǎn)物包括轉(zhuǎn)錄、翻譯、加工等過程，首先使目的基因編碼序列在RNA聚合酶催化下轉(zhuǎn)錄成mRNA，mRNA與核糖體結(jié)合，由tRNA將氨基酸引入，按mRNA的遺傳信息翻譯為多肽。通常，新生多肽需經(jīng)過翻譯后加工，如糖基化、磷酸化等才能成為有功能的蛋白。,Gene Vector Host cell DNA mRNA protein,tet四環(huán)素誘導(dǎo)產(chǎn)生的a-synuclein蛋白質(zhì),一. 宿主細(xì)胞的選擇,對(duì)宿主細(xì)胞的要求： 容易獲得較高濃度的細(xì)胞，能利用價(jià)廉易得原料，不產(chǎn)生內(nèi)毒素、不致病，需氧低，發(fā)熱量低，適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵溫度，易進(jìn)行代謝調(diào)控，易進(jìn)行DNA

2、重組技術(shù)操作，產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)率高，易進(jìn)行分離純化等。 宿主細(xì)胞有兩類： 原核細(xì)胞表達(dá)體系（大腸桿菌、枯草芽孢桿 菌、鏈霉菌）； 真核細(xì)胞表達(dá)體系（酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞）,1.原核細(xì)胞表達(dá)體系,大腸桿菌(Eschertchia coli) 研究的比較多，技術(shù)成熟； 操作方便；成本低； 不存在翻譯后修飾作用，對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)物不能糖基化； 枯草芽孢桿菌 分泌能力強(qiáng)；具有若干種有價(jià)值的信號(hào)肽序列 鏈霉菌 分泌能力強(qiáng)，安全不致?。槐磉_(dá)的蛋白基本能正確折疊,不形成包涵體,EPO能否在本體系進(jìn)行表達(dá)?,異源和同源蛋白在芽孢桿菌表達(dá)的實(shí)例,2.真核細(xì)胞表達(dá)體系,(1)酵母表達(dá)體系 eg.乙肝，干擾素等 主要優(yōu)點(diǎn)：

3、強(qiáng)啟動(dòng)子可促使外源基因達(dá)到高效表達(dá),如明 膠表達(dá)量可高達(dá)14.8g/L; 高密度培養(yǎng), 可使菌絲干重達(dá)到100g/L甚至 更高； 表達(dá)的蛋白可進(jìn)行折疊和翻譯后修飾; 外分泌表達(dá)，雜蛋白較少,產(chǎn)物易純化。,外源基因在畢赤酵母表達(dá)的實(shí)例,(2)絲狀真菌,強(qiáng)分泌蛋白質(zhì)的能力， 能正確進(jìn)行翻譯后加工（剪切、糖基化）， 曲霉被確認(rèn)是安全菌株，有成熟的發(fā)酵和后處理工藝,2.真核細(xì)胞表達(dá)體系,(3)哺乳動(dòng)物細(xì)胞,中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)和猴腎細(xì)胞(COS)使用最多 ； 優(yōu)點(diǎn): 能識(shí)別和剪切外源基因中的內(nèi)含子并加工為成熟的mRNA，產(chǎn)物類似或接近天然產(chǎn)物；表達(dá)產(chǎn)物分泌到細(xì)胞外，使產(chǎn)物純化更加容易。 缺點(diǎn)：

4、動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)周期長，培養(yǎng)條件苛刻等,二. 大腸桿菌中的基因表達(dá),大腸桿菌應(yīng)用最廣泛、最成功的表達(dá)體系，常常作為高效表達(dá)的首選體系,1.載體,載體的作用是把外源DNA帶進(jìn)宿主細(xì)胞，并使之在細(xì)胞內(nèi)建立穩(wěn)定的遺傳狀態(tài)，在細(xì)胞內(nèi)繁殖、傳代或進(jìn)行表達(dá)。 載體主要有質(zhì)粒、粘性末端質(zhì)粒、噬菌體和病毒。 載體按照其用途可分為：克隆載體、表達(dá)載體、轉(zhuǎn)移載體、探針載體。,(1)表達(dá)載體需要具備的條件,1、能夠獨(dú)立復(fù)制，復(fù)制能力強(qiáng)，多用松弛型； 2、具有靈活的多克隆位點(diǎn)； 3、具有方便的篩選標(biāo)記； 4、具有很強(qiáng)的啟動(dòng)子，能為大腸桿菌的RNA 聚合酶識(shí)別； 5、具有很強(qiáng)的終止子； 6、mRNA必須具有翻譯的起始信號(hào)，

5、即起始密碼 AUG和SD序列； 7、一般具有阻遏子，使啟動(dòng)子受到控制,表達(dá)載體的基本結(jié)構(gòu),(2)基因工程藥物常用的表達(dá)載體,pBV220(3.66kb)系統(tǒng)， pET系統(tǒng),pBV220表達(dá)系統(tǒng),pBV220系統(tǒng)組成: pUC8的多克隆位點(diǎn)、核糖體rrnB基因終止信號(hào)、pBR322第42453735位、pUC18第2066680位、 噬菌體cIts857抑制子基因及PR啟動(dòng)子、pRC23的PL啟動(dòng)子及SD序列,優(yōu)點(diǎn): cIts857抑制子基因與PL啟動(dòng)子同在,以便選用蛋白酶活低的宿主細(xì)胞,使表達(dá)產(chǎn)物不易降解; SD序列后面緊跟多克隆位點(diǎn),便于插入帶起始ATG的外源基因,可表達(dá)非融合蛋白; 強(qiáng)的轉(zhuǎn)

6、錄終止信號(hào)可防止出現(xiàn)“通讀”現(xiàn)象, 質(zhì)粒小,有利于增加其拷貝數(shù)及容量,可以插入較大片段的外源基因; PR與PL啟動(dòng)子串聯(lián),可以增強(qiáng)啟動(dòng)作用。本系統(tǒng)為溫度誘導(dǎo),外源基因表達(dá)量可達(dá)到細(xì)胞總蛋白的20%-30%, 包涵體形式存在, 不易被降解,均一性好。,pBG-2是pBV220系統(tǒng)衍生的便于產(chǎn)物純化的融合表達(dá)載體； 插入proteinG的IgG Fc結(jié)合區(qū)基因片段180個(gè)堿基對(duì),下游是多克隆位點(diǎn),引入了剪切融合蛋白的切點(diǎn),具有與IgG結(jié)合的活性,可方便地在分離中用固定化的IgG進(jìn)行親和層析,簡化了下游處理工藝。質(zhì)粒中有目的基因融合位點(diǎn)及蛋白剪切位點(diǎn),使目的基因產(chǎn)物純化后能恢復(fù)到天然狀態(tài)。,融合表達(dá)

7、質(zhì)粒pBG-2的結(jié)構(gòu),pET系統(tǒng),LB培養(yǎng)基或M9培養(yǎng)基中生長良好； 產(chǎn)物以包涵體形式存在于細(xì)胞內(nèi) 外源基因最大表達(dá)量可占細(xì)胞總蛋白的50%。中試生產(chǎn)中,可以用乳糖代替IPTG作為誘導(dǎo)劑, 降低發(fā)酵成本； 新的PET系統(tǒng)帶有his標(biāo)記, 標(biāo)記與克隆位點(diǎn)之間有酶切割位點(diǎn),使產(chǎn)物能方便地使用金屬整合物分離材料進(jìn)行分離,一步達(dá)到高純度、高收率。,pRSET,2.影響目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素,（1）外源基因的拷貝數(shù):高拷貝的表達(dá)質(zhì)粒 （2）外源基因的表達(dá)效率： 強(qiáng)啟動(dòng)子 核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）有效性 SD序列和起始密碼ATG的間距 選擇偏愛的密碼子 （3）表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定性,不易被降解 （4）細(xì)胞

8、的代謝負(fù)荷：防止表達(dá)產(chǎn)物的毒性 （5）優(yōu)化工程菌的培養(yǎng)條件,3.真核基因在Ecoli.中的表達(dá)形式,融合蛋白形式 非融合蛋白形式 分泌型表達(dá) 包涵體形式,(1) 以融合蛋白形式表達(dá)藥物基因,原核序列 + 真核序列（目的基因） N-短的原核多肽 + 真核蛋白(目的蛋白) -C,融合蛋白載體示意圖,融合蛋白進(jìn)行位點(diǎn)特異性 裂解的方法,（1）化學(xué)裂解 可采用諸如溴化氰（Met）、BNPS-3-甲基吲哚（Trp）、羥胺（AsnGly）等試劑或低pH（AspPro）來進(jìn)行融合蛋白的化學(xué)裂解。 （2）酶解 溫和；高度專一性。 有用的酶有：凝血酶、腸激酶、Xa因子、凝乳酶、膠原酶等。這些酶都具有較長的底物識(shí)

9、別序列（比如在凝乳酶中為7個(gè)氨基酸），從而降低了蛋白質(zhì)中其他無關(guān)部位發(fā)生斷裂的可能性。 腸激酶和凝血酶應(yīng)用最多，因?yàn)樗鼈兦懈罡髯缘淖R(shí)別序列的羧基端，就使帶有天然氨基端的被融合部分得以釋放。,以CNBr處理去除融合多肽示意圖,凝血因子Xa切割融合蛋白示意圖,GST融合表達(dá)載體 pGEX6p-3,GST純化 例,上清液加入1mL 50%的谷胱甘肽-瓊脂糖珠混懸液中，室溫下輕輕混勻超過2min。加50mL冰浴預(yù)冷的PBS液洗滌，混勻， 500g離心10s。用PBS液洗滌2次，用12mL冰冷的PBS重懸瓊脂糖珠，并移入一個(gè)1.5mL微量離心管中。 室溫下500g離心10s收集瓊脂糖珠，棄上清液。加1m

10、L GST洗脫緩沖液（50mmol/L TrisCl，pH8.0/ 5mmol/L還原型谷胱甘肽）洗脫融合蛋白?；靹?min,500g離心10s，收集上清液。重復(fù)洗脫二三次，經(jīng)SDS-PAGE分析各分部收集的樣品。洗脫的蛋白質(zhì)分成小份，加甘油10%貯存于-70。,(2) 藥物蛋白基因的非融合表達(dá),表達(dá)非融合蛋白的操縱子: 細(xì)菌或噬菌體的啟動(dòng)子一細(xì)菌的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(SD序列)一真核基因的起始密碼子一結(jié)構(gòu)基因一終止密碼。 要求：SD序列與翻譯起始密碼ATG之間的距離要合適 特點(diǎn)：非融合蛋白能夠較好地保持原來的蛋白活性；容易被蛋白酶破壞；非融合蛋白N末端帶有甲硫氨酸,可能引起人體免疫反應(yīng)。,（3）

11、藥物蛋白基因的分泌型表達(dá),細(xì)胞外膜蛋白、周質(zhì)蛋白、內(nèi)膜蛋白以帶有N-端信號(hào)肽的前體形式在細(xì)胞質(zhì)中合成，隨后穿膜運(yùn)送到周質(zhì)或定位到內(nèi)、外膜上。在穿膜的過程中，信號(hào)肽被信號(hào)肽酶切除。 信號(hào)肽 + 外源基因,蛋白質(zhì)的分泌表達(dá)的優(yōu)點(diǎn),A.信號(hào)肽被切除后生成的蛋白質(zhì)的N-末端氨基酸殘基和天然的產(chǎn)物是一致的； B.周質(zhì)空間中的蛋白酶的活性要比胞質(zhì)中的低，這使所表達(dá)的蛋白能穩(wěn)定的存在于周質(zhì)中； C.周質(zhì)中只有少量的細(xì)菌蛋白，它們僅占細(xì)菌總蛋白的4%，使得重組蛋白更易純化； D.周質(zhì)空間中提供了一個(gè)氧化的環(huán)境，更有利于二硫鍵的正確形成。,信號(hào)肽序列,信號(hào)肽：15-30個(gè)疏水Aa殘基組成，N-端的小段肽鏈?zhǔn)且詭?/p>

12、正電荷的賴氨酸和精氨酸為特征，隨后是以疏水Aa為主的肽段，在鄰近切割位點(diǎn)處常有幾個(gè)側(cè)鏈很短的氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸等。 N端帶正電荷的一段：有助于新生肽鏈與帶負(fù)電荷的細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)合； 疏水肽段：能形成-螺旋結(jié)構(gòu)，兩段螺旋以反平行的方式形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)之后，容易進(jìn)入內(nèi)膜的脂雙層； 鄰近切割位點(diǎn)的氨基酸：傾向于形成-折疊，這可能是信號(hào)肽酶所識(shí)別的結(jié)構(gòu)。 信號(hào)肽后面的氨基酸：也影響蛋白質(zhì)的穿膜和隨后的切割。,實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)的條件,合適的信號(hào)肽(堿性磷酸酶信號(hào)肽(phoA)、膜外周質(zhì)蛋白信號(hào)肽(OmpA)、霍亂弧菌毒素B亞單位(CTXB)等)； 培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度影響著分泌的速度，分泌速度又與蛋白質(zhì)的正確折

13、疊有關(guān)； 啟動(dòng)子的強(qiáng)度和誘導(dǎo)劑的濃度也有影響； 目前普遍接受的觀點(diǎn)： 低溫，低強(qiáng)度的啟動(dòng)子和較低濃度的誘導(dǎo)劑，可能實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)。 不同的菌種，分泌的效果也不同。,例：瘦素Leptin的分泌表達(dá),當(dāng)細(xì)胞在37培養(yǎng)時(shí)，在一定的IPTG濃度下，包涵體達(dá)Leptin總量的75-90%； 當(dāng)在30培養(yǎng)時(shí)，大部分的Leptin則能以可溶的形式生成，可溶蛋白占總目的蛋白的85-92%，然而與37條件相比總目的蛋白的量卻減少了30-40%。 利用低濃度的IPTG誘導(dǎo)可提高可溶蛋白的含量。,包涵體是指在某些生長條件下，大腸桿菌能積累某些特殊的生物大分子(主要是蛋白質(zhì)組成)，它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)致密地聚集成沒有生物活性的

14、直徑約0.1-3.0m的固體顆粒，或被膜包裹或形成無膜裸露結(jié)構(gòu)。 包涵體主要由蛋白質(zhì)組成，其中大部分是克隆外源基因的表達(dá)產(chǎn)物。,(4)蛋白質(zhì)的包涵體形式表達(dá)與蛋白質(zhì)復(fù)性,包涵體形式表達(dá) 不可溶、無生物活性的包涵體必須經(jīng)過變性、復(fù)性才能獲得天然結(jié)構(gòu)、生物活性。 選擇一個(gè)合適的復(fù)性過程來實(shí)現(xiàn)正確的蛋白質(zhì)折疊（protein folding），獲得生物活性，是基因工程的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。,包涵體的優(yōu)勢(shì) 有利于防止蛋白酶對(duì)表達(dá)蛋白的降解 有利于表達(dá)產(chǎn)物的分離純化（通過高速離心即可將包涵體從細(xì)胞裂解物中分離出來） 減少對(duì)宿主菌的毒害,包涵體形成的原因,重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白，由于缺少真核生物中翻譯后修飾

15、所需的酶類，致使中間體大量積累，容易形成包涵體沉淀。 缺乏蛋白質(zhì)折疊過程中需要的某些酶和輔助因子，或環(huán)境不適，無法形成正確的次級(jí)鍵等，也是原因之一。 表達(dá)量越高越容易形成包涵體?？赡芤?yàn)楹铣伤俣忍?，以至于沒有足夠的時(shí)間進(jìn)行折疊，二硫鍵不能正確配對(duì)，過多的蛋白間可能存在非特異性結(jié)合，蛋白質(zhì)無法達(dá)到足夠的溶解度等。,減少包涵體形成的策略,（1）降低重組菌的生長溫度。 （2）促進(jìn)重組蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)的生長添加劑：高濃度的多醇類、蔗糖可以阻止分泌到周質(zhì)的蛋白質(zhì)的聚集反應(yīng)。其它添加劑還有乙醇（誘導(dǎo)熱休克蛋白的表達(dá)）、低分子量的巰基或二硫化合物（改變細(xì)胞周質(zhì)的還原態(tài)，影響二硫鍵的形成）等。 （3）供給豐

16、富的培養(yǎng)基，創(chuàng)造最佳條件，如供 氧、pH。,包涵體蛋白的分離、純化,包涵體的形成不僅可獲得高表達(dá)、高純度的重組蛋白質(zhì)，還可避免細(xì)胞水解酶對(duì)重組蛋白質(zhì)的破壞。 由于包涵體是蛋白質(zhì)聚集而成的致密顆粒，分離的第一步是對(duì)培養(yǎng)收集的細(xì)胞進(jìn)行破碎，有效的方法是高壓勻漿結(jié)合溶菌酶處理，然后500020000g離心，可使大部分包涵體沉淀與可溶性蛋白分離。 包涵體沉淀需用去污劑（Triton X-100或脫氧膽酸鈉）和低濃度變性劑（2mol/L尿素或鹽酸胍）洗滌除去脂類和膜蛋白，否則會(huì)導(dǎo)致包涵體溶解和復(fù)性的過程中重組蛋白質(zhì)的降解。,包涵體的溶解,用很強(qiáng)的變性劑，如8mol/L尿素、68mol/L鹽酸胍，通過離子

17、間的相互作用破壞包涵體蛋白間的氫鍵而增溶蛋白。 對(duì)于含有半胱氨酸的蛋白，在增溶時(shí)應(yīng)加入還原劑（如巰基保護(hù)劑DTT、-ME）打開蛋白質(zhì)中所有二硫鍵。,復(fù)性-蛋白質(zhì)折疊,蛋白質(zhì)折疊涉及兩種疏水作用，一是分子內(nèi)的疏水相互作用，可促進(jìn)蛋白質(zhì)正確折疊；一是部分折疊的肽鏈分子間的疏水相互作用，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集。聚集過程與復(fù)性過程相互競爭。 蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)雖然由其氨基酸的順序決定，然而伸展肽鏈折疊為天然活性結(jié)構(gòu)的過程還受到周圍環(huán)境，如溫度、pH值、離子強(qiáng)度等因素的影響。,復(fù)性方法,透析、超濾和稀釋復(fù)性法(最傳統(tǒng)也應(yīng)用最普遍的蛋白質(zhì)折疊復(fù)性方法) 透析法耗時(shí)長，易形成無活性蛋白質(zhì)聚集體； 超濾法在膜上聚集變

18、性，易造成膜污染； 稀釋法處理量太大，不利于工業(yè)放大。,ULTRALAB SYSTEM,復(fù)性方法,添加促進(jìn)劑的復(fù)性方法 A.共溶劑：如PEG6000 - 20000，阻止蛋白 質(zhì)分子間的相互碰撞機(jī)會(huì)； B.去污劑及表面活性劑：如Triton X-100、磷脂等對(duì)蛋白質(zhì)復(fù)性有促進(jìn)作用，但它們能與蛋白質(zhì)結(jié)合，很難去除；,復(fù)性方法,C.氧化-還原劑：如DTT等，通過促進(jìn)不正確形成的二硫鍵快速交換反應(yīng)，提高了正確配對(duì)的二硫鍵的產(chǎn)率；,復(fù)性方法,D.分子伴侶和折疊酶： 分子伴侶: 結(jié)合和穩(wěn)定另外一種蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定構(gòu)象，促進(jìn)新生多肽鏈的折疊、多聚體的裝配。 折疊酶: 二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)、脯氨酸異構(gòu)酶等

19、。 這類蛋白在折疊復(fù)性后要除去，而且十分昂貴。,復(fù)性方法,E.單克隆抗體：待折疊復(fù)性的蛋白質(zhì)的抗體可有效協(xié)助復(fù)性，但只限于此蛋白。 F.其它：甘油可以增加黏度，減少分子碰撞的機(jī)會(huì)，減少錯(cuò)配以提高復(fù)性效率；適量的鹽濃度可以降低某些帶電基團(tuán)間的斥力，有利于蛋白質(zhì)的折疊。,復(fù)性方法,液相色譜（LC）復(fù)性法最有效的純化蛋白質(zhì)的方法 液相色譜復(fù)性的優(yōu)點(diǎn)： 色譜固定相對(duì)變性蛋白質(zhì)的吸附可明顯的減少變性蛋白質(zhì)在脫離變性劑環(huán)境后的分子聚集，從而避免了沉淀的產(chǎn)生； 在蛋白質(zhì)復(fù)性的同時(shí)，可使目標(biāo)蛋白與雜蛋白分離,復(fù)性方法,疏水相互作用色譜（HIC）、離子交換色譜（IEC）、凝膠排阻色譜（SEC）、親和色譜（AFC

20、）已成功的對(duì)變性蛋白進(jìn)行了復(fù)性。 在4種色譜法中，SEC的分離效果是LC中最差的，AFC使用范圍窄、所需時(shí)間長、價(jià)格昂貴，HIC是較為理想的方法。,三. 基因在酵母中的高效表達(dá),兩個(gè)比較重要的酵母表達(dá)系統(tǒng)： 釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng) 嗜甲醇酵母（巴氏畢赤酵母，Pichia pastoris）表達(dá)系統(tǒng),1.釀酒酵母表達(dá)載體,a-因子分泌型表達(dá)載體,真核細(xì)胞表達(dá)載體示意圖,2.影響目的基因在酵母中表達(dá)的因素,（1）外源基因的拷貝數(shù) （2）外源基因的表達(dá)效率 啟動(dòng)子（組成型和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子） 分泌信號(hào)的效率 終止序列的影響 （3）外源蛋白的糖基化： 酵母細(xì)胞分泌的異源蛋白糖基化產(chǎn)物與天然產(chǎn) 物完全相同，是生產(chǎn)

21、醫(yī)用蛋白質(zhì)的重要手段。 （4）宿主菌株的影響,四. 動(dòng)物細(xì)胞中的基因表達(dá),哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)(CHO 細(xì)胞),（將在動(dòng)物細(xì)胞制藥中講解）,五.比較大腸桿菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞 3類主要基因工程表達(dá)體系 表達(dá)體系 大腸桿菌 酵 母 哺乳動(dòng)物細(xì)胞 產(chǎn) 物 多肽、蛋白質(zhì) 多肽、蛋白質(zhì) 完整糖基化蛋白 或融合蛋白質(zhì) 或糖基化蛋白 產(chǎn)生部位 菌體內(nèi) 菌體內(nèi)或 分泌出細(xì)胞 分泌出細(xì)胞 培養(yǎng)方式 容易部分 容易可高產(chǎn) 較難、成本高 可獲高產(chǎn) 可高產(chǎn) 提 純 一般 菌體內(nèi)稍復(fù)雜 簡單 產(chǎn)物活性 對(duì)原核者好 真核的接近天然 幾乎為天 真核者稍差 然產(chǎn)物 潛在危險(xiǎn)性 不大 不大 需注意 有致癌因素,3.7 基因工程

22、菌的穩(wěn)定性及發(fā)酵,一.質(zhì)粒不穩(wěn)定產(chǎn)生的原因 質(zhì)粒分裂不穩(wěn)定：出現(xiàn)不含質(zhì)粒子代菌 頻率：增加質(zhì)?？截悢?shù) 比生長速度：太高質(zhì)粒拷貝數(shù)的菌長 得慢 質(zhì)粒結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定：外源基因從質(zhì)粒上丟失或突變,二.提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法,1.兩階段培養(yǎng)法: 37度長菌（復(fù)制）; 42度誘導(dǎo)表達(dá)或IPTG/乳糖誘導(dǎo)表達(dá)。,菌體生長外源基因不表達(dá)菌體生長至一定濃度 誘導(dǎo)外源基因表達(dá)減小重組菌與質(zhì)粒丟失菌的比生長速率的差異增加質(zhì)粒穩(wěn)定性,2.培養(yǎng)基中加入選擇壓力: 在培養(yǎng)基中加入選擇壓力(抗生素)以抑制質(zhì)粒丟失菌的生長 3.改變培養(yǎng)條件: 溫度、pH、溶解氧等條件 由于含質(zhì)粒的菌對(duì)發(fā)酵環(huán)境反應(yīng)慢于質(zhì)粒丟失菌,間歇改變培養(yǎng)條件可改變兩種菌的比生長速率,從而提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性。,三. 基因工程菌發(fā)酵,基因工程菌的培養(yǎng)程序： 1.小型的搖瓶培養(yǎng)操作摸索工程菌生長的基