PikoReal使用培訓(xùn)-致病菌檢測

1、PikoReal 熒光定量PCR使用培訓(xùn) 致病菌檢測,內(nèi)容： 1、熒光定量PCR基本原理介紹 2、PikoReal 功能簡介 3、致病菌檢測實驗操作及結(jié)果分析,PCR和定量PCR 基本知識介紹,生命的遺傳物質(zhì)DNA（少數(shù)物種為RNA），對于不同的物種來說，其堿基排列順序是獨一無二的 檢測不同生物中特異的DNA片段，就可以清楚的區(qū)分不同的生物。,中心法則,堿基配對原則,Polymerase Chain Reaction（PCR） 聚合酶鏈式反應(yīng),體外的DNA 復(fù)制 PCR 反應(yīng) 體外RNA 逆轉(zhuǎn)錄為CDNA RT- PCR 反應(yīng),通過PCR或RT-PCR反應(yīng)，就可累計大量的特異性目的片段，用于下

2、游的檢測和研究,Melting 94C,Primers Bind 58C,Extension 72C,PCR的基本原理,PCR的基本原理,Polymerase Chain Reaction（PCR） 聚合酶鏈式反應(yīng),在PCR反應(yīng)過程中，升溫，降溫交替進行，循環(huán)往復(fù) 熱循環(huán) 提供熱循環(huán)環(huán)境的儀器 熱循環(huán)儀（PCR儀）,Temperature,Time,Cycle 1,Cycle 2,PCR的基本原理,模板（DNA or RNA） DNA：從 animal, plant, bacteria, yeast, virus中抽提 RNA：抽提后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(也在PCR儀上完成） 引物（一對或多對）

3、脫氧核糖核苷酸 (dNTP原料) 熱穩(wěn)定的DNA聚合酶 Buffer （緩沖液提供適合的酶作用環(huán)境） 反應(yīng)體系：5 - 50ul （常用）,PCR的基本原理,PCR 反應(yīng)體系,PCR kit,PCR的基本原理,PCR實驗流程圖: A,模板，引物,dNTP, 緩沖液,DNA聚合酶,上樣,PCR反應(yīng),PCR的基本原理,PCR實驗流程圖: B,PCR產(chǎn)物電泳，EB染色,兩種產(chǎn)物,兩對特定引物擴增的片段,多種產(chǎn)物,非特異性引物擴增出一系列片段,PCR實驗流程圖: C,PCR的基本原理,凝膠成像系統(tǒng)成像，定終產(chǎn)物濃度 半定量,PCR是當(dāng)今應(yīng)用最廣泛的生物技術(shù)之一 幾乎所有的分子生物學(xué)實驗室，藥物研發(fā)中心

4、，臨床診斷實驗室都在使用PCR技術(shù)，而且還有新的應(yīng)用方向不斷開發(fā)出來 幾個重要的應(yīng)用領(lǐng)域: 科學(xué)研究 醫(yī)學(xué)研究及診斷 法醫(yī)鑒定 食品檢驗,PCR應(yīng)用,PCR技術(shù)的優(yōu)點與缺點,缺點： 擴增與檢測分開進行 繁瑣 使用熒光染料EB檢測DNA 有毒 不同實驗室之間結(jié)果沒有可比性 通量太低,擴增,檢測,PCR技術(shù)的優(yōu)點與缺點,缺點： 很難準確得到樣本內(nèi)模板DNA或RNA的量 終點的產(chǎn)物量不一定能如實反應(yīng)和起始模板量的對應(yīng)關(guān)系,相同模板在同一臺PCR儀上相同條件下重復(fù)96次擴增的擴增曲線圖,PCR反應(yīng)進入平臺期，合成新鏈的原料開始不足，酶的活力也下降，導(dǎo)致新增DNA的量增長緩慢，最后停止增長。,熒光定量P

5、CR 基本原理 熒光染料和探針 應(yīng)用介紹,光源,熒光定量PCR 基本原理,熱循環(huán)儀,探測器,可以實時檢測出每輪循環(huán)的PCR產(chǎn)物量,加入熒光染料的PCR體系,模板，引物,dNTP, 緩沖液,DNA聚合酶和熒光探針或熒光染料,在體系中原料充足的情況下，產(chǎn)物按固定倍數(shù)呈指數(shù)增長 指數(shù)增長期間，初始模板濃度不同的樣品的擴增曲線彼此平行,同時擴增梯度稀釋的同一樣品（已知濃度）,擴增曲線循環(huán)數(shù)與初始模板濃度的對數(shù)值成線性關(guān)系,Cq,熒光定量PCR 基本原理,未知濃度樣品,Cq = - k lg X0 + b,標準曲線：,區(qū)別： 普通PCR：可以粗略定出反應(yīng)結(jié)束時終產(chǎn)物的量- 半定量 熒光定量PCR儀：可以

6、精確測量出初始模板量,熒光定量PCR 熒光染料和探針,非特異性的熒光染料 SYBR Green I 特異性的熒光探針 TaqMan,SYBR-Green I,非特異性熒光染料 SYBR- Green,SYBR-Green I,非特異性熒光染料 SYBR- Green,融解曲線分析（Tm）,非特異性熒光染料 SYBR- Green,Tm：50%的DNA產(chǎn)物解鏈時的溫度 一種DNA片段只有一個特定的Tm，所以通過溶解曲線分析，可以檢驗擴增的產(chǎn)物是否是目的片段,Tm,非特異性熒光染料 SYBR- Green,應(yīng)用列舉：酵母菌檢測,根據(jù)Tm值判斷是否是酵母菌,Sequence Specific Pro

7、bes: Taqman probes,特異性熒光探針 Taqman probes,特異性熒光探針 Taqman probes,常用的標記探針的染料： 第一通道：FAM 第二通道：HEX 第三通道：Rox 第四通道：CY5,致病微生物： 沙門氏菌 金黃色葡萄球菌 單核細胞增生李斯特氏桿菌 腸毒素大腸桿菌 阪崎腸桿菌 彎曲桿菌（禽類） 肉毒梭菌 志賀氏菌 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、 霍亂弧菌 副溶血弧菌 創(chuàng)傷弧菌等 均能把3-5天的檢測時間縮短到一天之內(nèi),特異性熒光探針 Taqman probes,單重和多重?zé)晒舛縋CR 單通道（單色）：一個PCR管里只做一個基因定量（多用SybrGreen） 雙通道

8、（兩色）：一個PCR管里做兩個基因的定量 多通道（多色）：一個PCR管里做三個以上基因定量,常用,FAM,HEX,PikoReal 功能簡介,研發(fā)生產(chǎn)中心：位于芬蘭Espoo,光源: 5x LED 壽命長，終身無需更換，為qPCR實驗提供持續(xù)，穩(wěn)定的激發(fā)信號 無需使用ROX染料進行光強校正 探測器：CCD 相機 能同時快速收集整板多重?zé)晒庑盘枖?shù)據(jù) 高靈敏度 PCR模塊：96孔半導(dǎo)體PCR,PikoREAL 的硬件系統(tǒng):,功能：,絕對定量,雙探針法,HRM法,相對定量,基因型分析,熔解曲線分析,選配模塊,五通道四色：,一個反應(yīng)管里最多可同時檢測4種不同的致病菌核酸,儀器特點： 1、硬件組合優(yōu)越，

9、設(shè)計創(chuàng)新 2、更加適合5-10ul小反應(yīng)體系，成倍節(jié)省實驗成本 3、小巧、快速、穩(wěn)定、安靜無聲,致病菌檢測實驗操作及結(jié)果分析,檢測流程,25g 或25ml 樣品 225ml預(yù)增菌培養(yǎng)液，混勻 ，適宜的溫度下培養(yǎng)24小時,取1ml培養(yǎng)液，加入裂解液，裂解細菌，釋放核酸（45min）,配制標準品，PCR反應(yīng)液，加樣（30min）,定量PCR反應(yīng)，查看并分析結(jié)果（1.5h）,陰性：出結(jié)果報告,陽性：繼續(xù)用培養(yǎng)法驗證結(jié)果,兩天內(nèi)可出結(jié)果,OXOID 常用預(yù)增菌培養(yǎng)液：,賽默飛咨詢熱線：8008105118,1、預(yù)增菌 按說明書操作,2、細菌裂解，配制反應(yīng)液及上樣,1）細菌裂解：獲得待測樣品。 2）配制

10、標準品：陰性對照樣品，陽性對照樣品（4個濃度） 3）按檢測樣品量計算所需反應(yīng)液的量 4）配制所需反應(yīng)液，混合均勻 5）把反應(yīng)液加入反應(yīng)板，并分別在相應(yīng)的孔加入陰性對照樣品、陽性對照樣品，待測樣品。,以下操作均按照檢測試劑盒操作說明書進行：,檢測試劑開放，可選擇各國產(chǎn)及進口廠家試劑盒,以金黃色葡萄球菌的檢測為例,1、樣品預(yù)增菌 25g 或 25ml 樣品 10%氯化鈉胰蛋白胨大豆肉湯 37度，24小時 金黃色葡萄球菌：Staphylococcus Aureus (SA),以金黃色葡萄球菌的檢測為例,2、細菌裂解，樣品制備 A、取1ml 培養(yǎng)液，13000rpm 離心2分鐘 B、去上清液，加入10

11、0ul DNA提取液充分混勻 C、沸水浴加熱10分鐘（誤差不超過1分鐘） D、13000rmp 離心5分鐘，上清液備用（樣品）,試劑盒：Liferiver 金黃色葡萄球菌核酸檢測試劑盒（熒光法） 生產(chǎn)商：上海之江生物科技 貨號：DD004102,3、梯度標準品配制 A、內(nèi)部對照：取內(nèi)部對照品4ul，加36ul水，震蕩混勻后，3000rmp離心10秒，備用。 B、10倍稀釋標準品（如只需出陰陽性結(jié)果，則無需配制系列濃度的陽性標準品） 1）取4只2ml離心管，分別標記為：2、3、4、5 （濃度依次為：5106 、 5105 、 5104 、 5103 拷貝/ml) 。 2）各管中分別加入36ul水

12、 3）取4ul 陽性對照品加入1號管中，震蕩混勻后取4ul加入2號管，2號管震蕩混勻后取4ul加入3號管。依此處理4號管。,4、反應(yīng)液配制1（絕對定量法用) 計算所需各反應(yīng)液成分，按下表量加入2ml離心管，震蕩混合均勻 絕對定量標準品 ：5 (5個濃度，可定量出未知樣品拷貝數(shù)） 陰性對照：1 未知樣品：n （n為未知樣品數(shù)）, 110 是指多配10，以補償配制和加樣過程中的損耗 如每個樣品需要做2個或3個重復(fù)，則在各算式后再乘2或3即可,4、反應(yīng)液配制1 (陰陽性判定法用) 計算所需各反應(yīng)液成分，按下表量加入2ml離心管，震蕩混合均勻，3000rmp離心10秒，備用。 絕對定量標準品 ：1 (

13、1個濃度，作為陽性參照） 陰性對照：1 未知樣品：n （n為未知樣品數(shù)）, 110 是指多配10，以補償配制和加樣過程中的損耗 如每個樣品需要做2個或3個重復(fù)，則在各算式后再乘2或3即可,5、上樣 A、取一片96孔Piko板，放入上樣輔助儀，每孔加入反應(yīng)液18ul B、取裂解的樣品，加入un 孔，每種樣品1孔；取稀釋號的標準品，依次加入最后一列的孔中。在0孔中加入2ul水。,樣品排列建議：S - 陽性標準品、0 陰性對照、un 未知樣品,6、覆膜，離心，放入qPCR,7、設(shè)置程序，點擊Run啟動PCR反應(yīng),編程 雙擊桌面儀器圖標，打開軟件,2、點擊New，新建一個運行文件，點擊Protocol

14、，進入程序編輯界面,編程,選中以上各步，可以修改，添加和刪除反應(yīng)步驟,點擊反白不需要檢測的染料，輸入反應(yīng)體系。,編程,添加新循環(huán),添加溶解曲線檢測,上下移動或刪除反應(yīng)步驟,輸入或輸出反應(yīng)程序,開始運行程序,添加一個反應(yīng)步驟,添加數(shù)據(jù)采集步驟,編程,參數(shù)修改,左邊選中要修改的步驟，右邊相應(yīng)的框中修改溫度和時間 如要修改升降溫速率，熱蓋溫度，點擊“Advanced Properties”,點擊Run啟動PCR反應(yīng),狀態(tài)監(jiān)控,電腦監(jiān)控,隨時可以點擊HOME，回主界面編輯新程序，分析已有實驗結(jié)果?；蜻M入Plate Layout進行板式設(shè)置。,8、板布局,點擊Plate Layout，進入板布局界面，定

15、位樣品，輸入名稱，確定樣品屬性。- 程序運行前，運行中，運行結(jié)束均可進行設(shè)置和修改,告訴軟件各反應(yīng)孔的樣品信息,板布局,輸入樣品名稱等信息,樣品分組,孔信息拷貝，刪除，粘貼，取消,樣品模塊類型選擇,板布局輸入，輸出,選擇樣品屬性，分組，設(shè)重復(fù)，設(shè)標準曲線,設(shè)置復(fù)孔,板布局- 絕對定量,1、選擇所用染料 2、選擇樣品類型為Standard 3、打開復(fù)孔和標準曲線設(shè)置向?qū)?4、輸入復(fù)孔排列模式 5、輸入第一個樣品濃度（如1000000） 6、從左到右拖拽選中所有標準品孔，標準曲線設(shè)置即可完成。 7、未知樣品孔的設(shè)置和命名同相對定量,點擊,1,2,3,4,5,6,7,絕對定量 有梯度稀釋的標準品,陰陽性判定 只有一個標準品,9、結(jié)果分析,程序運行結(jié)束，Analysis 選項出現(xiàn)，點擊進入分析界面,結(jié)果分析主界面,分析種類選項欄,顯示每一次檢測的熒光強度數(shù)據(jù),顯示反應(yīng)曲線圖,程序運行日志,絕對定量和熔解曲線分析,選中Cq,點擊Absolute, 添加絕對定量標準曲線,絕