PikoReal使用培訓(xùn)-致病菌檢測_第1頁
PikoReal使用培訓(xùn)-致病菌檢測_第2頁
PikoReal使用培訓(xùn)-致病菌檢測_第3頁
PikoReal使用培訓(xùn)-致病菌檢測_第4頁
PikoReal使用培訓(xùn)-致病菌檢測_第5頁
已閱讀5頁,還剩60頁未讀, 繼續(xù)免費(fèi)閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進(jìn)行舉報或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡介

1、PikoReal 熒光定量PCR使用培訓(xùn) 致病菌檢測,內(nèi)容: 1、熒光定量PCR基本原理介紹 2、PikoReal 功能簡介 3、致病菌檢測實驗操作及結(jié)果分析,PCR和定量PCR 基本知識介紹,生命的遺傳物質(zhì)DNA(少數(shù)物種為RNA),對于不同的物種來說,其堿基排列順序是獨一無二的 檢測不同生物中特異的DNA片段,就可以清楚的區(qū)分不同的生物。,中心法則,堿基配對原則,Polymerase Chain Reaction(PCR) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),體外的DNA 復(fù)制 PCR 反應(yīng) 體外RNA 逆轉(zhuǎn)錄為CDNA RT- PCR 反應(yīng),通過PCR或RT-PCR反應(yīng),就可累計大量的特異性目的片段,用于下

2、游的檢測和研究,Melting 94C,Primers Bind 58C,Extension 72C,PCR的基本原理,PCR的基本原理,Polymerase Chain Reaction(PCR) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),在PCR反應(yīng)過程中,升溫,降溫交替進(jìn)行,循環(huán)往復(fù) 熱循環(huán) 提供熱循環(huán)環(huán)境的儀器 熱循環(huán)儀(PCR儀),Temperature,Time,Cycle 1,Cycle 2,PCR的基本原理,模板(DNA or RNA) DNA:從 animal, plant, bacteria, yeast, virus中抽提 RNA:抽提后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(也在PCR儀上完成) 引物(一對或多對)

3、脫氧核糖核苷酸 (dNTP原料) 熱穩(wěn)定的DNA聚合酶 Buffer (緩沖液提供適合的酶作用環(huán)境) 反應(yīng)體系:5 - 50ul (常用),PCR的基本原理,PCR 反應(yīng)體系,PCR kit,PCR的基本原理,PCR實驗流程圖: A,模板,引物,dNTP, 緩沖液,DNA聚合酶,上樣,PCR反應(yīng),PCR的基本原理,PCR實驗流程圖: B,PCR產(chǎn)物電泳,EB染色,兩種產(chǎn)物,兩對特定引物擴(kuò)增的片段,多種產(chǎn)物,非特異性引物擴(kuò)增出一系列片段,PCR實驗流程圖: C,PCR的基本原理,凝膠成像系統(tǒng)成像,定終產(chǎn)物濃度 半定量,PCR是當(dāng)今應(yīng)用最廣泛的生物技術(shù)之一 幾乎所有的分子生物學(xué)實驗室,藥物研發(fā)中心

4、,臨床診斷實驗室都在使用PCR技術(shù),而且還有新的應(yīng)用方向不斷開發(fā)出來 幾個重要的應(yīng)用領(lǐng)域: 科學(xué)研究 醫(yī)學(xué)研究及診斷 法醫(yī)鑒定 食品檢驗,PCR應(yīng)用,PCR技術(shù)的優(yōu)點與缺點,缺點: 擴(kuò)增與檢測分開進(jìn)行 繁瑣 使用熒光染料EB檢測DNA 有毒 不同實驗室之間結(jié)果沒有可比性 通量太低,擴(kuò)增,檢測,PCR技術(shù)的優(yōu)點與缺點,缺點: 很難準(zhǔn)確得到樣本內(nèi)模板DNA或RNA的量 終點的產(chǎn)物量不一定能如實反應(yīng)和起始模板量的對應(yīng)關(guān)系,相同模板在同一臺PCR儀上相同條件下重復(fù)96次擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線圖,PCR反應(yīng)進(jìn)入平臺期,合成新鏈的原料開始不足,酶的活力也下降,導(dǎo)致新增DNA的量增長緩慢,最后停止增長。,熒光定量P

5、CR 基本原理 熒光染料和探針 應(yīng)用介紹,光源,熒光定量PCR 基本原理,熱循環(huán)儀,探測器,可以實時檢測出每輪循環(huán)的PCR產(chǎn)物量,加入熒光染料的PCR體系,模板,引物,dNTP, 緩沖液,DNA聚合酶和熒光探針或熒光染料,在體系中原料充足的情況下,產(chǎn)物按固定倍數(shù)呈指數(shù)增長 指數(shù)增長期間,初始模板濃度不同的樣品的擴(kuò)增曲線彼此平行,同時擴(kuò)增梯度稀釋的同一樣品(已知濃度),擴(kuò)增曲線循環(huán)數(shù)與初始模板濃度的對數(shù)值成線性關(guān)系,Cq,熒光定量PCR 基本原理,未知濃度樣品,Cq = - k lg X0 + b,標(biāo)準(zhǔn)曲線:,區(qū)別: 普通PCR:可以粗略定出反應(yīng)結(jié)束時終產(chǎn)物的量- 半定量 熒光定量PCR儀:可以

6、精確測量出初始模板量,熒光定量PCR 熒光染料和探針,非特異性的熒光染料 SYBR Green I 特異性的熒光探針 TaqMan,SYBR-Green I,非特異性熒光染料 SYBR- Green,SYBR-Green I,非特異性熒光染料 SYBR- Green,融解曲線分析(Tm),非特異性熒光染料 SYBR- Green,Tm:50%的DNA產(chǎn)物解鏈時的溫度 一種DNA片段只有一個特定的Tm,所以通過溶解曲線分析,可以檢驗擴(kuò)增的產(chǎn)物是否是目的片段,Tm,非特異性熒光染料 SYBR- Green,應(yīng)用列舉:酵母菌檢測,根據(jù)Tm值判斷是否是酵母菌,Sequence Specific Pro

7、bes: Taqman probes,特異性熒光探針 Taqman probes,特異性熒光探針 Taqman probes,常用的標(biāo)記探針的染料: 第一通道:FAM 第二通道:HEX 第三通道:Rox 第四通道:CY5,致病微生物: 沙門氏菌 金黃色葡萄球菌 單核細(xì)胞增生李斯特氏桿菌 腸毒素大腸桿菌 阪崎腸桿菌 彎曲桿菌(禽類) 肉毒梭菌 志賀氏菌 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、 霍亂弧菌 副溶血弧菌 創(chuàng)傷弧菌等 均能把3-5天的檢測時間縮短到一天之內(nèi),特異性熒光探針 Taqman probes,單重和多重?zé)晒舛縋CR 單通道(單色):一個PCR管里只做一個基因定量(多用SybrGreen) 雙通道

8、(兩色):一個PCR管里做兩個基因的定量 多通道(多色):一個PCR管里做三個以上基因定量,常用,FAM,HEX,PikoReal 功能簡介,研發(fā)生產(chǎn)中心:位于芬蘭Espoo,光源: 5x LED 壽命長,終身無需更換,為qPCR實驗提供持續(xù),穩(wěn)定的激發(fā)信號 無需使用ROX染料進(jìn)行光強(qiáng)校正 探測器:CCD 相機(jī) 能同時快速收集整板多重?zé)晒庑盘枖?shù)據(jù) 高靈敏度 PCR模塊:96孔半導(dǎo)體PCR,PikoREAL 的硬件系統(tǒng):,功能:,絕對定量,雙探針法,HRM法,相對定量,基因型分析,熔解曲線分析,選配模塊,五通道四色:,一個反應(yīng)管里最多可同時檢測4種不同的致病菌核酸,儀器特點: 1、硬件組合優(yōu)越,

9、設(shè)計創(chuàng)新 2、更加適合5-10ul小反應(yīng)體系,成倍節(jié)省實驗成本 3、小巧、快速、穩(wěn)定、安靜無聲,致病菌檢測實驗操作及結(jié)果分析,檢測流程,25g 或25ml 樣品 225ml預(yù)增菌培養(yǎng)液,混勻 ,適宜的溫度下培養(yǎng)24小時,取1ml培養(yǎng)液,加入裂解液,裂解細(xì)菌,釋放核酸(45min),配制標(biāo)準(zhǔn)品,PCR反應(yīng)液,加樣(30min),定量PCR反應(yīng),查看并分析結(jié)果(1.5h),陰性:出結(jié)果報告,陽性:繼續(xù)用培養(yǎng)法驗證結(jié)果,兩天內(nèi)可出結(jié)果,OXOID 常用預(yù)增菌培養(yǎng)液:,賽默飛咨詢熱線:8008105118,1、預(yù)增菌 按說明書操作,2、細(xì)菌裂解,配制反應(yīng)液及上樣,1)細(xì)菌裂解:獲得待測樣品。 2)配制

10、標(biāo)準(zhǔn)品:陰性對照樣品,陽性對照樣品(4個濃度) 3)按檢測樣品量計算所需反應(yīng)液的量 4)配制所需反應(yīng)液,混合均勻 5)把反應(yīng)液加入反應(yīng)板,并分別在相應(yīng)的孔加入陰性對照樣品、陽性對照樣品,待測樣品。,以下操作均按照檢測試劑盒操作說明書進(jìn)行:,檢測試劑開放,可選擇各國產(chǎn)及進(jìn)口廠家試劑盒,以金黃色葡萄球菌的檢測為例,1、樣品預(yù)增菌 25g 或 25ml 樣品 10%氯化鈉胰蛋白胨大豆肉湯 37度,24小時 金黃色葡萄球菌:Staphylococcus Aureus (SA),以金黃色葡萄球菌的檢測為例,2、細(xì)菌裂解,樣品制備 A、取1ml 培養(yǎng)液,13000rpm 離心2分鐘 B、去上清液,加入10

11、0ul DNA提取液充分混勻 C、沸水浴加熱10分鐘(誤差不超過1分鐘) D、13000rmp 離心5分鐘,上清液備用(樣品),試劑盒:Liferiver 金黃色葡萄球菌核酸檢測試劑盒(熒光法) 生產(chǎn)商:上海之江生物科技 貨號:DD004102,3、梯度標(biāo)準(zhǔn)品配制 A、內(nèi)部對照:取內(nèi)部對照品4ul,加36ul水,震蕩混勻后,3000rmp離心10秒,備用。 B、10倍稀釋標(biāo)準(zhǔn)品(如只需出陰陽性結(jié)果,則無需配制系列濃度的陽性標(biāo)準(zhǔn)品) 1)取4只2ml離心管,分別標(biāo)記為:2、3、4、5 (濃度依次為:5106 、 5105 、 5104 、 5103 拷貝/ml) 。 2)各管中分別加入36ul水

12、 3)取4ul 陽性對照品加入1號管中,震蕩混勻后取4ul加入2號管,2號管震蕩混勻后取4ul加入3號管。依此處理4號管。,4、反應(yīng)液配制1(絕對定量法用) 計算所需各反應(yīng)液成分,按下表量加入2ml離心管,震蕩混合均勻 絕對定量標(biāo)準(zhǔn)品 :5 (5個濃度,可定量出未知樣品拷貝數(shù)) 陰性對照:1 未知樣品:n (n為未知樣品數(shù)), 110 是指多配10,以補(bǔ)償配制和加樣過程中的損耗 如每個樣品需要做2個或3個重復(fù),則在各算式后再乘2或3即可,4、反應(yīng)液配制1 (陰陽性判定法用) 計算所需各反應(yīng)液成分,按下表量加入2ml離心管,震蕩混合均勻,3000rmp離心10秒,備用。 絕對定量標(biāo)準(zhǔn)品 :1 (

13、1個濃度,作為陽性參照) 陰性對照:1 未知樣品:n (n為未知樣品數(shù)), 110 是指多配10,以補(bǔ)償配制和加樣過程中的損耗 如每個樣品需要做2個或3個重復(fù),則在各算式后再乘2或3即可,5、上樣 A、取一片96孔Piko板,放入上樣輔助儀,每孔加入反應(yīng)液18ul B、取裂解的樣品,加入un 孔,每種樣品1孔;取稀釋號的標(biāo)準(zhǔn)品,依次加入最后一列的孔中。在0孔中加入2ul水。,樣品排列建議:S - 陽性標(biāo)準(zhǔn)品、0 陰性對照、un 未知樣品,6、覆膜,離心,放入qPCR,7、設(shè)置程序,點擊Run啟動PCR反應(yīng),編程 雙擊桌面儀器圖標(biāo),打開軟件,2、點擊New,新建一個運(yùn)行文件,點擊Protocol

14、,進(jìn)入程序編輯界面,編程,選中以上各步,可以修改,添加和刪除反應(yīng)步驟,點擊反白不需要檢測的染料,輸入反應(yīng)體系。,編程,添加新循環(huán),添加溶解曲線檢測,上下移動或刪除反應(yīng)步驟,輸入或輸出反應(yīng)程序,開始運(yùn)行程序,添加一個反應(yīng)步驟,添加數(shù)據(jù)采集步驟,編程,參數(shù)修改,左邊選中要修改的步驟,右邊相應(yīng)的框中修改溫度和時間 如要修改升降溫速率,熱蓋溫度,點擊“Advanced Properties”,點擊Run啟動PCR反應(yīng),狀態(tài)監(jiān)控,電腦監(jiān)控,隨時可以點擊HOME,回主界面編輯新程序,分析已有實驗結(jié)果?;蜻M(jìn)入Plate Layout進(jìn)行板式設(shè)置。,8、板布局,點擊Plate Layout,進(jìn)入板布局界面,定

15、位樣品,輸入名稱,確定樣品屬性。- 程序運(yùn)行前,運(yùn)行中,運(yùn)行結(jié)束均可進(jìn)行設(shè)置和修改,告訴軟件各反應(yīng)孔的樣品信息,板布局,輸入樣品名稱等信息,樣品分組,孔信息拷貝,刪除,粘貼,取消,樣品模塊類型選擇,板布局輸入,輸出,選擇樣品屬性,分組,設(shè)重復(fù),設(shè)標(biāo)準(zhǔn)曲線,設(shè)置復(fù)孔,板布局- 絕對定量,1、選擇所用染料 2、選擇樣品類型為Standard 3、打開復(fù)孔和標(biāo)準(zhǔn)曲線設(shè)置向?qū)?4、輸入復(fù)孔排列模式 5、輸入第一個樣品濃度(如1000000) 6、從左到右拖拽選中所有標(biāo)準(zhǔn)品孔,標(biāo)準(zhǔn)曲線設(shè)置即可完成。 7、未知樣品孔的設(shè)置和命名同相對定量,點擊,1,2,3,4,5,6,7,絕對定量 有梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品,陰陽性判定 只有一個標(biāo)準(zhǔn)品,9、結(jié)果分析,程序運(yùn)行結(jié)束,Analysis 選項出現(xiàn),點擊進(jìn)入分析界面,結(jié)果分析主界面,分析種類選項欄,顯示每一次檢測的熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù),顯示反應(yīng)曲線圖,程序運(yùn)行日志,絕對定量和熔解曲線分析,選中Cq,點擊Absolute, 添加絕對定量標(biāo)準(zhǔn)曲線,絕

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 人人文庫網(wǎng)僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

評論

0/150

提交評論