第章酶的作用機制和酶的調(diào)節(jié).ppt

1、第10章 酶的作用機制和酶的調(diào)節(jié),一、酶的活性部位 二、酶催化反應的獨特性質(zhì) 三、影響酶催化效率的有關(guān)因素 四、酶催化反應機制的實例 五、酶活性機制的調(diào)節(jié)控制 酶在醫(yī)學上的應用 本章重點和知識點,一、酶的活性部位,酶分子上特異的氨基酸殘基比較集中的區(qū)域，即與酶活力直接相關(guān)的區(qū)域，稱為酶的活性部位（active site）或活性中心(active center)。,（一）酶活性部位的特點,1、酶活性部位在酶分子的總體中只占相當小的部分（1-2%體積）； 2、 是一個三維實體；并不是和底物的形狀正好互補，而有個動態(tài)的誘導契合過程； 3、 是位于酶分子表面的一個裂縫內(nèi)（疏水區(qū)）； 4、底物通過次級鍵

2、（較弱的力：氫鍵、鹽鍵、范德華力和疏水相互作用）結(jié)合到酶上； 5、 具有柔性或可運動性。,go,back,誘導契合假說：,為了解釋酶能催化正反方向的反應，1964年Koshland提出“誘導契合”假說（induced-fit hypothesis）。 該假說認為當酶分子與底物分子接近時，酶蛋白受底物分子誘導，其構(gòu)象發(fā)生有利于底物結(jié)合的變化，酶與底物在此基礎(chǔ)上互補契合進行反應。,已糖激酶的誘導契合,back,（二）研究酶活性部位的方法,1、化學修飾（共價標記）：確定被修飾基團與酶活性的關(guān)系； 2、酶動力學分析：比較底物和抑制劑對酶反應的影響； 3、射線晶體衍射分析：比較純酶與結(jié)合底物的酶的圖譜，

3、解析酶分子的三維結(jié)構(gòu)； 4、定點誘變（分子生物學方法）：研究酶的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系； 5、切除肽段：確定肽段與酶活性的關(guān)系。,某些酶活性部位的氨基酸殘基,酶分子側(cè)鏈基團的化學修飾法： 確定被修飾基團與酶活性的關(guān)系,可被化學修飾的基團：巰基、羥基、咪唑基、氨基、羧基和胍基等； （1）非特異性共價修飾； （2）特異性共價修飾。如：二異丙基氟磷酸（DFP）：專一性地與酶活性部位的Ser殘基的羥基共價結(jié)合，使酶活力喪失； （3）親和標記(affinity labeling)法。如：TPCK與胰凝乳蛋白酶的底物TPE結(jié)構(gòu)相似， TPCK與該酶保溫后，酶活性部位殘基被烷化，活性喪失。,back,二、酶催化反

4、應的獨特性質(zhì),1、酶反應分兩類：一類僅涉及到電子轉(zhuǎn)移，另一類涉及到電子和質(zhì)子兩者或者其他基團的轉(zhuǎn)移； 2、酶催化作用是由AA側(cè)鏈上的功能基團和輔酶為媒介的，如H,S,C,K,E和D等的側(cè)鏈； 3、最適pH范圍通常狹??； 4、與底物相比，酶分子很大，但活性部位通常只比底物稍大一些； 5、酶除催化反應所必需的活性基團外，還有別的特性（協(xié)同催化、底物結(jié)合部位、過渡態(tài)復合物等），使復雜反應能按一定途徑進行。,back,三、影響酶催化效率的有關(guān)因素,酶能執(zhí)行多種催化方式： 酶提高反應速度的基本機制包括酶的活性部位結(jié)合底物后使底物產(chǎn)生鄰近、軌道定向、應力等多種效應，它們增加反應物的有效碰撞，或者使受作用的

5、化學鍵變形、削弱，或者使受作用的化學基團增加反應性，活性部位的催化基團可能提供共價催化（如親核、親電）、酸堿催化、絡(luò)合催化等多種斷裂鍵的方式。最終結(jié)果是穩(wěn)定過渡態(tài)，使底物易于達到過渡態(tài)，降低反應活化能。,（一）底物和酶的鄰近效應（approximation, proximity）與定向效應(orientation),鄰近效應：ES復合物形成后，底物等的有效濃度升高使反應速率增加的效應； 定向反應：反應物的反應基團之間和酶的催化基團與底物的反應基團之間的正確取位產(chǎn)生的效應。,（二）底物的形變（distortion）和誘導契合(induced fit),張力學說：酶的活性中心與底物結(jié)合后，底物分子

6、中不穩(wěn)定的化學鍵受到牽拉或變形，從而易于斷裂；,（三）酸堿催化（acid-base catalysis）,廣義的酸：提供質(zhì)子； 廣義的堿：接受質(zhì)子 酸堿催化（多元催化）：酶蛋白中有好幾種可以起廣義酸堿催化作用的功能基，如氨基、羧基、巰基、酚羥基及咪唑基等。,（四）共價催化（covalent catalysis）,底物與酶形成反應活性很高的共價中間物，易變成過渡態(tài)，大大降低反應活化能；,（五）金屬離子催化：為反應定向、調(diào)節(jié)氧化還原反應、靜電穩(wěn)定或屏蔽負電荷等； （六）多元催化和協(xié)同效應； （七）活性部位微環(huán)境的影響： 表面效應：活性中心多為“疏水口袋”，低介電環(huán)境中的基團之間的反應會得到加強。,

7、back,四、酶催化反應機制的實例,（一）溶菌酶(lysozyme),椅式,半椅式,（二）胰核糖核酸酶（pancreatic ribonuclease A, RNase A）,水解RNA的磷酸二酯酶; 被測定順序的第二個蛋白質(zhì),也即第一個酶; 124AA, 4對二硫鍵; 專一性地切開嘧啶核苷酸3P-O鍵，生成3-嘧啶核苷酸或以其結(jié)尾的寡聚核苷酸。,化學修飾法研究：用碘乙酸處理，羧甲基化的His119是主要產(chǎn)物，羧甲基化的His12較少。兩者均無活性，推測His1219和His12為酶活性的必需基團,RNase 水解（Ala20-Ser21）得到S肽（20肽）和S蛋白（104肽），變性分離后無活

8、性，但在中性下二肽段共同保溫，則S肽和S蛋白依靠次級鍵結(jié)合，可恢復全部活性，叫做RNase S,（三）羧肽酶（carboxypeptidase A）,外肽酶,催化肽鏈C端的肽鍵水解； 催化作用必需的3個基團：Zn2+、Arg127的胍基和Glu270的羧基；,羧肽酶的催化機制,1、活化的水的親核O原子攻擊底物羰基C原子； 同時Glu270作為廣義堿，從Zn2+結(jié)合水，吸取一個質(zhì)子形成帶負電荷四面體過渡態(tài)中間物，通過Zn2+和Arg127帶正電的側(cè)鏈的靜電相互作用得以穩(wěn)定；,2、Glu270的羧基作為廣義酸提供質(zhì)子給肽的NH基，肽鍵斷裂，釋放出aa,擴散離開，完成水解。,（四）絲氨酸蛋白酶（Se

9、rine proteases）,絲氨酸蛋白酶類是一個最有特色的酶家族。該家族包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶、凝血酶、枯草桿菌蛋白酶、纖溶酶、組織纖溶蛋白酶原激活劑和乙酰膽堿酯酶（非蛋白水解酶）等； 這個酶家族都有相似的酶催化機制，以酶的活性部件的絲氨酸-OH為親核基團。反應中產(chǎn)生穩(wěn)定的?；负退拿骟w中間物過渡態(tài)。,1、His57作為一個廣義堿從Ser195吸取一個質(zhì)子，促進Ser195親核攻擊要斷裂肽鍵的羰基C；,2、His57作為廣義酸供質(zhì)子供給肽的酰胺氮，得到共價的質(zhì)化胺，形成四面體中間物；,3、His57再作為廣義堿接受水的質(zhì)子；,4、His57再作為廣義酸供質(zhì)子給Ser的O；,

10、5、中間體瓦解，產(chǎn)物胺解離釋放。,Ser-His-Asp催化三聯(lián)體,絲氨酸蛋白酶的催化機制：典型的酸堿催化和共價催化的例子。,Catalytic Mechanism of Serine Proteases,back,胰凝乳 蛋白酶,Asp189,胰蛋白酶,Ser189,Ser189,有利于結(jié)合正電荷的Lys,Arg，裂解堿性AA,疏水AA環(huán)繞的口袋，大得足以容納一個芳香殘基，裂解芳香AA（Phe,Tyr）,Gly216,Gly226,Gly216,Gly226,Thr226,Val216,淺口袋，開口處有大的Thr和Val，故僅能容納小的AA,彈性蛋白酶,五、酶活性的調(diào)節(jié)控制,通過對酶的催化活

11、性的調(diào)節(jié)，就可以達到調(diào)節(jié)代謝活動的目的。 可以通過改變其催化活性而使整個代謝反應的速度或方向發(fā)生改變的酶就稱為限速酶或關(guān)鍵酶。 有些酶活性是可以自身調(diào)節(jié)的，這種酶稱為調(diào)節(jié)酶 有兩類調(diào)節(jié)酶，即別構(gòu)調(diào)節(jié)酶和共價調(diào)節(jié)酶。,酶活性的調(diào)節(jié)方式：,一、酶結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)（通過對現(xiàn)有酶分子結(jié)構(gòu)的影響來改變酶的催化活性的調(diào)節(jié)方式，是一種快速調(diào)節(jié)方式） （一）別構(gòu)調(diào)節(jié)（正、負協(xié)同效應，正、負反饋調(diào)節(jié)）； （二）共價修飾調(diào)節(jié)； （三）酶原激活； 二、酶含量調(diào)節(jié)（通過改變細胞中酶蛋白合成或降解的速度來調(diào)節(jié)酶分子的絕對含量，影響其催化活性，從而調(diào)節(jié)代謝反應的速度）；（遲緩） 三、同工酶調(diào)節(jié)。,back,一、酶結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié) （一）

12、別構(gòu)調(diào)節(jié)（變構(gòu)調(diào)節(jié)）：,某些代謝物能與變構(gòu)酶分子上的變構(gòu)部位特異性結(jié)合，使酶的分子構(gòu)象發(fā)生改變，從而改變酶的催化活性以及代謝反應的速度，這種調(diào)節(jié)作用就稱為別構(gòu)調(diào)節(jié)(allosteric regulation)。 具有別構(gòu)調(diào)節(jié)作用的酶就稱為別構(gòu)酶。 凡能使酶分子別構(gòu)并使酶的催化活性發(fā)生改變的代謝物就稱為別構(gòu)效應劑。 別構(gòu)酶的別構(gòu)部位（非底物結(jié)合部位）非共價結(jié)合別構(gòu)調(diào)節(jié)物，并通過異促協(xié)同，改變酶與底物的結(jié)合，引起酶活性的抑制或激活。,1別構(gòu)調(diào)節(jié)的機制：,別構(gòu)酶一般是多亞基構(gòu)成的聚合體，一些亞基為催化亞基，另一些亞基為調(diào)節(jié)亞基。 當調(diào)節(jié)亞基或調(diào)節(jié)部位與別構(gòu)劑結(jié)合后，就可導致酶的空間構(gòu)象發(fā)生改變，從而

13、導致酶的催化活性中心的構(gòu)象發(fā)生改變而致酶活性的改變。,別構(gòu) 效應劑,催化亞基,底物,調(diào)節(jié)亞基,2協(xié)同效應：,當別構(gòu)酶的一個亞基與其配體（底物或別構(gòu)劑）結(jié)合后，能夠通過改變相鄰亞基的構(gòu)象而使其對配體的親和力發(fā)生改變，這種效應就稱為別構(gòu)酶的協(xié)同效應。 如果對相鄰亞基的影響是導致其對配體的親和力增加，則稱為正協(xié)同效應；反之，則稱為負協(xié)同效應。,3.別構(gòu)調(diào)節(jié)的方式： 別構(gòu)酶通常為代謝途徑的起始關(guān)鍵酶，而變構(gòu)劑則為代謝途徑的終產(chǎn)物。 因此，別構(gòu)劑一般以反饋方式對代謝途徑的起始關(guān)鍵酶進行調(diào)節(jié)，最常見的為負反饋調(diào)節(jié)。 4別構(gòu)調(diào)節(jié)的特點： 酶活性的改變通過酶分子構(gòu)象的改變而實現(xiàn)； 酶的變構(gòu)僅涉及非共價鍵的變化

14、； 調(diào)節(jié)酶活性的因素為代謝物； 為一非耗能過程； 無放大效應。,別構(gòu)酶的動力學,別構(gòu)酶大都不遵循米氏動力學。 有正協(xié)同效應的別構(gòu)酶其v-S曲線具有S形，負協(xié)同則類似雙曲線，說明酶對底物濃度的敏感性不同。 某些寡聚酶解離成單體后，失去了別構(gòu)調(diào)節(jié)能力，但仍保留活性，其v-S曲線為米氏曲線。,別構(gòu)效應物,別構(gòu)效應物，也稱別構(gòu)調(diào)節(jié)物。根據(jù)他們對別構(gòu)酶的動力學過程的影響分為K系和V系。K系改變酶的K0.5，不改變Vmax；V系改變Vmax ，不改變K0.5 。,同別構(gòu)效應,同別構(gòu)效應的別構(gòu)效應物為協(xié)同底物，即一底物分子結(jié)合促進其他底物分子與酶結(jié)合。因此，同別構(gòu)效應是別構(gòu)激活，其v-S曲線具有形。,異別構(gòu)

15、效應,異別構(gòu)效應的別構(gòu)調(diào)節(jié)物結(jié)構(gòu)上不同于底物，異別構(gòu)效應可能是別構(gòu)抑制或別構(gòu)激活。 代謝途徑中代謝終產(chǎn)物對早期酶的別構(gòu)調(diào)節(jié)都是別構(gòu)抑制。,例1：天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶 （ATCase, aspartate transcarbamylase）,天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶是研究得比較清楚的別構(gòu)酶。催化氨甲酰磷酸與天冬氨酸反應生成氨甲酰天冬氨酸。 該反應是嘧啶核苷酸生物合成途徑的第一步。圖示該途徑終產(chǎn)物CTP對ATCase的別構(gòu)抑制。,CTP和ATP對ATCase調(diào)節(jié)的生物學意義：,1、ATP信號激活作用，提供DNA復制的能量，導致需求的嘧啶核苷酸的合成； 2、CTP的反饋抑制則保證當嘧啶核苷酸充足時不需要該途徑繼續(xù)合

16、成N-氨甲酰天冬氨酸及其后續(xù)中間物。,ATP與CTP相互競爭調(diào)節(jié)部位，高水平ATP可阻止CTP對ATCase的抑制作用,ATCase中亞基的排列： 由催化亞基和調(diào)節(jié)亞基構(gòu)成,2個C3 （催化亞基） 3個2（調(diào)節(jié)亞基）,ATCase催化肽鏈(c)與調(diào)節(jié)肽鏈()的關(guān)系,每個催化鏈含有1個氨甲酰結(jié)合結(jié)構(gòu)域（N端） 和1個Asp結(jié)合結(jié)構(gòu)域（C端）,鏈domain1,有CTP結(jié)合部位, 鏈domain2,與催化鏈互作,PALA（N-（膦乙?；?L-Asp）：酶的強抑制劑，與雙底物的復合物及過渡態(tài)類似，與酶結(jié)合緊密； 這種不發(fā)生反應的雙底物類似物在ATCase的構(gòu)象研究中很有價值。,ATCase的構(gòu)象改

17、變（1） PALA的結(jié)合導致每條催化鏈的三級結(jié)構(gòu)發(fā)生重要變化，酶由T型變成R型,無配基的T態(tài),有配基的R態(tài),ATCase的構(gòu)象改變（2）,用雙底物類似物的結(jié)合實驗和射線晶體結(jié)構(gòu)研究揭示ATCase在別構(gòu)轉(zhuǎn)變中，調(diào)節(jié)亞基和催化亞基都經(jīng)歷了大的構(gòu)象變化，結(jié)果催化亞基的催化鏈彼此靠近形成了最優(yōu)化的活性部位。 ATCase的別構(gòu)效應是在相當大的立體空間范圍內(nèi)起著調(diào)節(jié)活性的作用。底物的協(xié)同結(jié)合和CTP的反饋抑制是通過長距離而傳遞的。通過肽鏈之間的各個表面的相互作用，信息從一個催化亞基的活性部位傳遞到其他催化亞基的活性部位。,解釋別構(gòu)酶協(xié)同轉(zhuǎn)變的兩個模型,back,2006年12月14日,第25,26學時

18、（第13次課）,（二）共價修飾調(diào)節(jié)：,酶蛋白分子中的某些基團可以在其他酶的催化下發(fā)生共價修飾，從而導致酶活性的改變，稱為共價修飾調(diào)節(jié)。 共價修飾調(diào)節(jié)也是體內(nèi)快速調(diào)節(jié)代謝活動的一種重要的方式。 共價調(diào)節(jié)酶的多肽鏈接受其它酶的可逆或不可逆修飾作用，從而使酶獲得或失去催化活性。能進行共價調(diào)節(jié)的酶至少存在兩種不同的形式，即有活性或高活性形式和無活性或低活性形式。 最常見的共價修飾方式有：磷酸化-脫磷酸化，-SH，-S-S-，乙?；?脫乙酰化，腺苷化-脫腺苷化等。,1共價修飾的機制：,共價修飾酶通常在兩種不同的酶的催化下發(fā)生修飾或去修飾; 酶分子在有活性形式與無活性形式之間進行相互轉(zhuǎn)變。,2共價修飾調(diào)節(jié)

19、的方式：,共價修飾調(diào)節(jié)一般與激素的調(diào)節(jié)相聯(lián)系，其調(diào)節(jié)方式為級聯(lián)反應。,3共價修飾調(diào)節(jié)的特點：, 酶以兩種不同修飾和不同活性的形式存在； 有共價鍵的變化； 受其他調(diào)節(jié)因素（如激素）的影響； 一般為耗能過程； 存在放大效應。,蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸化（1）,磷酸化和去磷酸化是一種廣泛的共價調(diào)節(jié)方式?？晒┝姿峄牡鞍踪|(zhì)側(cè)鏈有： （1）Ser-OH、Thr-OH、Tyr-OH（P-O鍵連接）； （2）His的咪唑基（P-N鍵連接）。,蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸化（2）,圖中顯示一個由于激素和細胞膜受體結(jié)合后引起的細胞內(nèi)一系列蛋白質(zhì)連續(xù)磷酸化過程。這些蛋白質(zhì)由于磷酸化而激活。催化蛋白質(zhì)磷酸化的蛋白激酶構(gòu)成了級聯(lián)系統(tǒng)。 MAP即有絲分裂原激活蛋白，MAP被MAPK激活。有活性的MAP促進一系列基因轉(zhuǎn)錄表達，引起細胞分裂。,酪氨酸激酶(PTK , protein tyrosine kinase) 作用原理,back,（三）酶原激活：,處于無活性狀態(tài)的酶的前身物質(zhì)就稱為酶原。 酶原激活指無催化活性的蛋白質(zhì)被蛋白酶作用，斷裂除去某個或某些序列后形成有催化活性的酶的過程。,酶原激活的機制為：酶原分子一級結(jié)構(gòu)的改變導致了酶原分子空間結(jié)構(gòu)的改變，使催化活性中心得以形成，故使其從無活性的酶原形式轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘拿浮?酶原激活的生理意義在于：1、作為酶的貯存形式；2、保護自身組織細胞不被酶