第章酶的作用機(jī)制和酶的調(diào)節(jié).ppt

1、第10章 酶的作用機(jī)制和酶的調(diào)節(jié),一、酶的活性部位 二、酶催化反應(yīng)的獨(dú)特性質(zhì) 三、影響酶催化效率的有關(guān)因素 四、酶催化反應(yīng)機(jī)制的實(shí)例 五、酶活性機(jī)制的調(diào)節(jié)控制 酶在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用 本章重點(diǎn)和知識(shí)點(diǎn),一、酶的活性部位,酶分子上特異的氨基酸殘基比較集中的區(qū)域，即與酶活力直接相關(guān)的區(qū)域，稱為酶的活性部位（active site）或活性中心(active center)。,（一）酶活性部位的特點(diǎn),1、酶活性部位在酶分子的總體中只占相當(dāng)小的部分（1-2%體積）； 2、 是一個(gè)三維實(shí)體；并不是和底物的形狀正好互補(bǔ)，而有個(gè)動(dòng)態(tài)的誘導(dǎo)契合過程； 3、 是位于酶分子表面的一個(gè)裂縫內(nèi)（疏水區(qū)）； 4、底物通過次級(jí)鍵

2、（較弱的力：氫鍵、鹽鍵、范德華力和疏水相互作用）結(jié)合到酶上； 5、 具有柔性或可運(yùn)動(dòng)性。,go,back,誘導(dǎo)契合假說：,為了解釋酶能催化正反方向的反應(yīng)，1964年Koshland提出“誘導(dǎo)契合”假說（induced-fit hypothesis）。 該假說認(rèn)為當(dāng)酶分子與底物分子接近時(shí)，酶蛋白受底物分子誘導(dǎo)，其構(gòu)象發(fā)生有利于底物結(jié)合的變化，酶與底物在此基礎(chǔ)上互補(bǔ)契合進(jìn)行反應(yīng)。,已糖激酶的誘導(dǎo)契合,back,（二）研究酶活性部位的方法,1、化學(xué)修飾（共價(jià)標(biāo)記）：確定被修飾基團(tuán)與酶活性的關(guān)系； 2、酶動(dòng)力學(xué)分析：比較底物和抑制劑對(duì)酶反應(yīng)的影響； 3、射線晶體衍射分析：比較純酶與結(jié)合底物的酶的圖譜，

3、解析酶分子的三維結(jié)構(gòu)； 4、定點(diǎn)誘變（分子生物學(xué)方法）：研究酶的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系； 5、切除肽段：確定肽段與酶活性的關(guān)系。,某些酶活性部位的氨基酸殘基,酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾法： 確定被修飾基團(tuán)與酶活性的關(guān)系,可被化學(xué)修飾的基團(tuán)：巰基、羥基、咪唑基、氨基、羧基和胍基等； （1）非特異性共價(jià)修飾； （2）特異性共價(jià)修飾。如：二異丙基氟磷酸（DFP）：專一性地與酶活性部位的Ser殘基的羥基共價(jià)結(jié)合，使酶活力喪失； （3）親和標(biāo)記(affinity labeling)法。如：TPCK與胰凝乳蛋白酶的底物TPE結(jié)構(gòu)相似， TPCK與該酶保溫后，酶活性部位殘基被烷化，活性喪失。,back,二、酶催化反

4、應(yīng)的獨(dú)特性質(zhì),1、酶反應(yīng)分兩類：一類僅涉及到電子轉(zhuǎn)移，另一類涉及到電子和質(zhì)子兩者或者其他基團(tuán)的轉(zhuǎn)移； 2、酶催化作用是由AA側(cè)鏈上的功能基團(tuán)和輔酶為媒介的，如H,S,C,K,E和D等的側(cè)鏈； 3、最適pH范圍通常狹?。?4、與底物相比，酶分子很大，但活性部位通常只比底物稍大一些； 5、酶除催化反應(yīng)所必需的活性基團(tuán)外，還有別的特性（協(xié)同催化、底物結(jié)合部位、過渡態(tài)復(fù)合物等），使復(fù)雜反應(yīng)能按一定途徑進(jìn)行。,back,三、影響酶催化效率的有關(guān)因素,酶能執(zhí)行多種催化方式： 酶提高反應(yīng)速度的基本機(jī)制包括酶的活性部位結(jié)合底物后使底物產(chǎn)生鄰近、軌道定向、應(yīng)力等多種效應(yīng)，它們?cè)黾臃磻?yīng)物的有效碰撞，或者使受作用的

5、化學(xué)鍵變形、削弱，或者使受作用的化學(xué)基團(tuán)增加反應(yīng)性，活性部位的催化基團(tuán)可能提供共價(jià)催化（如親核、親電）、酸堿催化、絡(luò)合催化等多種斷裂鍵的方式。最終結(jié)果是穩(wěn)定過渡態(tài)，使底物易于達(dá)到過渡態(tài)，降低反應(yīng)活化能。,（一）底物和酶的鄰近效應(yīng)（approximation, proximity）與定向效應(yīng)(orientation),鄰近效應(yīng)：ES復(fù)合物形成后，底物等的有效濃度升高使反應(yīng)速率增加的效應(yīng)； 定向反應(yīng)：反應(yīng)物的反應(yīng)基團(tuán)之間和酶的催化基團(tuán)與底物的反應(yīng)基團(tuán)之間的正確取位產(chǎn)生的效應(yīng)。,（二）底物的形變（distortion）和誘導(dǎo)契合(induced fit),張力學(xué)說：酶的活性中心與底物結(jié)合后，底物分子

6、中不穩(wěn)定的化學(xué)鍵受到牽拉或變形，從而易于斷裂；,（三）酸堿催化（acid-base catalysis）,廣義的酸：提供質(zhì)子； 廣義的堿：接受質(zhì)子 酸堿催化（多元催化）：酶蛋白中有好幾種可以起廣義酸堿催化作用的功能基，如氨基、羧基、巰基、酚羥基及咪唑基等。,（四）共價(jià)催化（covalent catalysis）,底物與酶形成反應(yīng)活性很高的共價(jià)中間物，易變成過渡態(tài)，大大降低反應(yīng)活化能；,（五）金屬離子催化：為反應(yīng)定向、調(diào)節(jié)氧化還原反應(yīng)、靜電穩(wěn)定或屏蔽負(fù)電荷等； （六）多元催化和協(xié)同效應(yīng)； （七）活性部位微環(huán)境的影響： 表面效應(yīng)：活性中心多為“疏水口袋”，低介電環(huán)境中的基團(tuán)之間的反應(yīng)會(huì)得到加強(qiáng)。,

7、back,四、酶催化反應(yīng)機(jī)制的實(shí)例,（一）溶菌酶(lysozyme),椅式,半椅式,（二）胰核糖核酸酶（pancreatic ribonuclease A, RNase A）,水解RNA的磷酸二酯酶; 被測(cè)定順序的第二個(gè)蛋白質(zhì),也即第一個(gè)酶; 124AA, 4對(duì)二硫鍵; 專一性地切開嘧啶核苷酸3P-O鍵，生成3-嘧啶核苷酸或以其結(jié)尾的寡聚核苷酸。,化學(xué)修飾法研究：用碘乙酸處理，羧甲基化的His119是主要產(chǎn)物，羧甲基化的His12較少。兩者均無活性，推測(cè)His1219和His12為酶活性的必需基團(tuán),RNase 水解（Ala20-Ser21）得到S肽（20肽）和S蛋白（104肽），變性分離后無活

8、性，但在中性下二肽段共同保溫，則S肽和S蛋白依靠次級(jí)鍵結(jié)合，可恢復(fù)全部活性，叫做RNase S,（三）羧肽酶（carboxypeptidase A）,外肽酶,催化肽鏈C端的肽鍵水解； 催化作用必需的3個(gè)基團(tuán)：Zn2+、Arg127的胍基和Glu270的羧基；,羧肽酶的催化機(jī)制,1、活化的水的親核O原子攻擊底物羰基C原子； 同時(shí)Glu270作為廣義堿，從Zn2+結(jié)合水，吸取一個(gè)質(zhì)子形成帶負(fù)電荷四面體過渡態(tài)中間物，通過Zn2+和Arg127帶正電的側(cè)鏈的靜電相互作用得以穩(wěn)定；,2、Glu270的羧基作為廣義酸提供質(zhì)子給肽的NH基，肽鍵斷裂，釋放出aa,擴(kuò)散離開，完成水解。,（四）絲氨酸蛋白酶（Se

9、rine proteases）,絲氨酸蛋白酶類是一個(gè)最有特色的酶家族。該家族包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶、凝血酶、枯草桿菌蛋白酶、纖溶酶、組織纖溶蛋白酶原激活劑和乙酰膽堿酯酶（非蛋白水解酶）等； 這個(gè)酶家族都有相似的酶催化機(jī)制，以酶的活性部件的絲氨酸-OH為親核基團(tuán)。反應(yīng)中產(chǎn)生穩(wěn)定的?；负退拿骟w中間物過渡態(tài)。,1、His57作為一個(gè)廣義堿從Ser195吸取一個(gè)質(zhì)子，促進(jìn)Ser195親核攻擊要斷裂肽鍵的羰基C；,2、His57作為廣義酸供質(zhì)子供給肽的酰胺氮，得到共價(jià)的質(zhì)化胺，形成四面體中間物；,3、His57再作為廣義堿接受水的質(zhì)子；,4、His57再作為廣義酸供質(zhì)子給Ser的O；,

10、5、中間體瓦解，產(chǎn)物胺解離釋放。,Ser-His-Asp催化三聯(lián)體,絲氨酸蛋白酶的催化機(jī)制：典型的酸堿催化和共價(jià)催化的例子。,Catalytic Mechanism of Serine Proteases,back,胰凝乳 蛋白酶,Asp189,胰蛋白酶,Ser189,Ser189,有利于結(jié)合正電荷的Lys,Arg，裂解堿性AA,疏水AA環(huán)繞的口袋，大得足以容納一個(gè)芳香殘基，裂解芳香AA（Phe,Tyr）,Gly216,Gly226,Gly216,Gly226,Thr226,Val216,淺口袋，開口處有大的Thr和Val，故僅能容納小的AA,彈性蛋白酶,五、酶活性的調(diào)節(jié)控制,通過對(duì)酶的催化活

11、性的調(diào)節(jié)，就可以達(dá)到調(diào)節(jié)代謝活動(dòng)的目的。 可以通過改變其催化活性而使整個(gè)代謝反應(yīng)的速度或方向發(fā)生改變的酶就稱為限速酶或關(guān)鍵酶。 有些酶活性是可以自身調(diào)節(jié)的，這種酶稱為調(diào)節(jié)酶 有兩類調(diào)節(jié)酶，即別構(gòu)調(diào)節(jié)酶和共價(jià)調(diào)節(jié)酶。,酶活性的調(diào)節(jié)方式：,一、酶結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)（通過對(duì)現(xiàn)有酶分子結(jié)構(gòu)的影響來改變酶的催化活性的調(diào)節(jié)方式，是一種快速調(diào)節(jié)方式） （一）別構(gòu)調(diào)節(jié)（正、負(fù)協(xié)同效應(yīng)，正、負(fù)反饋調(diào)節(jié)）； （二）共價(jià)修飾調(diào)節(jié)； （三）酶原激活； 二、酶含量調(diào)節(jié)（通過改變細(xì)胞中酶蛋白合成或降解的速度來調(diào)節(jié)酶分子的絕對(duì)含量，影響其催化活性，從而調(diào)節(jié)代謝反應(yīng)的速度）；（遲緩） 三、同工酶調(diào)節(jié)。,back,一、酶結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié) （一）

12、別構(gòu)調(diào)節(jié)（變構(gòu)調(diào)節(jié)）：,某些代謝物能與變構(gòu)酶分子上的變構(gòu)部位特異性結(jié)合，使酶的分子構(gòu)象發(fā)生改變，從而改變酶的催化活性以及代謝反應(yīng)的速度，這種調(diào)節(jié)作用就稱為別構(gòu)調(diào)節(jié)(allosteric regulation)。 具有別構(gòu)調(diào)節(jié)作用的酶就稱為別構(gòu)酶。 凡能使酶分子別構(gòu)并使酶的催化活性發(fā)生改變的代謝物就稱為別構(gòu)效應(yīng)劑。 別構(gòu)酶的別構(gòu)部位（非底物結(jié)合部位）非共價(jià)結(jié)合別構(gòu)調(diào)節(jié)物，并通過異促協(xié)同，改變酶與底物的結(jié)合，引起酶活性的抑制或激活。,1別構(gòu)調(diào)節(jié)的機(jī)制：,別構(gòu)酶一般是多亞基構(gòu)成的聚合體，一些亞基為催化亞基，另一些亞基為調(diào)節(jié)亞基。 當(dāng)調(diào)節(jié)亞基或調(diào)節(jié)部位與別構(gòu)劑結(jié)合后，就可導(dǎo)致酶的空間構(gòu)象發(fā)生改變，從而

13、導(dǎo)致酶的催化活性中心的構(gòu)象發(fā)生改變而致酶活性的改變。,別構(gòu) 效應(yīng)劑,催化亞基,底物,調(diào)節(jié)亞基,2協(xié)同效應(yīng)：,當(dāng)別構(gòu)酶的一個(gè)亞基與其配體（底物或別構(gòu)劑）結(jié)合后，能夠通過改變相鄰亞基的構(gòu)象而使其對(duì)配體的親和力發(fā)生改變，這種效應(yīng)就稱為別構(gòu)酶的協(xié)同效應(yīng)。 如果對(duì)相鄰亞基的影響是導(dǎo)致其對(duì)配體的親和力增加，則稱為正協(xié)同效應(yīng)；反之，則稱為負(fù)協(xié)同效應(yīng)。,3.別構(gòu)調(diào)節(jié)的方式： 別構(gòu)酶通常為代謝途徑的起始關(guān)鍵酶，而變構(gòu)劑則為代謝途徑的終產(chǎn)物。 因此，別構(gòu)劑一般以反饋方式對(duì)代謝途徑的起始關(guān)鍵酶進(jìn)行調(diào)節(jié)，最常見的為負(fù)反饋調(diào)節(jié)。 4別構(gòu)調(diào)節(jié)的特點(diǎn)： 酶活性的改變通過酶分子構(gòu)象的改變而實(shí)現(xiàn)； 酶的變構(gòu)僅涉及非共價(jià)鍵的變化

14、； 調(diào)節(jié)酶活性的因素為代謝物； 為一非耗能過程； 無放大效應(yīng)。,別構(gòu)酶的動(dòng)力學(xué),別構(gòu)酶大都不遵循米氏動(dòng)力學(xué)。 有正協(xié)同效應(yīng)的別構(gòu)酶其v-S曲線具有S形，負(fù)協(xié)同則類似雙曲線，說明酶對(duì)底物濃度的敏感性不同。 某些寡聚酶解離成單體后，失去了別構(gòu)調(diào)節(jié)能力，但仍保留活性，其v-S曲線為米氏曲線。,別構(gòu)效應(yīng)物,別構(gòu)效應(yīng)物，也稱別構(gòu)調(diào)節(jié)物。根據(jù)他們對(duì)別構(gòu)酶的動(dòng)力學(xué)過程的影響分為K系和V系。K系改變酶的K0.5，不改變Vmax；V系改變Vmax ，不改變K0.5 。,同別構(gòu)效應(yīng),同別構(gòu)效應(yīng)的別構(gòu)效應(yīng)物為協(xié)同底物，即一底物分子結(jié)合促進(jìn)其他底物分子與酶結(jié)合。因此，同別構(gòu)效應(yīng)是別構(gòu)激活，其v-S曲線具有形。,異別構(gòu)

15、效應(yīng),異別構(gòu)效應(yīng)的別構(gòu)調(diào)節(jié)物結(jié)構(gòu)上不同于底物，異別構(gòu)效應(yīng)可能是別構(gòu)抑制或別構(gòu)激活。 代謝途徑中代謝終產(chǎn)物對(duì)早期酶的別構(gòu)調(diào)節(jié)都是別構(gòu)抑制。,例1：天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶 （ATCase, aspartate transcarbamylase）,天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶是研究得比較清楚的別構(gòu)酶。催化氨甲酰磷酸與天冬氨酸反應(yīng)生成氨甲酰天冬氨酸。 該反應(yīng)是嘧啶核苷酸生物合成途徑的第一步。圖示該途徑終產(chǎn)物CTP對(duì)ATCase的別構(gòu)抑制。,CTP和ATP對(duì)ATCase調(diào)節(jié)的生物學(xué)意義：,1、ATP信號(hào)激活作用，提供DNA復(fù)制的能量，導(dǎo)致需求的嘧啶核苷酸的合成； 2、CTP的反饋抑制則保證當(dāng)嘧啶核苷酸充足時(shí)不需要該途徑繼續(xù)合

16、成N-氨甲酰天冬氨酸及其后續(xù)中間物。,ATP與CTP相互競(jìng)爭(zhēng)調(diào)節(jié)部位，高水平ATP可阻止CTP對(duì)ATCase的抑制作用,ATCase中亞基的排列： 由催化亞基和調(diào)節(jié)亞基構(gòu)成,2個(gè)C3 （催化亞基） 3個(gè)2（調(diào)節(jié)亞基）,ATCase催化肽鏈(c)與調(diào)節(jié)肽鏈()的關(guān)系,每個(gè)催化鏈含有1個(gè)氨甲酰結(jié)合結(jié)構(gòu)域（N端） 和1個(gè)Asp結(jié)合結(jié)構(gòu)域（C端）,鏈domain1,有CTP結(jié)合部位, 鏈domain2,與催化鏈互作,PALA（N-（膦乙?；?L-Asp）：酶的強(qiáng)抑制劑，與雙底物的復(fù)合物及過渡態(tài)類似，與酶結(jié)合緊密； 這種不發(fā)生反應(yīng)的雙底物類似物在ATCase的構(gòu)象研究中很有價(jià)值。,ATCase的構(gòu)象改

17、變（1） PALA的結(jié)合導(dǎo)致每條催化鏈的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生重要變化，酶由T型變成R型,無配基的T態(tài),有配基的R態(tài),ATCase的構(gòu)象改變（2）,用雙底物類似物的結(jié)合實(shí)驗(yàn)和射線晶體結(jié)構(gòu)研究揭示ATCase在別構(gòu)轉(zhuǎn)變中，調(diào)節(jié)亞基和催化亞基都經(jīng)歷了大的構(gòu)象變化，結(jié)果催化亞基的催化鏈彼此靠近形成了最優(yōu)化的活性部位。 ATCase的別構(gòu)效應(yīng)是在相當(dāng)大的立體空間范圍內(nèi)起著調(diào)節(jié)活性的作用。底物的協(xié)同結(jié)合和CTP的反饋抑制是通過長(zhǎng)距離而傳遞的。通過肽鏈之間的各個(gè)表面的相互作用，信息從一個(gè)催化亞基的活性部位傳遞到其他催化亞基的活性部位。,解釋別構(gòu)酶協(xié)同轉(zhuǎn)變的兩個(gè)模型,back,2006年12月14日,第25,26學(xué)時(shí)

18、（第13次課）,（二）共價(jià)修飾調(diào)節(jié)：,酶蛋白分子中的某些基團(tuán)可以在其他酶的催化下發(fā)生共價(jià)修飾，從而導(dǎo)致酶活性的改變，稱為共價(jià)修飾調(diào)節(jié)。 共價(jià)修飾調(diào)節(jié)也是體內(nèi)快速調(diào)節(jié)代謝活動(dòng)的一種重要的方式。 共價(jià)調(diào)節(jié)酶的多肽鏈接受其它酶的可逆或不可逆修飾作用，從而使酶獲得或失去催化活性。能進(jìn)行共價(jià)調(diào)節(jié)的酶至少存在兩種不同的形式，即有活性或高活性形式和無活性或低活性形式。 最常見的共價(jià)修飾方式有：磷酸化-脫磷酸化，-SH，-S-S-，乙?；?脫乙酰化，腺苷化-脫腺苷化等。,1共價(jià)修飾的機(jī)制：,共價(jià)修飾酶通常在兩種不同的酶的催化下發(fā)生修飾或去修飾; 酶分子在有活性形式與無活性形式之間進(jìn)行相互轉(zhuǎn)變。,2共價(jià)修飾調(diào)節(jié)

19、的方式：,共價(jià)修飾調(diào)節(jié)一般與激素的調(diào)節(jié)相聯(lián)系，其調(diào)節(jié)方式為級(jí)聯(lián)反應(yīng)。,3共價(jià)修飾調(diào)節(jié)的特點(diǎn)：, 酶以兩種不同修飾和不同活性的形式存在； 有共價(jià)鍵的變化； 受其他調(diào)節(jié)因素（如激素）的影響； 一般為耗能過程； 存在放大效應(yīng)。,蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸化（1）,磷酸化和去磷酸化是一種廣泛的共價(jià)調(diào)節(jié)方式?？晒┝姿峄牡鞍踪|(zhì)側(cè)鏈有： （1）Ser-OH、Thr-OH、Tyr-OH（P-O鍵連接）； （2）His的咪唑基（P-N鍵連接）。,蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸化（2）,圖中顯示一個(gè)由于激素和細(xì)胞膜受體結(jié)合后引起的細(xì)胞內(nèi)一系列蛋白質(zhì)連續(xù)磷酸化過程。這些蛋白質(zhì)由于磷酸化而激活。催化蛋白質(zhì)磷酸化的蛋白激酶構(gòu)成了級(jí)聯(lián)系統(tǒng)。 MAP即有絲分裂原激活蛋白，MAP被MAPK激活。有活性的MAP促進(jìn)一系列基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，引起細(xì)胞分裂。,酪氨酸激酶(PTK , protein tyrosine kinase) 作用原理,back,（三）酶原激活：,處于無活性狀態(tài)的酶的前身物質(zhì)就稱為酶原。 酶原激活指無催化活性的蛋白質(zhì)被蛋白酶作用，斷裂除去某個(gè)或某些序列后形成有催化活性的酶的過程。,酶原激活的機(jī)制為：酶原分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的改變導(dǎo)致了酶原分子空間結(jié)構(gòu)的改變，使催化活性中心得以形成，故使其從無活性的酶原形式轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘拿浮?酶原激活的生理意義在于：1、作為酶的貯存形式；2、保護(hù)自身組織細(xì)胞不被酶