免疫組化結(jié)果分析和判斷PPT課件.ppt

1、第七章免疫組織化結(jié)果的分析和判斷(要求：理解、記住、使用)，第一節(jié)免疫組織化結(jié)果的判斷原則總結(jié)免疫組織化結(jié)果的判斷原則，有以下幾點。 沒有對照染色的免疫組織化染色的結(jié)果不可信。 抗原的表達必須在特定部位。 LCA必須位于細(xì)胞膜上CK必須位于細(xì)胞漿內(nèi)PCNA和p53蛋白質(zhì)必須位于核內(nèi)EMA必須位于細(xì)胞膜上。 不是有抗原的部位的陽性著色，都不被視為陽性。 陰性結(jié)果不能視為抗原不表達。 因為檢測方法的靈敏度有高低，染色方法的靈敏度不足，有時會引起陰性反應(yīng)，所以判斷上需要注意。 盡量避免出血、壞死及切片刀痕和界面周邊細(xì)胞的陽性表達，特別是酶免疫標(biāo)記。 這種陽性著色的多系內(nèi)源性干擾或者是人為的原因。 喀

2、嚓喀嚓喀嚓喀嚓喀嚓喀嚓6、第2節(jié)對照染色設(shè)計，(1)對照染色的目的是排除假陰性和假陽性。 假陰性的原因主要有三個：組織處理不適當(dāng)，抗原丟失過多，或隱藏的抗體失活，有效值過低，或稀釋度不適當(dāng)(主要指一次抗體，即特異性抗體)。 染色工序的遺漏和錯誤、顯色劑的選擇、緩沖液的pH值和離子強度的不當(dāng)?shù)取?假陽性是由各種因素引起的非特異性著色引起的，原因主要有：自發(fā)熒光和內(nèi)源性酶等干擾抗體試劑不純(特別是一次抗體)污染、切片干燥、顯影劑操作錯誤等操作錯誤Fc受體的干擾等。 (二)對照種類及其選擇目的的對照染色大致分為陽性組織對照、陰性組織、陰性試劑對照和自我對照四種：陽性組織對照是指與目標(biāo)抗原同源性不同的

3、源組織切片或細(xì)胞涂片與檢查對象切片同時進行同樣處理和免疫染色的組織對照。 正確的結(jié)果必須是陽性的。 為了證實所用免疫組織化染色過程的有效性，排除了假陰性的可能性。 陰性組織對照是確認(rèn)不含有目標(biāo)抗原的同步處理和使用免疫標(biāo)記染色的組織對照。 正確的結(jié)果必須是陰性，目的是排除假陽性。 陰性試劑對照是指用于免疫組化染色的試劑，特別是為了實證特異性抗體試劑的有效性和可靠性而設(shè)立的同步免疫染色對照，代替包括空白對照的吸收試驗或抑制試驗等。 目的：除假陽性外，證實所用免疫組織化試劑及其技術(shù)方法的有效性和待檢查切片免疫標(biāo)記陽性結(jié)果的可靠性。 空白對照是用緩沖液(PBS、TBS等)置換第一抗體(主要根據(jù)需要還可

4、以進行第二抗體和交聯(lián)抗體的空白置換)，其他各階段不變的試劑對照染色，結(jié)果為陰性。 置換對照是用所用的方法用第一抗體相同動物的正常血清或與本實驗無關(guān)的抗體(目標(biāo)生物不足)置換第一抗體，對其他程序不變的試劑進行對照染色，結(jié)果為陰性。 吸收試驗是用事先通過的抗原吸收的第一抗體上清代替第一抗體，對照其他程序不變的免疫染色試劑。 結(jié)果，陰性或陽性的著色明顯減弱。 抑制試驗是以未標(biāo)記抗體和未標(biāo)記抗體(可以是一次抗體、二次抗體或橋抗體)的混合物為試劑，按照其他順序?qū)φ詹蛔兊拿庖呓M織化染色試劑，結(jié)果，陽性著色成比例減弱(等量或1:9 )。 這個試劑對比來說多用于直接法。 此類陰性試劑對照的選擇原則空白對照不能

5、省略，其他對照應(yīng)在事前實驗中盡量多做，特別是應(yīng)用新的抗體試劑對照應(yīng)與實驗片同步染色對照的結(jié)果應(yīng)附加要求。 自我對照是指同一標(biāo)記切片上自我組織成分的陰性背景對照。也就是說，與目標(biāo)抗原陽性反應(yīng)細(xì)胞或成分相鄰的陰性背景結(jié)構(gòu)的發(fā)色應(yīng)該是陰性或著色淺，需要與陽性著色成分鮮明地進行對比。 目的排除內(nèi)源性干擾假陽性和抗原分散移位的錯誤結(jié)果。 第三節(jié)非特異染色、非特異染色是免疫組化染色過程中發(fā)生的非目標(biāo)抗原的呈色結(jié)果，假陽性，也稱為背景著色，極大地干擾了免疫組化染色結(jié)果的正確判斷，應(yīng)盡量避免或減輕。 其原因涉及免疫組化染色過程的各個環(huán)節(jié)，來源于內(nèi)源性干擾(自發(fā)熒光、內(nèi)源性酶、內(nèi)源性生物素等)試劑污染修正方法因

6、原因而異，但根據(jù)事先的實驗，可以采用符合目的的修正對策，即對癥療法(因為沒有說明具體的修正方法，所以學(xué)生們可以自己閱讀講義p123-126 )。 第四節(jié)陽性標(biāo)記的形態(tài)特征和判斷，免疫組織化標(biāo)記具有一定的形態(tài)特征，熟練掌握有助于正確判斷免疫組織化標(biāo)記結(jié)果。 特征包括定性、定位和定量三個方面。 免疫發(fā)色強度和陽性細(xì)胞密度是定性定量指標(biāo)，在實際工作中用強度和密度結(jié)合的方法綜合計量，與抗原含量相關(guān)的陽性細(xì)胞著色形態(tài)和組織分布特征主要是定位指標(biāo)，與功能相關(guān)。 一、陽性標(biāo)記免疫特征：弱()、中()、強()、三級。 免疫熒光法(以FITC為例)表現(xiàn)為淺綠色熒光、明顯綠色熒光、明亮綠色晃眼的熒光的免疫酶標(biāo)記(

7、HRP- DAB/H2O2)，表現(xiàn)為淡黃色微粒、黃褐色微粒、黃褐色粗粒子，后者耀眼。 在一般攝影中，原則上多取強陽性區(qū)域。 二、陽性標(biāo)記細(xì)胞學(xué)特征(以HRP-DAB/H2O2為例)分為細(xì)胞膜型細(xì)胞核型細(xì)胞質(zhì)(漿)型微絨毛型和復(fù)合型(同時具有細(xì)胞膜-細(xì)胞質(zhì)，同時具有細(xì)胞核-細(xì)胞質(zhì)或微絨毛-細(xì)胞質(zhì))等5種陽性細(xì)胞型。 雖然這與抗原存在的部位有關(guān)，但必須注意排除組織固定不良引起的抗原擴散的幻想，特別是復(fù)合型圖像。三、陽性標(biāo)記組織學(xué)特征(以HRP-DAB/H2O2為例)免疫組織化染色陽性細(xì)胞在組織中的分布序列形式有以下7種：定位型； 彌漫型切片型網(wǎng)眼型腺管型腔緣型和菊團型等。 這主要取決于抗原抗體復(fù)合

8、體在細(xì)胞內(nèi)的分布和陽性細(xì)胞在組織內(nèi)的集團分布特征。 四、陽性標(biāo)記強度的特征根據(jù)細(xì)胞陽性著色的程度(抗原含量)，弱陽性() 22222222222222222中陽性() 22222222222222222強陽性() 2222222222222222226陽性細(xì)胞的數(shù)量，弱陽性(陽性細(xì)胞總數(shù)為25% 強陽性(指陽性細(xì)胞總數(shù)在50%以上)。 目前，積分綜合計量被大量采用。 計算公式為() %x1 ( )%x2 ( )%x3； 合計值1.5為() 隨機觀察至少5-10個HPF。 第五節(jié)染色失敗的可能原因，免疫組織化染色的基本要求是：實驗切片陽性抗原的定位正確，顏色鮮明，背景著色不淺，或者兩者的比例要大于1 (陽性/背景)；對照染色的結(jié)果要附加要求。 否則，得到的實驗結(jié)果都是錯誤的、假陽性的、假陰性的。 假陽性是指實驗切片為陽性，陰性組織對照或陰性試劑對照也為陽性的結(jié)果，假陽性。 其原因與內(nèi)源性干擾、試劑雜質(zhì)、交叉反應(yīng)等有關(guān)。 所謂假陰性，是實驗切片為陰性，陽性組織對照和陰性試劑對照也是陰性的結(jié)果，稱為假陰性。 其原因與組織處理不當(dāng)、組織細(xì)胞抗原丟失、試劑錯誤(如錯過、錯過、故障、變質(zhì)等)、操作錯誤等有關(guān)。對照結(jié)果判斷：染色失敗原因：均為陰性弱陽性(陰性對照除外)的背景染色過深陽性對照好，樣品弱陽性對照沒有背景，樣品背景深，判斷原則：實驗設(shè)計抗體選擇抗原定位性抗原分布不均勻