DNA的損傷與修復(fù)

1、,分子生物學(xué)作業(yè) 內(nèi)容：第五章 DNA的損傷與修復(fù) 制作人：生科四班學(xué)生 陳玥 40908199 周紅 40908200 李茜 40908201 李姍姍 40908202 李婷婷 40908203,第五章 DNA的損傷與修復(fù),1.DNA損傷的產(chǎn)生 2.基因的突變 3.DNA損傷的修復(fù) 4.損傷跨越 5.DNA修復(fù)缺陷與癌癥的關(guān)系,概況,作為遺傳物質(zhì)的DNA具有高度的穩(wěn)定性，但是，細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境中各種因素依然可以造成DNA的損傷。如果DNA的損傷得不到有效的修復(fù)，就會造成DNA分子上可遺傳的永久性結(jié)構(gòu)變化，稱為突變（mutation）。少數(shù)突變有可能對細(xì)胞是有利的。但絕大部分突變是有害的。 細(xì)胞有

2、多種形式的修復(fù)系統(tǒng)，使絕大多數(shù)損傷能夠及時修復(fù)。 研究DNA損傷與修復(fù)的機(jī)制，有兩個方面的實(shí)際意義。其一，防止DNA的損傷，是預(yù)防不少疾病的有效途徑。 其二，在育種工作中，常常要誘發(fā)突變再篩選有優(yōu)良性狀的植株或微生物株系。, 5.1 DNA損傷的產(chǎn)生,DNA損傷指在內(nèi)外因素的影響下，體內(nèi)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生的任何改變。 若堿基的改變是兩種嘌呤或兩種嘧啶之間的互換，稱作轉(zhuǎn)換（transitions）。 若發(fā)生了嘌呤和嘧啶之間的互換，則稱作顛換（transversions）。 引起DNA損傷的因素很多，包括DNA分子本身在復(fù)制過程中發(fā)生的自發(fā)性改變，以及細(xì)胞內(nèi)各種代謝物質(zhì)和外界理化因素引起的損傷。

3、,5.1.1 DNA分子的自發(fā)性損傷,DNA的自發(fā)性損傷可以發(fā)生在復(fù)制過程中，也可以由細(xì)胞自身產(chǎn)生的活性氧或代謝產(chǎn)物造成。根據(jù)DNA損傷的狀況，和引起DNA損傷的原因，可以將DNA的自發(fā)性損傷分作6種類型。,5.1.1.1 互變異構(gòu)移位,互變異構(gòu)移位（tautomeric shift）是堿基發(fā)生了烯醇式-酮式結(jié)構(gòu)互變，造成堿基配對發(fā)生改變，使復(fù)制后的子鏈上出現(xiàn)錯誤。生理?xiàng)l件下，堿基上的基團(tuán)主要以酮式和氨基的形式存在，但也可能發(fā)生瞬間的互變異構(gòu)，造成堿基錯配。如圖所示，若 A以稀有的亞氨基形式出現(xiàn)，即可與C配對，經(jīng)過DNA的兩輪復(fù)制，在1/4的子代分子中，A-T對變成了G-C對。因此在DNA復(fù)制

4、時，若模板上出現(xiàn)烯醇式或亞氨基異構(gòu)體時，子鏈上就可能產(chǎn)生錯配的堿基對。,5.1.1.2 自發(fā)脫氨基,DNA分子中堿基的環(huán)外氨基有時會自發(fā)脫落，結(jié)果使C變?yōu)閁，A變?yōu)镮，G變?yōu)閄（黃嘌呤）。在DNA復(fù)制時，母鏈的上述變化會在子鏈中產(chǎn)生錯誤而導(dǎo)致?lián)p傷。 A I-C，下一輪G-C，引起AT GC的變； C U-A，下一輪T-A，引起GC AT的突變； G X-C，下一輪G-C，損傷不擴(kuò)大。,5.1.1.3 DNA復(fù)制的打滑,在DNA復(fù)制時，有時會出現(xiàn)模板鏈或新生鏈堿基的環(huán)出（looping out）現(xiàn)象，被稱作 DNA聚合酶的“打滑”（slippage）。如圖所示，第一次復(fù)制時新生鏈一個或數(shù)個堿基的

5、環(huán)出，在第二次復(fù)制時，可引起同樣數(shù)量堿基的插入。第一次復(fù)制時模板鏈一個或數(shù)個堿基的環(huán)出，在第二次復(fù)制時，可引起同樣數(shù)量堿基的缺失。這種錯誤易發(fā)生在模板上有堿基串聯(lián)重復(fù)的部位，這些部位即使發(fā)生堿基的環(huán)出，后面的堿甚配對仍然是正確的。,5.1.1.4 活性氧引起的DNA損傷,活性氧指反應(yīng)活性很高的含氧自由基和H2O2，不少含氧自由基可在細(xì)胞正常代謝過程中生成。含氧自由基可造成堿基的氧化，如7, 8-二氫-8-氧鳥嘌呤（7, 8-oxoG, GO）就是一種氧化堿基，可與C或A配對，造成G-C T-A的顛換，DNA pol I和DNA pol II的校正活性不能校正其錯配，故這種損傷可以積累。,5.1

6、.1.5 堿基丟失,DNA在生理?xiàng)l件下可通過自發(fā)性水解，使嘌呤堿和嘧啶堿從磷酸脫氧核糖骨架上脫落下來。細(xì)胞受熱或pH降低，可加劇脫嘌呤反應(yīng)，強(qiáng)致癌劑黃曲霉毒素B1也能加劇脫嘌呤反應(yīng)。,5.1.1.6 堿基的烷基化,細(xì)胞內(nèi)一些天然的烷基化試劑，如S-腺苷甲硫氨酸，可使DNA分子中的某些堿基甲基化，造成堿基錯配，經(jīng)DNA復(fù)制，形成堿基對的改變。,5.1.2 物理因素引起的DNA損傷,DNA分子容易吸收波長在260nm左右的紫外線（UV），大劑量的UV照射，可以使DNA分子一條鏈上相鄰的兩個嘧啶共價結(jié)合，形成環(huán)丁烷嘧啶二聚體。相鄰的兩個T或兩個C，以及C和T之間均可形成嘧啶二聚體，但最易形成的是T-

7、T二聚體和6-4光產(chǎn)物,電離輻射如X射線和射線等，可以引起DNA的直接損傷和間接損傷。 DNA鏈的斷裂會隨著照射劑量的增大而加劇。若DNA雙鏈中只有一條鏈斷裂，稱為單鏈斷裂，若兩條鏈在同一處或緊密相鄰處同時斷裂，則為雙鏈斷裂。,5.1.3 化學(xué)因素引起的DNA損傷,許多天然的或合成的有機(jī)和無機(jī)化學(xué)物質(zhì)均可與DNA發(fā)生反應(yīng)，改變其結(jié)構(gòu)。能誘發(fā)DNA損傷的化學(xué)物質(zhì)稱化學(xué)誘變劑（mutagen），常見的化學(xué)誘變劑可以大致分為3類,5.1.3.1 堿基類似物,堿基類似物（base analog）能在DNA復(fù)制時取代正常堿基與模板鏈的堿基配對，從而摻人DNA。 2-氨基嘌呤（AP）是腺嘌呤的類似物，通常

8、與胸腺嘧啶配對，以罕見的亞氨基狀態(tài)存在時，可以與胞嘧啶配對，使A-T變?yōu)镚-C，相反情況下，則可將G-C變?yōu)锳-T。,5.1.3.2 堿基的修飾劑,某些化學(xué)物質(zhì)通過對DNA分子上堿基的修飾（base modification），改變其配對性質(zhì)。例如，亞硝酸能脫去連接在堿基環(huán)上的氨基，使腺嘌呤脫氨基形成次黃嘌呤（I），后者與胞嘧啶配對，而不與胸腺嘧啶配對。胞嘧啶脫氨基后成為尿嘧啶，與腺嘌呤配對。 羥胺（NH2OH）與DNA分子上堿基的作用特異性很強(qiáng)，它只與胞嘧啶作用，生成4-羥胺胞嘧啶（HC），后者與腺嘌呤配對，結(jié)果使G-C對變?yōu)锳-T對,烷化劑（alkylating agent） 能使DNA堿

9、基上的氮原子烷基化，最常見的是鳥嘌呤第6位氮原子的烷基化，改變堿基配對性質(zhì)，如6-甲基鳥嘌呤（MG）與胸腺嘧啶配對。如果直接與配對有關(guān)的基團(tuán)被烷化，則可完全阻斷復(fù)制時的堿基配對。 較常見的烷化劑有亞硝胺化合物，包括二甲基亞硝胺和二乙基亞硝胺，亞硝基胍（NTG） 化合物如N, N-硝基-N-甲基亞硝基胍，亞硝基脲化合物如乙基亞硝基脲，烷基硫酸鹽化合物，包括二甲基硫酸鹽、乙基甲基硫酸鹽（EMS） 和乙基乙基硫酸鹽（EES），此外，還有氮芥和硫芥等。,5.1.3.3 嵌入染料,一些扁平的稠環(huán)分子，如吖啶橙（acridine orange）、原黃素（proflavin）、溴化乙錠（ethiduium

10、bromide, EB）等染料，可插入到DNA分子堿基對之間，故稱為嵌入染料（intercalated dye）。這些扁平分子插入DNA后正好占據(jù)了一個堿基的位置，將堿基對間的距離加大約1倍，可造成DNA兩條鏈的錯位。,細(xì)胞內(nèi)存在完善的DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)，以保障遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性。不同類型的DNA損傷，由不同的途徑進(jìn)行修復(fù)。根據(jù)修復(fù)的機(jī)理，DNA損傷的修復(fù)一般可分為直接修復(fù)、切除修復(fù)、雙鏈斷裂修復(fù)、易錯修復(fù)和重組修復(fù)等。,1.點(diǎn)突變 點(diǎn)突變指DNA單位分子上所發(fā)生的堿基對改變，也稱為簡單突變或單一位點(diǎn)突變，其最主要形式為堿基對置換，分為轉(zhuǎn)換和顛換兩種類型。有時，發(fā)生在單個位點(diǎn)上的少數(shù)核苷酸缺失或

11、插入也被認(rèn)為點(diǎn)突變。 點(diǎn)突變帶來的后果取決于其發(fā)生,。,5.2基因的突變,基因突變是指基因組DNA分子發(fā)生的突然的可遺傳的變異。從分子水平上看，基因突變是指基因在結(jié)構(gòu)上發(fā)生堿基對組成或排列順序的改變?；螂m然十分穩(wěn)定，能在細(xì)胞分裂時精確地復(fù)制自己，但這種隱定性是相對的。在一定的條件下基因也可以從原來的存在形式突然改變成另一種新的存在形式，就是在一個位點(diǎn)上，突然出現(xiàn)了一個新基因，代替了原有基因，這個基因叫做突變基因。于是后代的表現(xiàn)中也就突然的祖先從未有的新性狀。,盡管細(xì)胞內(nèi)的修復(fù)系統(tǒng)能及時修復(fù)絕大多數(shù)的DNA損傷，但修復(fù)系統(tǒng)并不是萬無一失的。如果損傷在下一輪DNA復(fù)制之前還沒有被修復(fù)，有的會被固

12、定下來傳給子代細(xì)胞，有的則通過易錯的跨損傷合成產(chǎn)生新的錯誤，并最終也被保留下來。因此，生物體難免會發(fā)生這樣那樣的突變，并帶有一定的基因、基因組、細(xì)胞或個體被稱為突變體。單細(xì)胞生物能夠?qū)⑿庐a(chǎn)生的突變基因直接傳給其后代，而多細(xì)胞生物能否將突變傳給后代則取決于 突變四發(fā)生在生殖細(xì)胞還是體細(xì)胞。 如果突變發(fā)生在生殖細(xì)胞，則可以傳給后代。 如果是發(fā)生在體細(xì)胞，則一般不會傳給后代， 除非后代是由突變的體細(xì)胞克隆而成的。,突變的類型 5.2.1突變的類型 5.2.2突變的回復(fù)和校正 5.2.3誘變劑和致癌劑的檢測,點(diǎn)突變也稱作單堿基替換（single base substitution），指由單個堿基改變發(fā)

13、生的突變。 可以分為轉(zhuǎn)換和顛換兩類。 轉(zhuǎn)換：嘌呤和嘌呤之間的替換，或嘧啶和嘧啶之間的替換。 顛換：嘌呤和嘧啶之間的替換。 點(diǎn)突變帶來的后果取決于其發(fā)生的位置和具體的突變方式。如果是發(fā)生在基因組的垃圾DNA上，因?yàn)槠鋲A基序列缺乏編碼和調(diào)節(jié)基因表達(dá)的功能，就不可能產(chǎn)生任何的后果。如果發(fā)生在一個基因的啟動子或其他基因表達(dá)的調(diào)控區(qū)，則可能會影響基因表達(dá)的,（1）沉默突變：由于遺傳密碼又兼性，若突變的密碼子編碼同樣的氨酸一般對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能沒有影響同義突變因此被稱為沉默突變或同義突變。 （2）錯義突變（missense mutation）：堿基對的置換使mRNA的某一個密碼子變成編碼另一種氨基酸的密

14、碼子的突變稱為錯義突變。錯義突變可導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)某種蛋白質(zhì)或酶在結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生異常，從而引起疾病。如人類正常血紅蛋白鏈的第六位是谷氨酸，其密碼子為GAA或GAG，如果第二個堿基A被U替代，就變成GUA或GUG，谷氨酸則被纈氨酸所替代，形成異常血紅蛋白HbS，導(dǎo)致個體產(chǎn)生鐮形細(xì)胞貧血，產(chǎn)生了突變效應(yīng),（3）無義突變和通讀突變 無義突變：若突變使為氨基酸編碼的密碼子變?yōu)榻K止密碼子，導(dǎo)致多肽鏈的合成被中斷。如Cys的密碼子變成TGC突 變成終止密碼子TGA。 通讀突變：若突變使終止密碼子變成了為氨基酸編碼的密碼子，會使mRNA在翻譯的時候發(fā)生通讀，從而使肽鏈加長，也稱加長突變。 如果突變發(fā)生在蛋白質(zhì)基因

15、的內(nèi)含子序列， 一般對表達(dá)產(chǎn)物沒影響。但有時可影響到個 別 基因的轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄后加工或翻譯等。 如果突變發(fā)生在基因表達(dá)的調(diào)控區(qū)，則可能 影響記憶表達(dá)的效率，甚至完全 關(guān)閉基因的 表達(dá)，從而引起生物體表現(xiàn)型的變化。,移碼突變：在正常地DNA分子中,堿基缺失或增加非3地倍數(shù),造成這位置之后的一系列編碼發(fā)生移位錯誤的改變，這種現(xiàn)象稱移碼突變。例如原來的mRNA是GAA、GAA、GAA、GAA按照密碼子所合成的肽鏈?zhǔn)且粋€谷氨酸的多肽。如果開頭增加一個G，那么mRNA就變成了GGA、AGA、AGA、AGA按照這些密碼子合成的肽鏈就是一個一甘氨酸開頭的精氨酸的多肽。移碼突變的結(jié)果將引起該段肽鏈的改變，而肽鏈

16、的改變將引起蛋白質(zhì)性質(zhì)的改變，最終引起性狀的變異。嚴(yán)重是會導(dǎo)致個體的死亡。 隱性突變和顯性突變 隱形突變：在真核生物中，如果只發(fā)生在同源染色體其中的一條上，另一條同源染色體上正?；虻漠a(chǎn)物能夠抵消或中和突變基因?qū)?xì)胞功能的可能的改變。如果突變發(fā)生在同源染色體上的兩個等位基因都發(fā)生突變，才能改變生物的表現(xiàn)型。 顯性突變：在真核生物中有一些基因，只要同源染色體任意一個等位基因發(fā)生突變，就引起生物的表現(xiàn)型的改變。,校正突變的分類 1）基因內(nèi)校正 2）基因間校正 3）迂回校正 5.2.3誘變劑和致癌劑的檢測,由于基因突變而是生物體的性狀由野生型變?yōu)橥蛔冃停?則這樣的突變稱作正向突變。 回復(fù)突變(rev

17、erse mutation): 突變體(mutant) 經(jīng)過第二次突變又完全地或部分地恢復(fù)為原來的基因型 和表現(xiàn)型.完全恢復(fù)是由于突變的堿基順序經(jīng)第二次突變后又變?yōu)樵瓉淼膲A基順序,故亦稱真正的回復(fù)突變.部分恢復(fù)是由于第二次突變發(fā)生在另一部位上,其結(jié)果是部分恢復(fù)原來的表現(xiàn)型.亦稱為第二位點(diǎn)突變(second site mutation)或基因內(nèi)校正(intragenic suppression) 校正突變：指發(fā)生在另外一個位點(diǎn)上，且能夠中和或抵消起始突變的第二次突變。,誘變劑和致癌劑的檢測 自然條件下發(fā)生的突變稱為自發(fā)突變，其發(fā)生的頻率非常低，大腸桿菌和果蠅的自發(fā)突變率都在10左右。能夠提高突變

18、率的誘變劑主要有物理誘變劑和化學(xué)誘變劑兩類。 物理誘變劑通過離子輻射如吸收X射線和r射線，引起目標(biāo)分子的電子轉(zhuǎn)移，造成DNA發(fā)生廣泛的損傷?；瘜W(xué)誘變劑主要是通過對堿基的修飾、堿基對的插入或缺失起作用。 原癌基因：控制細(xì)胞分裂的基因發(fā)生突變繼而引發(fā)癌變，這樣的基因稱為原癌基因。 抑癌基因：表達(dá)的產(chǎn)物有抑制癌癥的作用的基因。,Ames試驗(yàn) 污染物對人體的潛在危害，引起人們的普遍關(guān)注。世界上已發(fā)展了百余種短期快速測試法，檢測污染物的遺傳毒性效應(yīng)。 目的和原理 鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）的組氨酸營養(yǎng)缺陷型（his）菌株，在含微量組氨酸的培養(yǎng)基中，除極少數(shù)自發(fā)回復(fù)突變

19、的細(xì)胞外，一般只能分裂幾次，形成在顯微鏡下才能見到的微菌落。受誘變劑作用后，大量細(xì)胞發(fā)生回復(fù)突變，自行合成組氨酸，發(fā)育成肉眼可見的菌落。某些化學(xué)物質(zhì)需經(jīng)代謝活化才有致變作用，在測試系統(tǒng)中加入哺乳動物微粒體酶，可彌補(bǔ)體外試驗(yàn)缺乏代謝活化系統(tǒng)之不足。鑒于化學(xué)物質(zhì)的致突變作用與致癌作用之間密切相關(guān)，故此法現(xiàn)廣泛應(yīng)用于致癌物的篩選。,步驟和方法 Ames試驗(yàn)的常規(guī)方法有斑點(diǎn)試驗(yàn)和平板摻入試驗(yàn)。 1菌株鑒定 用于測試的菌株，需經(jīng)基因型和生物學(xué)性狀鑒定，符合要求才能投入使用。 目前推薦使用的一套菌株是TA97、TA98、TA100和TA102自發(fā)回變相似，為陰性。 。鑒定前先進(jìn)行增菌培養(yǎng)。為鑒定結(jié)果可靠，

20、需同時培養(yǎng)野生型TV菌株，作為測試菌基因型之對照。增菌培養(yǎng)用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，接種后于37，100rmin振蕩培養(yǎng)12h左右，細(xì)菌生長相為對數(shù)期末，含菌數(shù)應(yīng)為1109個ml2109個ml。 2斑點(diǎn)試驗(yàn) 吸取測試菌增菌培養(yǎng)后的菌液0.1ml，注入融化并保溫45左右的上層軟瓊脂中，需S9活化的再加0.3ml0.4mlS9mix，立即混勻，傾于底平板上，鋪平冷凝。用滅菌尖頭鑷夾滅菌圓濾紙片邊緣，紙片浸濕受試物溶液，或直接取固態(tài)受試物，貼放于上層培養(yǎng)基的表面。同時做溶劑對照和陽性對照，分別貼放于平板上相應(yīng)位置。平皿倒置于37溫箱培養(yǎng)48h。在紙片外圍長出密集菌落圈，為陽性；菌落散布，密度與自發(fā)回

21、變相似，為陰性。,3平板摻入試驗(yàn) 將一定量樣液和0.1ml測試菌液均加入上層軟瓊脂中，需代謝活化的再加0.3ml0.4ml S9mix，混勻后迅速傾于底平板上鋪平冷凝。同時做陰性和陽性對照，每種處理做3個平行。試樣通常設(shè)4個5個劑量。選擇劑量范圍開始應(yīng)大些，有陽性或可疑陽性結(jié)果時，再在較窄的劑量范圍內(nèi)確定劑量反應(yīng)關(guān)系。培養(yǎng)同上。同一劑量各皿回變菌落均數(shù)與各陰性對照皿自發(fā)回變菌落均數(shù)之比，為致變比（MR）。MR值2，且有劑量-反應(yīng)關(guān)系，背景正常，則判為致突變陽性。, 5.3DNA損傷的修復(fù),5.3.1直接修復(fù),直接修復(fù)也稱為損傷逆轉(zhuǎn)，其修復(fù)的方式是用特定的化學(xué)反應(yīng)使受損傷的堿基恢復(fù)為正常的堿基，

22、是最簡單、最直接的修復(fù)方式。能被這種機(jī)制修復(fù)的損傷有嘧啶二聚體、6-烷基鳥嘌呤和某些鏈的斷裂。,5.3.1.1嘧啶二聚體的直接修復(fù),嘧啶二聚體是一種常見的DNA損傷，可導(dǎo)致雙螺旋發(fā)生扭曲，而影響DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。嘧啶二聚體既可被直接修復(fù)，也可被切除修復(fù)。參與其直接修復(fù)的酶是DNA光復(fù)活酶或光裂解酶。該酶廣泛存在于原核和真核生物的細(xì)胞中，是Mr為5.51046.5104 的單體酶 ，含兩個光吸收輔因子和FADH。一旦嘧啶二聚體被直接修復(fù)，光裂解酶就與DNA解離。 光復(fù)活酶廣泛存在于細(xì)菌、真菌、果蠅、植物和很多脊椎動物中，但在哺乳動物中卻沒有這種酶，因而不能進(jìn)行嘧啶二聚體的直接修復(fù)。,5.3.1.

23、2烷基化堿基的直接修復(fù),烷基化堿基的直接修復(fù)是在烷基化轉(zhuǎn)移酶的作用下完成的，E.coli中的6-烷基鳥嘌呤、4-烷基胸腺嘧啶和甲基化的磷酸二酯鍵由Ada酶直接修復(fù)。Ada酶以活性中心的1個Cys殘基為甲基受體，但是一旦它得到甲基，酶就失活，因此是一種自殺酶，可是這個修復(fù)途徑只需一步反應(yīng)。此外，這種損傷可以由DNA連接酶直接修復(fù) .,5.3.2 切除修復(fù),切除修復(fù)（excision repair)需要先識別損傷部位，然后切除損傷的堿基或核苷酸，用正常的堿基或核苷酸填補(bǔ)缺口，用連接酶連接切口。 切除修復(fù)有兩種： a.堿基切除修復(fù) b. 核苷酸切除修復(fù) 兩者識別損傷的機(jī)制不同，前者是直接識別具體的受

24、損傷的堿基，后者識別的是損傷對DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的扭曲。,5.3.2.1 堿基切除修復(fù),堿基切除修復(fù)（base excision repair, BER） 首先作用于N-糖苷鍵，切除受損傷的堿基，比如尿嘧啶、次黃嘌呤、烷基化堿基、被氧化的堿基和其他一些被修飾的堿基等，隨后，再進(jìn)行進(jìn)一步的修復(fù)反應(yīng)。 BER適用范圍：較輕的堿基損傷 催化堿基切除的酶：DNA糖苷酶 幾乎所有的DNA糖苷酶都只作用于單個損傷堿基。不過，在T4噬菌體和黃色微球菌中發(fā)現(xiàn)了一種對嘧啶二聚體特異性的糖苷酶。 DNA糖苷酶的特異性有所差別，但所有的DNA糖苷酶都是沿著DNA雙螺旋的小溝進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)受損傷的堿基后即與DNA結(jié)合，

25、并誘導(dǎo)DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生扭曲，使損傷堿基被擠出雙螺旋，進(jìn)入酶的活性中心進(jìn)行切割。,DNA分子經(jīng)DNA糖苷酶作用產(chǎn)生無嘌呤或無嘧啶位點(diǎn)（apurinic或apyridimidic site, AP位點(diǎn)）。該位點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)專門的AP內(nèi)切酶（AP endonuclease）的有效底物。 有兩類AP內(nèi)切酶： a. 5 -AP內(nèi)切酶，在AP位點(diǎn)的5-端切割產(chǎn)生3 -OH和5 -脫氧核糖磷酸，脫氧核糖磷酸隨后被DNA脫氧核糖磷酸二酯酶 （DNA deoxyribophosphodiesterase, dRPase） 切除。 b. 3 -AP內(nèi)切酶，它們在AP位點(diǎn)的3 端切開磷酸二酯鍵，產(chǎn)生3 -不飽和醛（uns

26、aturated aldehydes）和 5 -脫氧核苷酸，3 -不飽和醛隨后被5 -AP內(nèi)切酶切除。 DNA糖苷酶也可分作兩類,一類只有N-糖苷酶的活性，另一類除具有N-糖苷酶活性外，還有3 -AP裂解內(nèi)切酶活性（3 -AP lyase endonuclease），可作用于無嘌呤或無嘧啶位點(diǎn)。,在損傷部位形成切口后，可以通過兩種途徑進(jìn)行修復(fù)合成。 a.短修復(fù)途徑 b.長修復(fù)途徑 兩種途徑的異同點(diǎn)： 1.AP內(nèi)切酶的切口都緊靠AP位點(diǎn)5-端的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生5-脫氧核糖磷酸和3-OH。 2.短修補(bǔ)是主要途徑，只需合成屬于AP。位點(diǎn)的1個正常的核苷酸；長修補(bǔ)時次要途徑，是前者的備用途徑，要合成1

27、小段寡聚核苷酸。 3. 短修補(bǔ)用DNA pol ，長修補(bǔ)用DNA pol 或PCNA。,5.3.2.2 核苷酸切除修復(fù),核苷酸切除修復(fù)（nucleotide excision repair, NER） 主要用來修復(fù)導(dǎo)致DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生扭曲并影響到DNA復(fù)制的損傷，由于NER識別損傷的機(jī)制并不是針對損傷本身，而是針對損傷對DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)造成的扭曲，故許多并不相同的損傷能被相同的機(jī)制和幾乎同一套修復(fù)蛋白修復(fù)。,盡管在真核生物體內(nèi)參與NER的蛋白質(zhì)高度保守，但與原核生物的相關(guān)蛋白質(zhì)同源性卻很低。不過，原核生物和真核生物NER的基本過程是相似的，主要由5步反應(yīng)組成： 1. 由特殊的蛋白質(zhì)探測損傷，并引

28、發(fā)一系列蛋白質(zhì)與損傷部位的有序結(jié)合。 2.由特殊的內(nèi)切酶在損傷部位的兩側(cè)切開DNA鏈。 3. 去除2個切口之間的帶有損傷的DNA片段，形成缺口。 4.由DNA pol填補(bǔ)缺口。 5. 由DNA連接酶連接切口 。,全基因組NER 和轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)性NER,根據(jù)識別損傷的機(jī)制和修復(fù)的范圍，可以將NER分為全基因組NER （global genome NER, GGR）和轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)性NER （transcription-coupled NER, TCR）。 兩者的異同點(diǎn)： GGR負(fù)責(zé)修復(fù)整個基因組的DNA損傷，速度慢，效率低。 TCR專門修復(fù)正在轉(zhuǎn)錄的基因模板鏈上的損傷，速度快，效率高。 兩類NER的主要差

29、別在于識別損傷的機(jī)制上，至于損傷識別后發(fā)生的修復(fù)反映并無本質(zhì)上的區(qū)別。TCR由RNA聚合酶識別損傷部位。當(dāng)RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄到受損傷部位而前進(jìn)受阻的時候，TCR即被起動。,（1） 原核細(xì)胞的NER系統(tǒng),E.coli的嘧啶二聚體可以通過GGR系統(tǒng)進(jìn)行修復(fù)，該系統(tǒng)需要的酶和蛋白質(zhì)如表5-1所示，其基本步驟如圖5-11所示。 2個UvrA與1個UvrB形成三聚體，此過程需要水解ATP來提供能量。 UvrA2-UvrB1復(fù)合物與DNA隨機(jī)結(jié)合后受ATP水解驅(qū)動，在DNA分子上移動，對DNA的損傷進(jìn)行監(jiān)控。 一旦發(fā)現(xiàn)損傷，則UvrA解離，UvrB與DNA形成穩(wěn)定的復(fù)合物，接著，UvrC與UvrB-DNA位

30、點(diǎn)高親和性結(jié)合，誘導(dǎo)UvrB的構(gòu)象發(fā)生變化，使之在損傷部位的3-端（距離損傷點(diǎn)4個核苷酸）產(chǎn)生切口。隨后，UvrC催化在DNA損傷部位的 5-端（距離損傷點(diǎn)78個核苷酸）產(chǎn)生切口，在UvrD解鏈酶的催化下，釋放一個由12 nt13 nt組成的寡聚核苷酸片段。 由DNA pol I填補(bǔ)缺口，連接酶連接切口。,表5-1 原核細(xì)胞NER系統(tǒng)蛋白質(zhì)和酶的功能,TCR最初是在真核細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，后來證明也存在于原核細(xì)胞。如果缺乏TCR，則DNA的轉(zhuǎn)錄股與非轉(zhuǎn)錄股修復(fù)的效率應(yīng)該沒有差別。但關(guān)于E.coli乳糖操縱子DNA損傷修復(fù)的研究發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)物IPTG存在的情況下，其轉(zhuǎn)錄股由UV誘發(fā)的損傷在5分鐘內(nèi)被全

31、部修復(fù)，而非轉(zhuǎn)錄股的損傷，或無IPTG誘導(dǎo)的細(xì)胞，其損傷約需要40分鐘才能被修復(fù)。 轉(zhuǎn)錄股更容易修復(fù)，是因?yàn)槠鋼p傷更容易被識別。在E.coli的 TCR系統(tǒng)中，一旦RNA聚合酶進(jìn)入損傷部位，其轉(zhuǎn)錄就暫停，并形成一個穩(wěn)定的復(fù)合物。Mfd基因的產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄修復(fù)偶聯(lián)因子（transcription repair coupled factor, TRCF）識別這種暫停的復(fù)合物，取代RNA聚合酶，同時將UvrA2-UvrB1復(fù)合物招募到損傷部位，并促進(jìn)UvrA與UvrB解離，從而加快UvrB-DNA預(yù)剪切復(fù)合物的形成。隨后損傷被切除，以及填補(bǔ)缺口和連接切口的反應(yīng)與GGR完全相同（圖5-12）。,（2） 真核

32、細(xì)胞的NER系統(tǒng),（2） 真核細(xì)胞的NER系統(tǒng) 真核細(xì)胞的NER系統(tǒng)大概需要30多種蛋白質(zhì)參與，但是，修復(fù)的基本原理和過程與原核細(xì)胞非常相似。 與原核細(xì)胞的NER模型相似，真核細(xì)胞的NER涉及多個步驟，雖然各種蛋白質(zhì)結(jié)合的次序還存有一定的爭議，哺乳動物GGR系統(tǒng)的基本步驟是比較明確的。, XPC和HR23B形成二聚體，識別并結(jié)合到DNA的傷部位，使雙螺旋的扭曲加劇。 TFIIH, RPA和XPA與雙螺旋嚴(yán)重扭曲的損傷部位結(jié)合，形成約20bp30bp的單鏈區(qū)域，RPA作為SSB與已解開的單鏈區(qū)域結(jié)合。 XPG和XPF/ERCCl作為對DNA結(jié)構(gòu)特異性的內(nèi)切酶，被招募到已解鏈的損傷部位， XPB/

33、XPD的解鏈酶活性協(xié)助2個切點(diǎn)之間包含損傷部位的寡聚核苷酸(平均長度為27 nt)脫離復(fù)合物。 DNA po1或與PCNA一起進(jìn)行修補(bǔ)合成，填補(bǔ)缺口。最后，連接酶連接切口。 哺乳動物TCR系統(tǒng)識別損傷的機(jī)制與GGR系統(tǒng)不同，首先，RNA聚合酶II延伸復(fù)合物暫停在損傷部位，并導(dǎo)致一小部分區(qū)域發(fā)生解鏈。隨后，CSA和CSB被招募到RNA聚合酶上，進(jìn)而協(xié)助招募TFIIH, XPA , RPA和XPG到損傷部位，RNA聚合酶、RNA轉(zhuǎn)錄物、CSA和CSB則解離下來，于是形成了與GGR一樣的復(fù)合物，后續(xù)的步驟與GGR系統(tǒng)完全相同(圖5-13)。,5.3.3錯配修復(fù),錯配修復(fù)（MMR）系統(tǒng)主要用來糾正DN

34、A雙螺旋上錯配的堿基對，此外，還能修復(fù)一些因復(fù)制打滑而產(chǎn)生的小于4nt的核苷酸插入或缺失。 此途徑的缺陷可產(chǎn)生所謂的突變子表型，表現(xiàn)為細(xì)胞的自發(fā)突變率和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性增高。 MMR的過程與其他切除修復(fù)途徑相似，但與其他修復(fù)系統(tǒng)不同的是MMR系統(tǒng)需要區(qū)分母鏈和子鏈，做到只切除子鏈上錯誤的核苷酸，而不會切除母鏈中本來就正確的核苷酸,E.coli的MMR長修補(bǔ)途徑需要多種蛋白質(zhì)，MutS負(fù)責(zé)識別錯配的堿基對，識別效率取決于錯配堿基對的類型和所處的環(huán)境。此外，長修補(bǔ)途徑還需要特殊的核酸外切酶，DNA pol和DNA連接酶。 其MMR作用的主要步驟如下： 1)MutS識別并結(jié)合錯配的堿基對，或因堿基插入

35、或缺失在DNA上形成的小環(huán)，MutL隨后結(jié)合。 2)MutH與GATC位點(diǎn)結(jié)合，在錯配堿基對兩側(cè)的DNA通過MutS做相向移動，形成雙鏈突環(huán)。 3）MutHa的核酸內(nèi)切酶活性被 MutS/MutL激活，切割非甲基化子鏈的GATC的5-端。,4）UvrD作為解鏈酶，催化唄切開的含有錯配堿基的子鏈與母鏈分離。 5）DNA pol和連接酶分別填補(bǔ)缺口和連接切口。錯配修復(fù)是一個高耗能的過程。 E.coli還有另外兩條不需要MutS,MutL和 MutH的短修補(bǔ)MMR途徑： .依賴于MutY的修復(fù)途徑，用于取代A-G和 A-C錯配堿基對中的A。 .極短修補(bǔ)途徑，用于糾正G-T錯配堿基對中的T。 在哺乳動

36、物細(xì)胞中，也存在一種類似的短修補(bǔ)MM途徑，用來糾正其甲基化的CpG島上因脫氨基產(chǎn)生的G-T錯配堿基對上的T。,5.3.4雙鏈斷裂的修復(fù),DNA斷裂特別是雙鏈斷裂時一種極為嚴(yán)重的損傷，這種損傷難以徹底修復(fù)。 雙鏈斷裂修復(fù)主要有兩種機(jī)制：其一是同源重組，精確性高；其二為非同源末端連接，能在無同源序列的情況下，讓斷裂的末端重新連接起來，這種方式精確性低，但卻是人類修復(fù)雙鏈斷裂的主要方式。,NHEJ是DSBR中最簡單和最常用的一種方式，其基本步驟如下 : 1）2個Ku70/K80異源二聚體與2個DNA斷裂末端結(jié)合。 2）DNA-PKcs與Artemis蛋白形成合物，被Ku70/K80招募到DNA末端，

37、并使斷裂的DNA相互靠近。 3）DNA-PKcs 與DNA末端結(jié)合后，其蛋白質(zhì)既沒的活性被激活，使Artemis蛋白磷酸化。 4）Artemis蛋白被磷酸化后，其核酸酶活性被激活，可水解末端突出的單鏈區(qū)域，創(chuàng)造出連接酶的有效底物。 5）XRCC4和連接酶共同催化已加工好的DNA末端之間的連接, 5.4 損傷跨越,損傷跨越（damage bypass）：DNA復(fù)制過 程中發(fā)生的損傷，無法修復(fù)時，在暫 時保留損傷的情況下，繼續(xù)復(fù)制，復(fù) 制結(jié)束后再進(jìn)行修復(fù)，由于這一機(jī)制 是事先合成錯誤率較高的DNA，再對 其進(jìn)行修復(fù)，故也可被稱作易錯修復(fù)。 特點(diǎn)：保留損傷，先復(fù)制，再修復(fù)。,5.4.1 重組跨越,重

38、組跨越(recombinational bypass)又稱為重組修復(fù)(recombination repair），其基本機(jī)制是通過對 DNA模板的交換，跨越模板鏈上的損傷部位，在新合成的鏈上恢復(fù)正常的核苷酸序列。重組跨越雖然沒有消除模板鏈上損傷，但也沒有在復(fù)制過程中擴(kuò)大損傷。模板鏈上的損傷可以在復(fù)制完成后，用其它途徑進(jìn)行修復(fù)。,E.coli重組跨越的兩種機(jī)制： 第一種： 在新鏈合成遇到損傷部位時，通過蛋白質(zhì)RecA, RecF, RecO和 RecR的作用，使復(fù)制叉后退，兩條新合成的鏈回折，形成互補(bǔ)雙鏈。接著，因模板鏈上的損傷而中斷合成的新鏈，以另一條新鏈為模板，在DNA pol I的催化下進(jìn)

39、行鏈的延伸，隨后，復(fù)制叉向前移動，跨越損傷部位，進(jìn)行正常的復(fù)制。如圖517,第二種：一旦復(fù)制叉到達(dá)損傷位點(diǎn)如嘧啶二聚體，或模板鏈斷裂，DNA pol 即停止移動并與模板鏈解離，另一條模板鏈在RecA, RecF, RecO和 RecR的作用下斷裂，并與受損傷的模板鏈形成互補(bǔ)雙鏈，在跨越損傷部位后繼續(xù)合成新鏈，然后在RuvA, RuvB和 RuvC的作用下，鏈的交叉部位遷移，在斷裂的模板鏈上留下的一段缺口，由DNA pol I和連接酶修補(bǔ)。其后，DNA復(fù)制可按正常機(jī)制完成。這一機(jī)制形成鏈交叉，以及交叉點(diǎn)的遷移，是十分復(fù)雜的過程。如圖5-17,5.4.2 合成跨越,合成跨越（bypass synthesis):在模板鏈遇到損傷部位，負(fù)責(zé)復(fù)制的DNA pol (原核細(xì)胞是DNA pol ，真核細(xì)胞