激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)的應用

1、激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),樣品要求 原理 功能 在生物醫(yī)學中的應用,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)及應用,The techniques and application of Confocal Laser Scanning Microscopy,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),人眼分辨率： 0.2mm 光學顯微鏡分辨率：0.25mm 電子顯微鏡分辨率：0.2nm 共焦顯微鏡分辨率：0.18mm,二、 原理,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),原理小結(jié): Confocal 利用放置在光源后的照明針孔和放置在檢測器前的探測針孔實現(xiàn)點照明和點探測，來自光源的光通過照明針孔發(fā)射出的光聚焦在樣品焦平面的某個點上，該點所發(fā)射的熒光成像在

2、探測針孔上，該點以外的任何發(fā)射光均被探測針孔阻擋。照明針孔與探測針孔對被照射點或被探測點來說是共軛的，因此被探測點即共焦點，被探測點所在的平面即共焦平面。計算機以像點的方式將被探測點顯示在計算機屏幕上，為了產(chǎn)生一幅完整的圖像，由光路中的掃描系統(tǒng)在樣品焦平面上掃描，從而產(chǎn)生一幅完整的共焦圖像。只要載物臺沿著Z軸上下移動，將樣品新的一個層面移動到共焦平面上，樣品的新層面又成像在顯示器上，隨著Z軸的不斷移動，就可得到樣品不同層面連續(xù)的光切圖像 。,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別 1.抑制圖像的模糊，獲得清晰

3、的圖像,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別 2. 具有更高的軸向分辨率，并可獲取連續(xù)光學切片,conventional,confocal,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別 3. 增加側(cè)向分辨率,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別 4. 由于點對點掃描去除了雜散光的影響,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),三. 激光掃描共焦顯微鏡的設(shè)計特點: 1.點照明 2.具有照明pinhole和探測pinhole 3.照明pinhole和探測pinhole共軛(共焦), 共焦點即被探測點，被探測點所在的平面為共焦平面 4.具有掃描系統(tǒng) 逐點掃描成像 5.具有多個（

4、四個） 熒光通道，可同時探測多個被標記物,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),技術(shù)指標（Leica TCS SP2) : 1. xy分辨率比傳統(tǒng)顯微鏡小1.4x 傳統(tǒng)顯微鏡: Rxy=0.61/NA （0.25 m ) Confocal: Rxy=0.4/NA（0.18 m ) 2. 樣品的最大厚度: 取決于: 物鏡的NA、物鏡的工作距離 激光的穿透力、樣品的透明度 Z軸的最大移動范圍(166m、Z-wide) 3. 樣品的最小光切厚度: (載物臺最小移動距離為40nm） 取決于: 物鏡的NA、針孔大小 Z軸的最小移動步距: 40nm Z軸的分辨率: 0.35 m,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),4. 激光器 A

5、r激光器: 458nm, 476nm, 488nm, 514nm GreNe : 543nm; HeNe: 633nm Ar激光器(UV): 361nm 激光器的特點: 1) 方向性好: 激光基本延直線傳播 2) 單色性好 :=10-8nm 3) 高亮度: 激光方向性好, 其在空間上的能量分布是高度 集中的。 4) 偏振性: 激光為平面偏振光, 光纖耦合,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),5. 四個熒光通道, 一個透射光通道 即除了可同時采集多標記熒光圖像外 還可以同時采集透射光圖像,但透射光 圖像為非共焦圖像。,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),6.掃描速度: slow 220lines/s 512512 2-

6、3秒 slow2 440lines/s（2：雙向掃描） medium 450lines/s 512512 1.7秒 medium2 900lines/s fast 1000lines/s 512512 0.7秒 128128 0.2秒 fast2 2000lines/s 7. 掃描密度: 6464 128128 512512 10241024 20482048,激光掃描共焦顯微鏡 技術(shù)的應用,The application of Confocal Laser Scanning Microscopy,激光掃描共焦顯微鏡應用,功能. 1.多熒光標記樣品的高清晰度、高分辨率圖像采集 2.無損傷、連續(xù)

7、光學切片，顯微“CT” 3.真正的三維重組 4.假三維圖的顯示 5.可沿Z軸（xy平面）和Y軸（xz平面）方向進行光切 6.定量分析 7.時間序列掃描: xyt 、xyzt 和 xt 掃描 8.圖像處理 9. 旋轉(zhuǎn)掃描 10.感興趣區(qū)域掃描 11.光譜掃描,激光掃描共焦顯微鏡應用,應用 定位、定量 三維重組 動態(tài)測量 活細胞或組織內(nèi)游離Ca2+分布和濃度的變化 測量 (Mg2+ 、Zn+ 、Na+ 、K+) 自由基的檢測 藥物進入細胞的動態(tài)過程、定位分布及定量 蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)位,激光掃描共焦顯微鏡應用,活細胞內(nèi)H+濃度（ pH值）的測量 線粒體膜電位的測量 熒光漂白恢復（FRAP）的測量 籠鎖解籠

8、鎖的測量 熒光能量共振轉(zhuǎn)移（FRET）的測量 其他應用,激光掃描共焦顯微鏡應用,一、定位、定量 免疫熒光標記（單標、雙標或三 標）的定位、定量：如：細胞膜受體或抗原的分布， 微絲、微管的分布、 兩種或三種蛋 白的共存與共定位、蛋白與細胞器的 共定位、核轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)位和干細胞的 增值、分化 細胞凋亡: AnnexinV-fitc + PI 末端原位雜交-fitc + PI 熒光原位雜交： 染色體基因定位,激光掃描共焦顯微鏡應用,定位、定量研究中常用熒光探針 1.Amine-Reactive Probes 與抗體耦聯(lián)、與配體耦聯(lián)、與肽耦聯(lián)、與人工合成的寡聚核苷酸耦聯(lián)的探針，可用于免疫組化、熒光原位雜

9、交、受體標記等 Green Red Fura-red FITC 494/518 TRITC 544/572 Cy5 650/690 (異硫氰基熒光素) (四甲基異硫氰基羅丹明) Alexa Fluor 488 488/530 PE 565/578 (藻紅蛋白) Texas Red 595/615 (德州紅) Cy3 558/568 BODIPY FL 503/512 BODIPY TMR 543/569 BODIPY TR 592/618,激光掃描共焦顯微鏡應用,1)細胞表面抗原、胞內(nèi)某種蛋白 免役熒光標記： 與抗體耦聯(lián), 直標: 一抗+熒光探針 間標: 二抗+熒光探針 如: 微管蛋白tubl

10、in ( 抗 tublin抗體+熒光探針) 肌動蛋白actin ( Palloidine+熒光探針) 2)細胞膜表面受體 配體+熒光探針 如: nAchR、mAchR、多巴胺受體(D1,D2) 標記 Gm1: 霍亂毒素受體 霍亂毒素+FITC,激光掃描共焦顯微鏡應用,2.標記細胞器熒光探針 1)線粒體 Mitochondria Rodamin 123 505/534 ，可染活細胞，陽離子, 可檢 測線粒體膜電位, 且在多數(shù)細胞中停留 時間短 JC1 線粒體膜電位低時為單體 490/527 發(fā)綠光 線粒體膜電位高時為多聚體 490/590 發(fā)紅光 可標記活細胞線粒體，且為檢測線粒體膜電位最 佳探

11、針 Mitotracker Green FM 490/516, 染活細胞或固定細胞 , 穩(wěn)定不漏出 Mitotracker Orange CMTMRos 551/576, (氧化型) Mitotracker Orange 還原型, 只能染活細胞,激光掃描共焦顯微鏡應用,2)溶酶體 Lysosome 中性紅 541/640: 微偏堿性, 可標記溶酶體等酸性器官 為非特異性 AO : LysoTracker Green DND-26 504/511, 染活細胞 LysoTracker Blue LysoTracker Red 3)內(nèi)質(zhì)網(wǎng) Endoplasmic Reticulum DiOC6 48

12、4/500: 非特異性, 較高濃度標記內(nèi)質(zhì)網(wǎng), 較低濃度標記線粒體 4)高爾基體 Golgi apparatus NBD C6-ceramie 466/536, 可染活或死細胞,激光掃描共焦顯微鏡應用,細胞器的單克隆抗體 5)細胞核 PI propidium iodide 536/617 DNA/RNA 死細胞 碘化丙啶 EB ethidium bromide 518/617 DNA/RNA 死細胞 Hochest 33342 352/461 DNA A-T 活細胞 Hochest 33258 352/461 DNA A-T 活細胞 DAPI 358/461 DNA A-T 半通透細胞 Chr

13、omomycin A3 450/470 DNA G-C AO 500/526 DNA 活細胞 560/650 RNA TOTO-1 514/533 DNA 死細胞 SYTO1116 2024 488/ 520 活細胞 SYTO1116 2024 521/ 556 活細胞 SYTO 17 621/634 活細胞,3. GFP 綠色熒光蛋白 GFP的的發(fā)現(xiàn)：60年代，Shimomura等首先從水母中分離出一種水母發(fā)光蛋白(aequoren)，該蛋白與鈣和腸腔素結(jié)合后可產(chǎn)生藍色熒光。然而水母整體幾提取的顆粒都呈綠色，后經(jīng)證實在水母體內(nèi)還存在另外一種發(fā)光蛋白即綠色熒光蛋白 GFP, 后經(jīng)研究表明，在水

14、母體內(nèi)Ca2+和腸腔素與水母發(fā)光蛋白結(jié)合后，水母發(fā)光蛋白產(chǎn)生藍色熒光，GFP在藍光的激發(fā)下，產(chǎn)生綠色熒光 。 將外源基因與GFP DNA 相連, GFP可作為外源基因的報告基因?qū)崟r監(jiān)測外源基因的表達.,激光掃描共焦顯微鏡應用,激光掃描共焦顯微鏡應用,GFP主要應用: 對活細胞中的蛋白質(zhì)進行準確定位及動態(tài)觀察 可實時原位跟蹤特定蛋白在細胞生長、分裂、分化過程中或外界刺激因子的作用下的時空表達, 如某種轉(zhuǎn)錄因子的核轉(zhuǎn)位、蛋白激酶C的膜轉(zhuǎn)位等。 GFP基因與分泌蛋白基因連接后轉(zhuǎn)染細胞, 可動態(tài)觀察 該分泌蛋白分泌到細胞外的過程 GFP基因與定位于某一細胞器特殊蛋白基因相連,就能顯 示活細胞中細胞核、

15、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線粒體等細胞器的結(jié)構(gòu)及病理過程 可用于觀察分子的運動（FRAP） 蛋白之間的相互作用（FRET）,激光掃描共焦顯微鏡應用,三.動態(tài)測量 Physiology:細胞內(nèi)離子動態(tài)變化測量 1).游離Ca2+測量 檢測游離Ca2+變化熒光探針的原理：這類探針多為Ca2+螯合劑，不與Ca2+結(jié)合時不發(fā)熒光，通常也不能進入細胞膜，只有與乙酰甲酯AM相連方可進入細胞內(nèi)，被細胞內(nèi)酯酶水解后并與胞內(nèi)游離鈣結(jié)合后發(fā)出熒光。Kd值為Ca2+解離常數(shù)，表明檢測Ca2+濃度的范圍:0.1xKd-10 xkd, Kd和很多因素有關(guān)，如pH、 Mg2+、與蛋白的結(jié)合、溫度等。細胞內(nèi)生理Ca2+濃度值(10

16、-100n M)，細胞內(nèi)Ca2+超載濃度值（基礎(chǔ)Ca2+濃度的10倍左右）,熒光探針 激發(fā)波長 發(fā)射波長 Kd FLuo3-AM, K+, dextran 506nm 525nm 390nM Fluo4 506nm 525nm Calcium Green-1 507nm 530nm 190nM Calcium Green-2 507nm 535nm 550nM Fura red 420/480nm 637nm 140nM Oregon Green 488 494nm 520nm 20,000nM Calcium Crimson 583nm 602nm 328nM Indo-1 356nm 40

17、5/458nm 230nM Fura-2 340/380 476nm 145nM,激光掃描共焦顯微鏡應用,程序化測量：用timelapse中的編程按鈕可進行不同時間序列的掃描測 量。 F/F=(F-Fbase)/(Fbase-FBG) Ca2+濃度絕對測量 1）單波長公式法 Fluo3: 530nm Kd=450nM Ca2+I =Kd(F-Fmin)/(Fmax-F) Fmin: 細胞內(nèi)無鈣時的熒光強度( MnCl2) Fmax：細胞內(nèi)鈣飽和時的熒光強度(A23187) 測量時切記細胞內(nèi)靜息Ca2+濃度的相對熒光強度值不能太低（F值不低于40）,激光掃描共焦顯微鏡應用,細胞內(nèi)生理Ca2+濃度

18、值（10-8 -10-7 M） 細胞內(nèi)Ca2+超載濃度值（基礎(chǔ)Ca2+濃度的10倍左右） 2）標準曲線法 根據(jù)儀器條件和負載條件，以不同Ca2+濃度的Buffer(EGTA- Ca2+)做標準曲線，橫軸為Ca2+濃度，縱軸為熒光強度 3）比例熒光的測量 .雙波長(比例熒光：ratio) Indo1(360, 420/480), fura2(340/380, 440) Ca2+I =Kd(R-Rmin)/(Rmax-R)Ff2/Fs2,激光掃描共焦顯微鏡應用,激光掃描共焦顯微鏡應用,快速Ca2+變化的測量 1.改變掃描速度 2.采用雙向掃描 3.減少采樣點數(shù)(犧牲空間分辨率） 4.采用線掃描(x

19、t),細胞器的Ca2+測量 1.線粒體內(nèi)游離Ca2+測量 Fluo-3 + TMRM(線粒體熒光探針，紅色） 2. 特異定位的重組水母發(fā)光蛋白 水母發(fā)光蛋白與 Ca2+結(jié)合后發(fā)藍光 用含有水母發(fā)光蛋白和含有特定細胞器蛋白的表達載體轉(zhuǎn)染細胞，可測定亞細胞器內(nèi)的游離Ca2+變化 目前已商品化的探針可檢測：線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細胞核內(nèi)的游離Ca2+，因生物發(fā)光很弱不能使用Confocal檢測,激光掃描共焦顯微鏡應用,細胞內(nèi)游離Ca2+測量的應用 鈣的特性 1細胞內(nèi)外的電化學梯度103-104倍 2細胞膜滲透性稍有改變或鈣庫釋放稍有增加，導致 胞內(nèi)鈣明顯升高 3細胞內(nèi)鈣為細胞激活“開關(guān)” 細胞內(nèi)鈣的生理作

20、用 1肌肉的興奮收縮-收縮偶聯(lián) 2神經(jīng)遞質(zhì)的釋放 3學習記憶的增強 4卵子受精 5細胞分裂和再生 6細胞調(diào)亡 7細胞間通訊,激光掃描共焦顯微鏡應用,8細胞信號傳導 9. DNA合成 10. 基因表達 細胞內(nèi)鈣超載與疾病 1高血壓、腦缺血、心臟病、內(nèi)分泌病胞內(nèi)鈣濃度異常 2糖尿病、風濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化病胞內(nèi)鈣濃度增高 3人體缺鈣骨鈣大量丟失，神經(jīng)細胞的鈣濃度增高 4老化和老年性癡呆-神經(jīng)細胞內(nèi)鈣濃度增高 細胞內(nèi)生理Ca2+濃度值（10-8 -10-7 M） 細胞內(nèi)Ca2+超載濃度值（基礎(chǔ)Ca2+濃度的10倍左右）,激光掃描共焦顯微鏡應用,電刺激引起骨骼肌 細胞的Ca2+振蕩,激光掃描共焦顯微

21、鏡應用,激光掃描共焦顯微鏡應用,pH值的檢測： BCECF-AM 490nm 530nm 6.5-7.5 Snarf-1-AM 488nm 580/640nm 7.0-8.0,自由基的檢測 熒光探針：H2DCF-DA（504nm/529nm） 2-氫，2氯熒光素乙酰乙酸鹽 胞外H2DCF-DA 擴散入細胞內(nèi) 酯酶脫乙酰 DCF-H(不熒發(fā)光） DCF（發(fā)熒光） *樣品不能在鏡下用汞燈照射及觀察 Dihydrorhodamine 123（507nm/529nm） H2rhod123 被動擴散入細胞內(nèi) 在細胞內(nèi)被氧化成rod123（發(fā)光）,激光掃描共焦顯微鏡應用,激光掃描共焦顯微鏡應用,藥物進入細胞的動態(tài)過程及定位分布 xyzt 掃描,激光掃描共焦顯微鏡應用,四. 膜電位的測量 標記膜電位探針(慢反應）： JC1 510nm 530/590nm Dioc5(3) 548