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1、,體內(nèi)藥物分析,Biopharmaceutical analysis,體內(nèi)藥物分析概述,一、體內(nèi)藥物分析的定義 研究生物機(jī)體中藥物及其代謝物和內(nèi)源性物質(zhì)的質(zhì)和量變化規(guī)律的分析方法學(xué)。 藥物分析, 法醫(yī)鑒定, 毒物分析,二、體內(nèi)藥物分析的意義,(一)在新藥評(píng)價(jià)和開(kāi)發(fā)中的意義 1全面質(zhì)量控制 (毒奶粉事件) 藥品三原則: 安全,合理和有效 2新藥報(bào)批 3為設(shè)計(jì)新藥提供信息 從代謝產(chǎn)物中開(kāi)發(fā)新藥(保泰松和羥基保泰松) 前藥設(shè)計(jì) 新劑型的研究,緩控釋、經(jīng)皮制劑等 以上內(nèi)容必須通過(guò)測(cè)定體內(nèi)藥物濃度得以解決,1血藥濃度與藥理作用 思考題:劑量增加, 藥效是否成正比增加?,(二)臨床合理用藥中的意義,2.
2、影響血藥濃度的因素,(1)機(jī)體因素 a生理因素: 年齡、性別、生理狀況(妊娠期) b病理因素(胃腸道、肝臟、腎臟) c遺傳因素(乙?;D(zhuǎn)移酶代謝異煙肼、乙醇脫氫酶) (2)藥物因素 a劑型因素(生物利用度問(wèn)題) b藥物合并使用(酶抑、酶促) c環(huán)境因素(環(huán)境污染、食品、個(gè)人精神狀態(tài)),分析目標(biāo),藥物在體內(nèi)的某些代謝產(chǎn)物常具有一定的生理活性,它們?cè)隗w內(nèi)的變化規(guī)律對(duì)母體藥物的藥理學(xué)與毒理學(xué)評(píng)價(jià)特別重要.,機(jī)體內(nèi)源性生物活性物質(zhì)往往參與機(jī)體重要的生理過(guò)程,其變化規(guī)律的異常改變也與某些疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān),母藥,藥物特有代謝產(chǎn)物,體內(nèi)內(nèi)源性生物活性物質(zhì),三、體內(nèi)藥物分析的對(duì)象,Company Log
3、o,人,動(dòng)物,鼠,兔,犬,大鼠,小鼠,男,女,等等,猴,猩猩,都是一些志愿者,須動(dòng)物管理與使用委員會(huì)同意,Company Logo,分析對(duì)象,Company Logo,藥物在體內(nèi)的形態(tài),游離型代謝產(chǎn)物,游離型原藥,結(jié)合型原藥,結(jié)合型代謝產(chǎn)物,情形極為復(fù)雜,綴合物,分子間力結(jié)合,化學(xué)共價(jià)結(jié)合,稱(chēng)為,兩類(lèi),四、體內(nèi)藥物分析的特點(diǎn),1干擾雜質(zhì)多(內(nèi)源性物質(zhì), 分離純化) 2樣品濃度低(富集,凈化) 3取樣量少 4工作量大 5時(shí)間短 6有一定設(shè)備,五、體內(nèi)藥物分析方法,1.色譜分析法:TLC、GC、HPLC、HPCE 2.免疫分析法:放射免疫分析法、酶免疫分析法、熒光免疫分析法等 3.生物學(xué)方法:微生
4、物學(xué)方法用于抗生素類(lèi)藥物的體內(nèi)分析,如生物利用度,生物等效性或臨床TDM等體內(nèi)樣品測(cè)定,12,第一節(jié) 常用體內(nèi)樣品的制備與貯藏,一、生物樣品的采集與貯藏 體內(nèi)藥物分析常用的分析品種有血液、尿液、唾液,也可用乳汁、淚液、腦脊液、膽汁等。,(一)樣品的采集,1血樣 血樣濃度與作用點(diǎn)的濃度密切相關(guān),可以反映靶器官的濃度。,血細(xì)胞,血漿(plasma),血小板,血清(serum),血細(xì)胞,測(cè)定血樣中平均分布于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的藥濃,抗凝,自然,全血,血液,2尿樣,目的:藥物劑量回收,藥物清除,藥物代謝和生物利用度 特點(diǎn):濃度高,易于收集,體內(nèi)代謝研究,應(yīng)水解分 離 優(yōu)點(diǎn):易得,屬非損傷性取樣,樣品量大;
5、尿中藥物濃度高,含有綴合物或代謝物,是研究代謝物結(jié)構(gòu)的首選樣品;蛋白含量極低,不需去蛋白處理。 缺點(diǎn): 與血藥濃度不相關(guān),難以反映藥物作用過(guò)程;受腎功能、pH影響;難以定時(shí)定量取樣,易污染;所含成分復(fù)雜,已知其中有紫外吸收的化合物就達(dá)數(shù)十種。,3唾液,唾液是無(wú)損傷性采樣,易采集。 一些藥物的唾液藥濃(S)與血漿游離藥濃(P)密切相關(guān),因此,在TDM中可利用測(cè)定S代替P監(jiān)測(cè);唾液樣品也可用于藥代動(dòng)力學(xué)研究。,優(yōu)點(diǎn):不受時(shí)間和地點(diǎn)的限制,可反復(fù)采集,采集時(shí)無(wú)痛苦、無(wú)感染危險(xiǎn);唾液成分比血液、尿液簡(jiǎn)單,提取方便,有時(shí)可直接上樣測(cè)定;有些唾液中藥物濃度可以反映血漿中游離型藥物濃度。,16,缺點(diǎn): 唾液
6、是各腺體分泌的的混合液體,其組成發(fā)生經(jīng)時(shí)變動(dòng)。 S/P只有少數(shù)藥物是恒定值。 蛋白結(jié)合率較高的藥物,藥物在唾液中的濃度低。 對(duì)有些患者(昏迷)不能采集唾液樣品。,(二)樣品的貯藏,1血樣(血漿、血清)及時(shí)分離冷藏, -70加入穩(wěn)定 劑NaF 2尿樣 尿中水、無(wú)機(jī)鹽、尿素等細(xì)菌的生長(zhǎng), 4保存 加入防腐劑 a1%甲苯 b飽和氯仿 cpH改變 3唾液:同血樣,18,第二節(jié) 生物樣品的預(yù)處理與制備,30%以上工作和費(fèi)用用在樣品前處理上,二、生物樣品的預(yù)處理,(一)預(yù)處理的目的 將藥物從綴合物(尿)或結(jié)合物中釋放出來(lái),以測(cè)定藥物的總濃度 將微量藥物從復(fù)雜的介質(zhì)中純化、富集出來(lái)(分離濃縮) 防止分析儀器
7、的污染,提高測(cè)定靈敏度和選擇性等(出現(xiàn)渾濁和沉淀,雜質(zhì)多,與試劑起反應(yīng),影響色譜柱壽命),(二)處理方法選擇的一般原則,1藥物理化性質(zhì) pKa 親脂性 揮發(fā)性 溶解度 光譜特征 穩(wěn)定性 2濃度范圍 靈敏的方法 3測(cè)定的目的 定性 定量 母體 代謝 4生物樣品的種類(lèi) 5樣品處理與分析方法的選擇 專(zhuān)一性 靈敏性,處理步驟與方法,去除蛋白質(zhì)方法,分離與富集方法,微透析技術(shù),綴合物水解,化學(xué)衍生化,萃取,如何進(jìn)行?,常用體內(nèi)樣品預(yù)處理方法,Company Logo,有機(jī)破壞 (硝酸-高氯酸消化),溶解劑法 (硝酸-高氯酸消化),常用體內(nèi)樣品預(yù)處理方法,(三)生物樣品去蛋白處理,目的: 去除蛋白質(zhì)可使結(jié)
8、合型的藥物釋放出來(lái),以便測(cè)定藥物的總濃度;去除蛋白質(zhì)也可預(yù)防提取過(guò)程中蛋白質(zhì)發(fā)泡,減少乳化的形成,以及可以保護(hù)儀器性能,延長(zhǎng)使用期限,1加入與水能混溶的有機(jī)溶劑及中性鹽 甲醇 乙腈 甲醇1:2 乙腈1:1.5 (NH4)2SO4 NaCl 2加入酸性沉淀劑 三氯醋酸 高氯酸 苦味酸等 使蛋白質(zhì)分子的陽(yáng)離子形成不溶性鹽而,pH低于等電點(diǎn),3組織酶消化法 加入酶使蛋白質(zhì)水解 優(yōu)點(diǎn):平衡條件下進(jìn)行,可避免反應(yīng)和降解 可改善對(duì)蛋白結(jié)合率強(qiáng)的藥物的回收率 不產(chǎn)生乳化 4其他 加熱 超濾,(四)生物樣品綴合物水解,1酸水解 : 0.1mol/L HCl,100,30min, 條件較劇烈,易致藥物分解,空白
9、值也高。 2酶水解:葡萄糖醛酸苷酶或硫酸酯酶,也可用二者的混和物。一般在pH4.5-7,37數(shù)小時(shí),條件溫和,選擇性強(qiáng),但費(fèi)用較高。 3溶劑解:綴合物(主要是硫酸酯)往往可通過(guò)加入的溶劑在萃取過(guò)程中被分解。,為測(cè)定尿液中藥物總量,要將綴合物水解:,Company Logo,是以多孔半透膜(超濾膜)作為分離介質(zhì)的一種膜分離技術(shù),選用不同的孔徑的不對(duì)稱(chēng)膜,即可按照分子量大小進(jìn)行分離,適合TDM血樣分析,Therapeutic drug monitoring,(五)超濾分離法,why?,某些藥物或者代謝產(chǎn)物極性大,揮發(fā)性低,或者對(duì)檢測(cè)器不夠靈敏,難以滿(mǎn)足常規(guī)HPLC及GC檢測(cè)的需要,因此進(jìn)行衍生,H
10、ow for GC?,硅烷化,?;?烷基化,不對(duì)稱(chēng)化,(六)化學(xué)衍生法,Company Logo,why?,某些藥物或者代謝產(chǎn)物極性大,揮發(fā)性低,或者對(duì)檢測(cè)器不夠靈敏,難以滿(mǎn)足常規(guī)HPLC及GC檢測(cè)的需要,因此進(jìn)行衍生,How for LC?,UV,FL,非對(duì)映衍生化,31,(五)分離、純化與濃集,有差別才有可能分離!,生物樣品含有大量可影響測(cè)定的內(nèi)源性雜質(zhì),加上服用的藥物、代謝物、同時(shí)服用的其他藥物,組成一個(gè)極其復(fù)雜的混合物。,如何將微量的藥物從如此復(fù)雜的混合物中分離出來(lái)?,生物樣品的萃取,優(yōu)點(diǎn):與雜質(zhì)分離簡(jiǎn)便 濃集 提取率高,1、液液萃取法 原理:多數(shù)藥物是親脂性的,在適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑中的溶
11、解度大于在水相中的溶解度,而生物樣品中的大多數(shù)內(nèi)源性雜質(zhì)是強(qiáng)極性的水溶性物質(zhì)(差別)。因而用有機(jī)溶劑萃取一次即可除去大部分雜質(zhì),從大量的樣品中提取藥物經(jīng)濃集后測(cè)定。,33,采用LLE要考慮的幾個(gè)問(wèn)題,(1)溶劑的選擇與純度要求 純度AR以上 了解藥物與溶劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)與性質(zhì),按相似相溶原則選用對(duì)藥物的未電離分子可溶,而對(duì)電離形式的分子不溶(光譜分析法)沸點(diǎn)低、易揮發(fā)、濃集與水不相混溶無(wú)毒,不易燃燒不易形成乳化(氯仿易乳化,毒性大)具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性和惰性不影響紫外測(cè)定 毒性大的盡量不用,34,(3)水相的PH值 主要由藥物的pKa決定!,(2)有機(jī)溶劑相和水相的體積比 11或21 由實(shí)際情況決
12、定,文獻(xiàn)中有的101以上,生物樣品一般多在堿性下提?。?35,由于血藥濃度較低,提取時(shí)需濃集 傳統(tǒng)的濃集方法主要有兩種:一種是在末次提取時(shí)加入的提取液盡量少,使被測(cè)組分提取到小體積溶劑中,然后直接吸出適量供測(cè)定。 另一種是揮去提取溶劑后,再用少量適合的溶劑溶解后測(cè)定。,36,衡量提取方法優(yōu)劣的一個(gè)重要指標(biāo)就是提取回收率,它是指藥物從生物樣品中被分離出來(lái)用于測(cè)定的比例,一般應(yīng)高于60%,-乙酸乙酯、叔丁基甲基醚可用于80%藥物的萃取,37,文獻(xiàn)上常提到的LLE的缺點(diǎn),傳統(tǒng)萃取方式回收率低、樣品用量大、繁瑣費(fèi)時(shí)、溶劑用量大、溶劑毒性大、易乳化、不能自動(dòng)化操作,38,關(guān)于固相萃取小柱: a.常見(jiàn)的固
13、相萃取柱分為三部分:醫(yī)用聚丙烯柱管,多孔聚丙烯篩板(20m)和填料(多為40-60m,80-100m)。,b.常用規(guī)格:100mg/1ml,200mg/3ml,500mg/3ml,1g/6ml等。以100mg/1ml為例: 其中100mg為填料的質(zhì)量,1ml是空柱管的體積。 c.一次性使用:為避免交叉污染,保證檢測(cè)可靠性,SPE柱通常是一次性使用的。,2.固相萃取(Solid Phase Extraction,簡(jiǎn)稱(chēng)SPE)法,39,SPE填料,親脂型:大孔吸附樹(shù)脂,親脂性鍵合硅膠。 親水型:硅膠、硅藻土。 離子交換:苯磺酸基,羧基等。,40,固相萃取操作一般有五步: 活化甲醇潤(rùn)濕小柱,活化填料
14、,除去雜質(zhì)并創(chuàng)造一定的溶劑環(huán)境。 平衡水或適當(dāng)緩沖液沖洗小柱。 上樣將樣品用一定的溶劑溶解,轉(zhuǎn)移入柱并使組分保留在柱上。棄去廢液 淋洗水或緩沖液最大程度除去干擾物。 洗脫用小體積的溶劑將被測(cè)物質(zhì)洗脫下來(lái)并收集。,親脂性鍵合相硅膠SPE柱的實(shí)驗(yàn)步驟:,41,42,親水型填料,用作SPE的親水型填料有硅藻土、硅膠、棉纖維等,其原理為分配作用。填料為支持物,水基質(zhì)中極性強(qiáng)的成分與填料結(jié)合牢固,流動(dòng)相為與水不相混溶的有機(jī)溶劑,較親脂的藥物易分布于流動(dòng)相,從而達(dá)到萃取的目的。,親水型填料SPE有較高的萃取回收率(大于80%),但洗脫劑用量較大(一般大于5ml),無(wú)濃集作用,萃取液較干凈。,43,SPE優(yōu)
15、點(diǎn):1、不發(fā)生乳化;2、適應(yīng)的極性范圍較廣;3、提取效率高;4、方便快速;5、溶劑用量少;6、易于自動(dòng)化;7、室溫下操作,尤其適于處理?yè)]發(fā)性及對(duì)熱不穩(wěn)定的藥物。 目前,商品化固相提取小柱(cartridge)的應(yīng)用已比較普遍。,最大的缺點(diǎn): 貴 20多元/支,44,三種方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較,第三節(jié) 體內(nèi)藥物分析方法的建立與評(píng)價(jià),一、分析方法,根據(jù)藥物理化性質(zhì),結(jié)構(gòu)特征,藥物濃度,干擾成分大小,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?二、分析方法的設(shè)計(jì)依據(jù),方法的建立,原始方法改進(jìn)創(chuàng)新 創(chuàng)立方法,1做好文獻(xiàn)總結(jié) 2充分了解藥物特征及體內(nèi)狀況 pH、親脂性、溶解度、極性、光譜特征、藥動(dòng)學(xué)參數(shù)、體內(nèi)代謝情況 3明確測(cè)定目的、要求 目
16、的 4結(jié)合實(shí)驗(yàn)室條件 設(shè)備條件 預(yù)處理方法,藥濃監(jiān)測(cè) 藥代動(dòng)力學(xué)研究 母體藥物和代謝物,三、分析方法的建立,方法的驗(yàn)證,特異性,標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)與定量范圍,定量下限,準(zhǔn)確度與精密度,穩(wěn)定性,回收率,分析過(guò)程的質(zhì)量控制,未知樣品濃度超出范圍的處理,相關(guān)物質(zhì)測(cè)定,其它方法驗(yàn)證,四、體內(nèi)樣品分析方法與方法驗(yàn)證,(一)、特異性 所測(cè)的物質(zhì)是原型藥物或特定的活性代謝物,內(nèi)源性物質(zhì)和響應(yīng)的其他代謝物及其他藥物不影響樣品的測(cè)定。,Company Logo,(二)、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)與線(xiàn)性范圍,Y=9.56610-2X+6.15310-3 r=0.9995,至少6個(gè)濃度點(diǎn)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 線(xiàn)性范圍必須覆蓋全部待測(cè)濃度,不得外推 最
17、低濃度點(diǎn)偏差在20% 其余濃度點(diǎn)的偏差在 15%。,四、體內(nèi)樣品分析方法與方法驗(yàn)證,四、分析方法的評(píng)價(jià),可行性和可靠性 1準(zhǔn)確度 accuracy 測(cè)定結(jié)果與真實(shí)性的差異 用回收率表示 接近100% 相對(duì)恒定,絕對(duì)回收率 絕對(duì)回收率=提取回收率=萃取回收率 測(cè)定血漿樣品中藥物濃度/相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液=絕對(duì)回收率 考慮3個(gè)濃度(高、中、低) 分布在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)成上、中、下 一般要求絕對(duì)回收率在70% 一般方法HPLC內(nèi)標(biāo) 內(nèi)標(biāo)法時(shí)注意:藥物與內(nèi)標(biāo)用各自外標(biāo)法測(cè)定回收率應(yīng)相近,差值10%,相對(duì)回收率 相對(duì)回收率=方法學(xué)回收率 藥物系列濃度+血樣標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 取高、中、低三濃度加入到空白血漿中,處理后測(cè)定,與加入標(biāo)準(zhǔn)量相比,得方法回收率,測(cè)定值15%,定量限20%,2精密度precision,標(biāo)準(zhǔn)差SD 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)性偏差 RSD不大于15%,定量限不大于20% 日間精密度日內(nèi)精密度,3靈敏度(sensitivity) 檢測(cè)的最小量,(1)檢測(cè)限(LOD) 從背景中檢測(cè)到的最小藥物濃度:S/N3的絕對(duì)量 LOD=3N/S (N噪間 S被測(cè)物信號(hào)/單位重量) N=1mm 取2gml樣品,20l進(jìn)樣 峰度30mm LOD=4ng,(2)定量限(LOQ) 在一定精密度和準(zhǔn)確度前提下求得最低檢測(cè)量,通常以標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)最低點(diǎn)作為一定量限,也可S/N=10作為定量限
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